專利名稱：暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法
技術領域：
本發明涉及菌根食用真菌半人工栽培技術領域，尤其是暗褐網柄牛肝菌田間、圃地的半人工栽培方法。
背景技術：
暗褐網柄牛肝菌(尸似e/w/ws /wr^/^o^As)，味道鮮美，營養價值豐富，有較好的食用及藥用價值，是一種較好的保建食品，深受產地消費者喜愛。分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國、巴西、墨西哥、澳大利亞，新西蘭(Maria2007, Bandala2004, Watling2001， Barbara 1987， Heinemann1982 )。在我國分布于云南、廣西和海南等地(臧穆等1986，2006;楊祝良和臧穆2003)。目前市場上銷售的暗褐網柄牛肝菌均采自野生自然生長。由于受氣候季節條件的限制產量有限。加上不注重對野生自然資源的保護，人為過度采摘導致數量越來越少。
一般認為牛肝菌均為菌根食用菌。許多菌根食用菌半人工模擬栽培的過程相當長，需要4 5年，甚至6 7年才能完成(弓明欽等2006)。在實驗室條件下5o/w附菌絲在鋸末和麥粒組成的培養基上生長良好，避光條件下培養90天產生具擔孢子的成熟子實體(OhtaA等2003)。目前世界菌根食用栽培最為成功的是黑孢塊菌(7"ter歷e^a;^^or"^7)。在新西蘭，黑孢塊菌人工栽培從種植園的建立到有塊菌子囊果收獲需要6-7年時間(譚著明等2002)。松乳菇oWicioms)半人工栽培，菌根苗合成需5 8個月時間，用菌根合成苗繼續原地栽培或移植到普通土壤中培養出菇需2 3年時間(譚著明等2000)。采用合成的褐環粘蓋牛肝菌(5"w77"s "te^)濕地松菌根苗密植于經過消毒的圍地實現人工栽培,菌根苗栽植至褐環粘蓋牛肝菌子實體生長需12個月時間(應國華等2007)。
綜上所述，目前僅有少數種類的菌根食用菌可進行半人工模擬栽培，或處于實驗室栽培研究狀態，暗褐網柄牛肝菌半人工栽培未見報道。參考文獻
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發明內容
本發明的目的是提供一種簡便、快捷的半人工的暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法， 利用該方法可實現暗褐網柄牛肝菌產業化，極大地滿足人們對該種美味食用菌的需求，緩 解對野生自然資源的壓力，保護生態。
本發明的技術方案為暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法按以下步驟進行
1、 鳳凰木(Z)e/o"k"^"(Boj.)Raf.)樹幼苗培育及移栽
1) 播種催芽鳳凰木種子采自云南西雙版納熱帶花卉園。挑選無病蟲害、飽滿、顆
粒均勻的種子在溫水中浸泡24小時，然后播種于沙床中催芽，保持沙床濕潤培養種子萌
發；
2) 幼苗培育種子萌發、真葉展開，當苗高5 cm長出第一輪側根時將幼苗移栽入盛 有營養土基質的育苗袋中，自然光照，保持育苗袋中土壤基質濕潤培養幼苗生長；
3) 幼苗移栽雨季時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗根部 的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長；
2. 菠蘿蜜(^ tocarpz^/ eferap/^〃iAy Lam.)樹幼苗培育及移栽
1)幼苗培育菠蘿蜜種子釆自云南西雙版納。挑選無病蟲害、飽滿、顆粒均勻的種子播種于袋裝的營養土中，保持土濕潤培養種子萌發及幼苗生長；
2)幼苗移栽雨季來臨時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗 根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長；
3. 柚子(C"n^ g raw^fo L.)樹嫁接苗培育及移栽
1) 播種催芽挑選無病蟲害、飽滿、顆粒均勻的柚子樹種子在溫水中浸泡24小時， 然后播種于沙床中催芽，保持沙床濕潤培養種子萌發；
2) 砧木苗培育種子萌發、真葉展開，當苗高5 cm長出第一輪側根時將幼苗移栽入 盛有營養土基質的育苗袋中，自然光照，保持育苗袋中土壤基質濕潤培養砧木苗生長；
