專利名稱：：雪菜單倍體育種方法
技術領域：
：本發明涉及植物育種
技術領域：
，尤其涉及一種雪菜單倍體育種方法。
背景技術：
：雪菜屬十字花科蕓苔屬的芥菜種、是分蘗芥的一個變種。雪菜的別名有很多，如安徽、江蘇和浙江等地稱為"雪里蕻"、"九頭芥"，在湖南、湖北等地稱為"排菜"。它是我國長江流域普遍栽培的冬春兩季重要蔬菜，以葉柄和葉片為食用部分，營養價值很高。香氣濃郁、滋味清脆鮮美的東坡肉、雪菜肉絲面、雪菜冬夢、雪菜豆腐、雪菜黃魚就是以雪菜作為主要成份烹制而成的。所謂單倍體育種，即利用花藥培養等方法誘導產生單倍體，并使其單一的染色體各自加倍成對，成為有活力、能正常結實的純合體，從而選育出新的品種，單倍體主要是通過小孢子直接萌發或經過愈傷組織分化成植抹獲得。我國在蕓苔屬作物小孢子培養方面有較多的研究，但對雪菜小孢子懸浮培養方法的優化研究尚未見報導。由于雪菜小孢子懸浮培養胚胎發生頻率較低，繼代技術難度大，難以有效獲得雙單倍體(DH)再生植抹，給抗性育種、品質育種和轉基因研究等應用造成困難。
發明內容本發明提供了一種雪菜單倍體育種方法，該方法解決了雪菜小孢子懸浮培養胚胎發生頻率較低的問題。一種雪菜單倍體育種方法，包括以下步驟a.取雪菜主莖或分枝上的花序，在2~4匸誘導12-24個小時后，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾進行滅菌；b.將滅菌后的花蕾放入NLN-13培養液中，搗碎、過濾，離心后得到小孢子懸浮液；c.將小孢子懸浮液置于3032。C下熱擊處理2~3天后，在常溫下進行黑暗恒溫培養，至肉眼可見胚狀體時，再在常溫下進行黑暗震蕩培養，得到子葉期胚狀體；d.收集子葉期胚狀體，接種至分化培養基，再在組培室中光照培養，分化芽長出后接種至生根培養基，生根、煉苗后移入營養土中培養，得到單倍體植抹；e.用秋水仙堿對單倍體植株的根系進行加倍處理，植抹恢復正常后移入大田進行正常栽培。秋水仙石咸的濃度最好為150~300mg/L，處理時間最好為15~30h。本發明方法在胚狀體誘導過程當中，對花蕾進行了低溫誘導，對小孢子進行熱擊處理與適溫培養，提高了胚狀體發生頻率和胚成活率，其胚成活率高達95%以上。本發明利用秋水仙堿對單倍體植株的根系進行加倍處理，通過篩選秋水仙堿的濃度，其有效加倍率可達80%左右。具體實施方式培養基NLN-13培養基以配置1L培養液為例，需將100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有機物(溶液)、10ml葉酸(溶液)、10mlFe鹽(溶液)、10ml肌醇(溶液)、130g蔑糖、30mg谷胱甘肽、800mg左旋谷氨酰胺、100mg絲氨酸混合，最終pH調節至6.0，過濾滅菌后放于4'C水箱備用。其中大量元素(溶液)、微量元素(溶液)、有機物(溶液)、Fe鹽(溶液)、葉酸(溶液)、肌醇(溶液)中各組分配比如下I.大量元素(溶液)(g/L)m.有機物(溶液)認031.25維生素Bl0.05Ca(N03)2.4H20維生素B60.05MgS04.7H201.25維生素B50.5KH2P041.25生物素0.005II.微量元素(溶液)氨基乙酸0.2H3B030.62IV.葉酸(溶液)100倍(g/L)4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>分化培養基以配置1L培養基為例，將100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有機物(溶液)、10mlFe鹽(溶液)、2mg6-BA(溶液)、20g蔗糖、8.25g瓊脂條、100mg肌醇混合，加熱攪拌均勻，調節pH至6.0，12(TC滅菌20分鐘，冷卻待用。生根培養基以配置1L培養基為例，將100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有機物(溶液)、10mlFe鹽(溶液)、20g蔗糖、8.25g瓊脂條、100mg肌醇混合，加熱攪拌均勻，調節pH至6.0，120。C滅菌20分鐘，冷卻待用。其中大量元素(溶液)、微量元素(溶液)、有機物(溶液)、Fe鹽(溶酉己t匕^口下I.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>分離小孢子采用雪菜優良品種七星雞冠菜作為供體材料，供體植抹生長在15tV10。C(晝/夜)的條件下。(l)在清晨或傍晚，從上述雪菜主莖和分枝上摘取健康的花序，放入4。C低溫冰箱中，低溫誘導24小時，溫度也可調節至2。C,從而把處理時間調整為12小時。(2)在無菌室內，選取上述花序上單核晚期至雙核早期的雪菜花蕾IO個放入培養皿，用5.6。/。