3) 幼苗嫁接砧木苗苗齡一年時，選取好的柚子品種如冬試早的芽嫁接于砧木苗上， 芽點萌發后切除砧木樹桿，使嫁接的萌發的芽旺盛生長。
4) 幼苗移栽雨季時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗根部 的土壤少脫落，將嫁接苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長；
4. 暗褐網柄牛肝菌固體菌種培養用以下培養基培養暗褐網柄牛肝菌固體菌種，固 體菌種的制備由下述原料及方法配制而成
1)原料組成
橡膠木鋸木屑或其他雜木屑 10. 0 30.0 kg
谷粒或小麥 2. 0 10.0 kg
蔗糖 50. 0 200.0 g
MgS04 10. 0 30.0 g
KH2P04 10.0 30.0g
pH 4.0 6.0
2) 配制方法將谷粒或小麥稱量后放入容器中，加水浸泡10 12h，然后濾除多余7jC 份待用；橡膠木鋸木屑或雜木屑料預濕，然后加入浸泡濾水后的谷粒或小麥，將蔗糖、 MgS04 、 KH2P04用適量的水溶解后噴灑入鋸木屑料堆中，調料堆含水量60.0%，最后將各種 原料均勻拌勻混合，培養基pH 4.0 6.0，即得固體培養基；將配制好的固體培養基分裝 于聚丙烯菌種袋中，12《C滅菌60分鐘，待冷卻后備用；
3) 接種培養將預先培養好的暗褐網柄牛肝菌液體菌種接種于步驟2)中的滅菌的袋 裝培養基質中，接種后將培養袋置于28 3(TC的培養室中暗光培養40天 60天，菌絲體 長滿培養袋，即得固體菌種；5.接種鳳凰木、菠蘿蜜幼樹及柚子樹的根系培養子實體生長
1) 接種鳳凰木或菠蘿蜜幼樹樹齡達一年以上，柚子樹樹齡達一年以上或成齡樹，在雨季田間、圃地的土壤潮濕時或旱季節對田間、圃地土壤澆透水后，挖開菠蘿蜜、鳳凰木及柚子樹的根圈部土壤，露出根系的主、側根；然后將預先培養好的固體菌種掰成團塊狀，接種在根系主、側根或單純接種于側根上，每株樹接菌種量50g-500g，接種時菌種盡量與植物的根系緊密接觸，接種完后在接種部位覆土恢復原狀；
2) 培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種后4個月至IO個月菠蘿蜜、鳳凰木及柚子樹樹根部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟。
本發明暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法，為菌根食用菌半人工栽培方法的首創，其特點及優點如下
① 方法簡便、易行不用合成菌根苗，直接用純培養固體菌種接種田間栽培的宿主樹幼樹根系，菌種與宿主樹在田間自然形成共生關系并生長子實體。與一般菌根食用菌(如塊菌、紅汁浮菇)半人工栽培相比較，省去了先人工合成菌根苗，然后再將菌根苗移栽于田間的過程，簡化了栽培環節。
② 固體菌種培養基成份簡單，培養方法簡便，培養時間短培養基配方中只用了簡單的碳氮源(谷粒、小麥、蔗糖)， 一般的無機鹽(MgS04、 KH2P04 )及橡膠木或其他雜木
的鋸木屑即可進行固體菌種培養；用聚丙烯塑料薄膜袋、 一般培養室(可加溫)可進行固
體菌種培養；培養需60天菌絲即長滿培養袋。
③ 接種至出菇的時間短與其他菌根食用菌半人工栽培(如塊菌)從種植園的建立至子實體生長需要6-7年時間相比較，本發明暗褐網柄牛肝菌半人工栽培從接種至子實體生長僅需4個月至10個月時間，大大縮短了種植園出恭及投產的時間。
④ 經濟作物果實與牛肝菌子實體同時收獲，提高了土地利用率，增加了產值，提高了種植戶收入。
本發明將暗褐網柄牛肝菌固體菌種接種在田間栽培的鳳凰木樹、菠蘿蜜樹等熱帶植華勿根系上培養出菇的方法，適用于將暗褐網柄牛肝菌純培養固體菌種、液體菌種及自然生長子實體產生的孢子接種于其他熱帶經濟作物及熱帶花卉植物的根系上培養出菇。
具體實施例方式
實施例1
1.鳳凰木樹幼苗培育及移栽
71) 播種催芽鳳凰木種子于第一年的ll月采自云南西雙版納熱帶花卉園。挑選無病 蟲害、飽滿、顆粒均勻的種子在溫水中浸泡24小時，然后播種于沙床中芽，保持沙床濕 潤培養種子萌發。
2) 幼苗培育種子萌發、真葉展開，當苗高5 cm長出第一輪側根時將幼苗移栽入盛
有營養土基質的育苗袋中，自然光照，保持育苗袋中土壤基質濕潤培養幼苗生長。
3) 幼苗移栽于來第二年7月雨季時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，
盡量使幼苗根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培 養幼苗生長。
2.暗褐網柄牛肝菌固體菌種培養
用以下培養基培養暗褐網柄牛肝菌固體菌種，固體菌種的制備由下述原料及方法配制而成。
1)原料組成
橡膠木鋸木屑 10. 0 kg
谷粒 2. 0 kg
蔗糖 50. 0 g
MgS04 10. 0 g
KH2P04 10.0g
pH 4.0
2) 配制方法將谷粒稱量放入容器中，加水浸泡10 12h，然后濾除多余水份均勻拌 入橡膠木鋸木屑中，然后將蔗糖、MgS04 、 KH2P04用適量的水溶解后噴灑入鋸木屑料堆，水 的用量以料堆含水量60.0%為準，最后將各種原料均勻混合，培養基自然pH 4.0，得固體 培養基。將配制好的固體培養基分裝于17cmX30cni的聚丙烯塑料膜制成的菌種袋中，每 袋750 ml，裝袋后124。C滅菌60分鐘，冷卻后備用；
3) 接種培養將培養好的暗褐網柄牛肝菌液體菌種接種于步驟2)中的袋裝的培養料 中，接種后將培養袋置于28。C 30。C的培養室中暗光培養50天，菌絲體長滿培養袋，得 固體菌種。
3.固體菌種接種鳳凰木幼樹根系培養子實體生長及種的鑒定 1)接種田間栽培的鳳凰木幼樹根系培養出菇 (1)接種方法于第三年7月雨季到來后田間土壤潮濕，挖開樹齡一年的鳳凰木幼樹的根部土壤，露出根系的側根；然后將固體菌種掰成團塊狀，接種在側根上，每株接入 菌種量150.0g，接種時菌種盡量與樹的側根緊密接觸。
(2)培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種當年的ll月份(接種4個月)鳳 凰木樹下根部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟。接種的次年5月至8 月鳳凰木樹下土壤中共出菇6潮。 2)半人工培養子實體種的鑒定
半人工培養的子實體形態，其特征如下菌蓋黃褐色，黑褐色，5-14cm，蓋中央凸起， 成熟后平展，無裂紋，蓋緣多上翹。蓋肉厚2-6cm，松軟，海綿質，淡黃色，傷后很少呈現 淡藍色。菌孔單孔型，黃色。菌管長1.0-2.0cm，孔口近圓型至多角型，黃色或黑褐色。菌 柄粗壯，基部往往膨大呈臼狀，2-3X6-9cm，幾與菌蓋同色。擔孢子長梨型，長橢圓型， 7.5-13.0umX5.0-7.45um，橄欖綠色。綜上所述，半人工培養的子實體與野生子實體形態特 征一致，可鑒定為同一個種。半人工培養的子實體憑證標本放在中國科學院昆明植物研究 所真菌標本室，編號為HKAS 49706。
實施例2
1. 菠蘿蜜樹幼苗培育及移栽
1) 幼苗培育菠蘿蜜種子于第一年7月采自云南西雙版納。挑選無病蟲害、飽滿、
顆粒均勻的種子播種于袋裝的營養土中，保持土濕潤培養種子萌發及幼苗生長。
2) 幼苗移栽于第二年5月雨季來臨時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，
盡量使幼苗根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培 養幼苗生長。
2. 固體暗褐網柄牛肝菌菌種培養
用以下固體培養基培養暗褐網柄牛肝菌固體菌種，菌種的制備由下述原料及方法配制而成。
原料組成
橡膠木鋸木屑或其他雜木屑 15. 0 kg
小麥 3. 0 kg
蔗糖 100. 0 g
MgS04 15. 0 g
9KH2P04 15.0gpH 5.0
以下配制方法及接種培養同實施例一。3.接種田間栽培的菠蘿蜜樹根系培養子實體生長
1) 接種方法在第二年雨季來臨田間土壤濕透后，挖開樹齡一年的菠蘿蜜樹的根部土壤，露出根系的主、側根；然后將預先培養好的固體菌種掰成團塊狀，接入主、側根部。每株接入菌種150.0 g，接種時菌種盡量與菠蘿蜜樹的主、側根緊密接觸。
2) 培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種后10個月即第三年5月菠蘿蜜樹根
部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟，5月至8月共出菇6潮。