NaC10溶液滅菌，放于搖床上震蕩15分鐘后，用4'C無菌水沖洗5次。(3)將上述雪菜花蕾放入小燒杯中，加入少量4。C無菌NLN-13培養液，用玻璃棒輕輕搗碎。(4)將擊碎的雪菜花蕾連同NLN-13培養液用40pm尼龍網過濾，倒入50ml離心管，然后用NLN-13多次沖洗燒杯和玻璃棒，并將其一并倒入離心管中，共約10ml。(5)快速將離心管放入低速離心機進行離心5分鐘，轉速為800r/min,離心完畢后，倒出上清液，力。NLN-13培養液至10ml,再次快速將離心管放入離心機進行離心5分鐘，離心完畢后，倒出上清液，加NLN-13培養液至40ml，然后加入活性碳溶液(以配50ml活性炭溶液為例活性炭lg、瓊脂糖0.125g、用無菌NLN-13溶液定容至50ml,然后分瓶高壓滅菌，滅菌后放入4。C水箱)3-4滴。活性炭主要是為了吸附懸浮液中某些小孢子產生的有毒物質，可以讓小孢子胚狀體更加健康地生長。培育單倍體植物(1)用5ml移液槍吸取4ml上述小孢子懸浮液分裝于十個小培養孤中。放入3032。C恒溫培養箱熱擊處理兩至三天，再移至組培室黑暗恒溫培養，溫度控制在2426。C。(2)當肉眼可見胚狀體時(約一個星期)，將培養皿轉移至搖床繼續震蕩培養(轉速60r/min，24~26°C,黑暗，約兩個星期左右)，得到子葉期胚狀體。(3)收集子葉期胚狀體，轉移至分化培養基繼續在24~26°C、16h光周期下(光照強度約100pmol/m2s1)進行光培養。(4)分化芽長出后接種至生根培養基，待植林發育良好開瓶煉苗2d,然后移入含水量為60%的營養土(體積比為3:1的泥炭土和珍珠巖的混合物)中培養。加倍處理(5)利用美國BD公司的BDFACSCalibur流式細胞儀對所有幼苗新長出的葉片進行倍性分析，如果是單倍體則進行秋水仙堿加倍處理。在幼苗健壯時采用150mg/L秋水仙堿溶液進行根系浸根處理30h,也可以采用300mg/L秋水仙堿溶液進行根系浸根處理15h。(6)雪菜4直株恢復正常后移入大田進行正常栽培管理。胚成活率的檢驗在分離得到小孢子一個星期后，轉移至24。C、16h光照、60r/min條件下振蕩培養至胚狀體轉綠。把已轉綠的子葉期胚狀體，移入分化固體培養基中，在22。C、16h光周期下(光照強度約100pmol/m2s1)光照培養。胚成活率即在分化培養基上可健康萌發生長的胚狀體數與移入培養基的胚狀體總數的比率。本發明的胚狀體成活率達到95%。加倍成功率的檢驗經秋水仙堿處理所獲得的小植林，重新移入含水量為60%的營養土(體積比為3:l的泥炭土和珍珠巖的混合物)，12周后取新長出葉，用美國BD公司的BDFACSCalibur流式細胞分析儀進行倍性檢測，以區分是單倍體、雙單倍體及四倍體等。雙單倍體加倍成功率為檢測所得為雙單倍體的植抹數與所測再生植株總數的比率。本發明的加倍成功率達到80%。權利要求1、一種雪菜單倍體育種方法，包括以下步驟a.取雪菜主莖或分枝上的花序，在2～4℃誘導12～24個小時后，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾進行滅菌；b.將滅菌后的花蕾放入NLN-13培養液中，搗碎、過濾，離心后得到小孢子懸浮液；c.將小孢子懸浮液置于30～32℃下熱擊處理2～3天后，在常溫下進行黑暗恒溫培養，至肉眼可見胚狀體時，再進行黑暗震蕩培養，得到子葉期胚狀體；d.收集子葉期胚狀體，接種至分化培養基，在常溫下光照培養，分化芽長出后接種至生根培養基，生根、煉苗后移入營養土中培養，得到單倍體植株；e.用秋水仙堿對單倍體植株的根系進行加倍處理，植株恢復正常后移入大田進行正常栽培。2、根據權利要求1所述的雪菜單倍體育種方法，其特征在于所述的秋水仙堿的濃度為150~300mg/L,處理時間為15~30h。全文摘要本發明公開了一種雪菜單倍體育種方法，包括以下步驟取雪菜主莖或大分枝上的花序，低溫誘導后取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾進行滅菌；將滅菌后的花蕾放入NLN-13培養液中，搗碎、過濾，離心后得到小孢子懸浮液；將小孢子懸浮液熱擊處理后再進行常溫黑暗培養得到子葉期胚狀體；收集子葉期胚狀體，轉移至固體分化培養基后進行分化培養，生根、煉苗后移栽到營養土中，得到單倍體植株；將單倍體植株的根系用秋水仙堿加倍處理，得到雙單倍體植株。本發明方法在胚狀體誘導過程當中，對花蕾進行了低溫誘導，對小孢子進行熱擊處理，提高了胚狀體發生頻率和胚成活率，其胚成活率高達95％以上。文檔編號A01H1/08GK101473789SQ20091009562公開日2009年7月8日申請日期2009年1月13日優先權日2009年1月13日發明者萬光龍,周偉軍,王淑珍,玲許,馬華升申請人:浙江大學