實施例3
1. 柚子樹嫁接苗培育及移栽
1) 播種催芽挑選無病蟲害、飽滿、顆粒均勻的柚子樹種子在溫水中浸泡24小時，然后播種于沙床中催芽，保持沙床濕潤培養種子萌發；
2) 砧木苗培育種子萌發、真葉展開，當苗高5 cm長出第一輪側根時將幼苗移栽入盛有營養土基質的育苗袋中，自然光照，保持育苗袋中土壤基質濕潤培養砧木苗苗生長；
3) 幼苗嫁接砧木苗苗齡一年時，選取冬試早品種的芽嫁接于砧木苗上，芽點萌發后切除砧木樹稍，使嫁接萌發的芽旺盛生長。
4) 幼苗移栽雨季時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長。
2. 固體暗褐網柄牛肝菌菌種培養固體菌種培養基配方及制備方法配制同實施例2。
3. 接種田間栽培的柚子樹根系培養子實體生長
1) 接種方法選成齡柚子樹，在雨季來臨田間土壤濕透后，挖開柚子樹的根部土壤，露出根系的側根；然后將預先培養好的固體菌種掰成團塊狀，接入主、側根部。每株接入菌種150.0 g，接種時菌種盡量與柚子樹的側根緊密接觸。
2) 培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種后IO個月柚子樹根部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟，5月至8月共出菇6潮。
實施例41. 鳳凰木樹幼苗培育及移栽同實施例1
2. 暗褐網柄牛肝菌固體菌種培養
用以下固體培養基培養固體菌種，菌種的制備由下述原料及方法配制而成。
原料組成-.
橡膠木鋸木屑或其他雜木屑 20.0 kg
谷粒 5.0 kg
蔗糖 150.0 g
MgS04 20.0 g
KH2P04 20.0g
pH 6.0
以下配制方法及接種培養同實施例1。
3.固體菌種接種鳳凰木幼樹根系培養子實體生長
1) 接種方法在第二年4月的旱季對鳳凰木樹根部土壤澆透水，挖開樹齡一年的鳳 凰木幼樹的根部土壤，露出根系的側根；然后將固體菌種掰成團塊狀，接種在側根上。每 株接入菌種量250g，接種時菌種盡量與樹的側根緊密接觸，并在接種部蓋膜保持土壤濕潤。
2) 培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種的當年的ll月份(接種4個月)鳳 凰木樹下根部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟。接種的次年5月至8 月鳳凰木樹下土壤中共出菇6潮。
實施例5
1. 菠蘿蜜樹幼苗培育及移栽同實施例2
2. 暗褐網柄牛肝菌固體菌種培養
用以下固體培養基培養暗褐網柄牛肝菌固體菌種，固體菌種的制備由下述原料及方法 配制而成。
原料組成
橡膠木鋸木屑或其他雜木屑 30.0 kg
小麥 8.0 kg
蔗糖 200.0 gMsS04 30.0 g
KH2P04 30.0g pH 5.0
以下配制方法及接種培養同實施例一。
3.接種田間栽培的菠蘿蜜樹根系培養子實體生長
1) 接種方法在第二年4月旱季對菠蘿蜜樹根部土壤澆透水，挖開樹齡一年的菠蘿
蜜樹的根部土壤，露出根系的主、側根；然后將預先培養好的固體菌種掰成團塊狀，接入 主、側根部，每株接入菌種500.0g，接種時菌種盡量與菠蘿蜜樹的主、側根緊密接觸，并 在接種部蓋膜保持土壤濕潤。
2) 培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種后10個月(即第三年5月)菠蘿蜜 樹根部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟，5月至8月共出菇6潮。
權利要求
1.暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法，其特征在于按以下步驟進行(1)暗褐網柄牛肝菌固體菌種培養用以下培養基培養暗褐網柄牛肝菌固體菌種，固體菌種的制備由下述原料及方法配制而成1)原料組成橡膠木鋸木屑或其他雜木屑10.0～30.0kg谷粒或小麥 2.0～10.0kg蔗糖50.0～200.gMgSO4 10.0～30.0gKH2PO4 10.0～30.0gpH 4.0～6.02)配制方法將谷粒或小麥稱量后放入容器中，加水浸泡10～12h，然后濾除多余水份待用；橡膠木鋸木屑或雜木屑料預濕，然后加入浸泡濾水后的谷粒或小麥，將蔗糖、MgSO4、KH2PO4用適量的水溶解后噴灑入鋸木屑料堆中，調料堆含水量60％，最后將各種原料均勻拌勻混合，培養基pH 4.0～6.0，即得固體培養基；將配制好的固體培養基分裝于聚丙烯菌種袋中，124℃滅菌60分鐘，待冷卻后備用；3)接種培養將預先培養好的暗褐網柄牛肝菌液體菌種接種于步驟2)中的滅菌的袋裝培養基質中，接種后將培養袋置于28～30℃的培養室中暗光培養40天～60天，菌絲體長滿培養袋，即得固體菌種；(2)接種鳳凰木、菠蘿蜜幼樹及柚子樹的根系培養子實體生長1)接種鳳凰木或菠蘿蜜幼樹樹齡達一年以上，柚子樹樹齡達一年以上或成齡樹，在雨季田間、圃地的土壤潮濕時或旱季節對田間、圃地土壤澆透水后，挖開菠蘿蜜、鳳凰木及柚子樹的根圈部土壤，露出根系的側根；然后將預先培養好的固體菌種掰成團塊狀，接種在根系的側根上，每株樹接菌種量50g-500g，接種時菌種盡量與植物的根系緊密接觸，接種完后在接種部位覆土恢復原狀；2)培養出菇保持接種樹的根部土壤潮濕，接種后4個月至10個月菠蘿蜜、鳳凰木及柚子樹樹根部周圍土壤中即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟。
2、權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法，其特征在于所述的鳳凰木樹幼苗培育及移栽方法為-1) 播種催芽挑選無病蟲害、飽滿、顆粒均勻的鳳凰木種子在溫水中浸泡24小時，然后播種于沙床中催芽，保持沙床濕潤培養種子萌發；2) 幼苗培育種子萌發、真葉展開，當苗高5 cni長出第一輪側根時將幼苗移栽入盛有營養土基質的育苗袋中，自然光照，保持育苗袋中土壤基質濕潤培養幼苗生長；3) 幼苗移栽雨季時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長。
3、權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法，其特征在于所述的菠蘿蜜樹幼苗培育及移栽方法為1) 幼苗培育挑選無病蟲害、飽滿、顆粒均勻的菠蘿蜜種子播種于袋裝的營養土中，保持土濕潤培養種子萌發及幼苗生長；2) 幼苗移栽雨季來臨時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長。
4、權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌半人工栽培方法，其特征在于所述的柚子樹嫁接苗培育及移栽方法為1) 播種催芽挑選無病蟲害、飽滿、顆粒均勻的柚子樹種子在溫水中浸泡24小時，然后播種于沙床中催芽，保持沙床濕潤培養種子萌發；2) 砧木苗培育種子萌發、真葉展開，當苗高5 on長出第一輪側根時將幼苗移栽入盛有營養土基質的育苗袋中，自然光照，保持育苗袋中土壤基質濕潤培養砧木苗生長；3) 幼苗嫁接砧木苗苗齡一年時，選取好的柚子品種如冬試早的芽片嫁接于砧木苗上，芽點萌發后切除砧木樹稍，使芽點萌發旺盛生長；4) 幼苗移栽雨季時將幼苗移栽入田間，栽苗時脫去塑料薄膜袋，盡量使幼苗根部的土壤少脫落，將苗及營養土一同放入栽培坑中，覆土并澆足定根水，培養幼苗生長。
全文摘要
本發明涉及暗褐網柄牛肝菌的半人工栽培方法。先培養鳳凰木、菠蘿蜜樹幼苗及柚子樹嫁接苗，然后將鳳凰木、菠蘿蜜幼苗及柚子樹嫁接苗移栽于田間，樹齡1年時將暗褐網柄牛肝菌固體菌種接種在鳳凰木、菠蘿蜜幼樹及幼齡或成齡柚子樹的根系上，接種次年鳳凰木、菠蘿蜜樹及柚子樹下即生長暗褐網柄牛肝菌子實體并發育成熟，每100m<sup>2</sup>可產暗褐網柄牛肝菌10kg-80kg以上。利用該方法可快速實現暗褐網柄牛肝菌半人工栽培并快速實現產業化。該種暗褐網柄牛肝菌半人工栽培，方法簡便、省去了人工合成菌根苗過程，出菇時間短，同時收獲經濟作物果實與牛肝菌子實體，實現果、菌雙收，大幅度增加產值。節約了資金及其他相應的栽培成本，提高了土地利用率。
文檔編號A01G1/06GK101669430SQ20091009500
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月24日 優先權日2009年9月24日
發明者何明霞, 靜 劉, 張春霞, 旸 曹, 王文兵, 紀開萍 申請人:云南省熱帶作物科學研究所