專利名稱：一種四倍體蘿卜的育種方法
技術領域：
本發明涉及一種蘿卜的育種方法，尤其是一種四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法， 屬于植物育種技術領域。
背景技術：
“紅心蘿卜又名胭脂蘿卜，以皮肉全紅、質地脆嫩而聞名，在貴州、四川及重慶等地廣泛栽培”(見科學技術文獻出版社出版的《中國蘿卜》，P172頁)。紅皮紅心蘿卜系十字花科蘿卜屬蘿卜種下的一個地方品種。主產重慶市涪陵區，臨近縣市及四川、貴州等省也有栽培。其肉質根皮根肉均為紅色，色素含量豐富，其可食部分質地緊密、粗糙、不宜生食但可用于腌制泡菜。近年來，多用紅皮紅心蘿卜提取蘿卜紅色素。蘿卜紅色素是一種天然食用色素，安全、無毒、無任何負作用、資源豐富，而且具有一定營養和藥理作用(Annamaryju等人,Photochmistry, 1997, 45:671-674)，是國家添加劑標準委員會允許使用的天然色素之一。在食品、化妝、醫藥領域有著巨大的應用潛力。蘿卜紅色素的開發利用，紅色素含量和產量高的品種是基礎。以前，紅皮紅心蘿卜一直是由農民自繁自種，導致種子混雜、退化嚴重，蘿卜紅色素含量減少。 經過科研人員的不懈努力，通過收集、整理傳統資源，現已繁育出不少紅色素含量較高的品種，其紅色素含量在12%左右。除傳統繁育方法之外，還有通過化學處理獲得多倍體植物的方法，所獲得的多倍體植物在產量和營養品質上較同源二倍體品種有明顯優勢，如張紅亮等人(南京農業大學學報，2008，31 (3) :47-50)采用秋水仙堿誘導獲得了普通四倍體蘿卜， 發現其產量和營養品質各指標如維生素、可溶性糖、有機酸、可溶性糖、還原糖，均較同源二倍體品種有明顯優勢，其植株形態特征均比二倍體高，且差異顯著。雖然多倍體植物體內化學成分含量比同源二倍體含量高很多，但是多倍體往往結實率低或完全不育，紅色素含量的高低更是未知。
發明內容
本發明要解決的技術問題是針對現有紅皮紅心蘿卜產量和紅色素含量較低的缺陷，提出一種四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，提高紅心紅皮蘿卜的產量和紅色素含量。本發明通過以下技術方案解決技術問題，一種四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法， 包括以下步驟
步驟一、選取健康飽滿的紅心紅皮蘿卜種子，表面消毒30-60秒后，用氯化汞溶液浸泡處理12-15分鐘，再用無菌水沖洗干凈，一般沖洗3-5遍；
步驟二、將無菌的紅心紅皮蘿卜種子接種至MS發芽培養基，在25±3°C、14±2 McT1的條件下培養3-5天，得到無菌紅心紅皮蘿卜苗；
步驟三、將含子葉生長點的無菌紅心紅皮蘿卜苗切取接種至MS液體誘導培養基中，在 14±2h*d 1光照下振蕩誘導培養12 72小時；
步驟四、將誘導培養過的無菌紅心紅皮蘿卜苗接種至固體分化培養基中，在25±3°C、光照時間為14±2 Md'光照強度為2000±10001ux的條件下培養，直至分化，生成再生芽；
步驟五、切取再生芽接種至生根培養基，經煉苗后移栽至田間，得到再生植株，即四倍體紅心紅皮蘿卜植株。所用的紅心紅皮蘿卜種子選取純合二倍體紅心紅皮蘿卜種子。 所述MS發芽培養基是由MS培養基1L、蔗糖20g 30g和8g 9g瓊脂組成，pH為 5. 8 6. O。所述MS液體誘導培養基由MS培養基1L、0. I O. 2 mg NAA、5· Omg 6. Omg6-BA>5Omg 200 mg秋水仙喊組成，pH5. 8 6. O。所述固體分化培養基由MS培養基1L、0. Img O. 2 mg NAA、5· O mg 6· O 6-ΒΑ、20 g 30g鹿糖、8 9g瓊脂組成，pH5. 8 6· O。所述生根培養基由MS培養基1L、0. 2 O. 3 mg NAA、20 g 30g蔗糖、8 9 g瓊脂組成，PH5. 8 6. O。以上所有培養基中所含的MS培養基，以IL計，組成為=NH4HO3 1650mg, KNO31900mg, CaCl2*2H20 440mg, KH2PO4 170mg, MgSO4*7H20 370mg, FeS04*7H20 27. 8mg, Na2EDTA37. 3mg，H3BO3 6. 2mg，MnSO4eH2O 16. 9mg，ZnS04*7H20 8. 6mg，Na2MoO4*2H20 0. 25mg，CuSO4*5H20 0. 025mg,CoCl2*6H20 0. 025mg,KI 0. 83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，煙酸 0. 5mg，維生素BI 0. lmg,維生素B6 0. 5mg和余量的無菌水。按上述方法培育所得的四倍體紅心紅皮蘿卜與其同源二倍體相比在植株生長的各個階段均出現了變異。四倍體的莖、葉等營養器官和花器官、肉質根等生殖器官以及葉片下表皮氣孔、保衛細胞葉綠體、花粉粒等細胞觀察方面都表現出多倍體的巨大性，葉片厚度增加37% 46%。平均單個肉質根重增加13%左右，蘿卜紅色素含量比同源二倍體增加超過10%，花粉粒大小及氣孔大小增加30%以上，差異極顯著。其有益效果是提高了紅心紅皮蘿卜的產量的同時提高紅心紅皮蘿卜的紅色素含量，具有廣闊的市場前景。
具體實施例方式實施例一
本實施按以下方法培育四倍體紅心紅皮蘿卜
(I)配制各種培養基包括不同培養階段的培養基，其組分與各組分在每升培養基中所含的重量為
MS 培養基，以 IL 計，組成為=NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, CaCl2·2Η20 440mg, KH2PO4170mg, MgSO4·7Η20 370mg, FeSO4·7Η20 27. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3BO3 6. 2mg, MnS04.H2016. 9mg，ZnS04*7H20 8. 6mg，Na2MoO4*2H20 0. 25mg，CuS04*5H20 0. 025mg，CoC12*6H200. 025mg，KI 0. 83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，煙酸 0. 5mg，維生素 BI 0. lmg，維生素 B60. 5mg和余量的無菌水，高溫高壓滅菌。發芽培養基為MS培養基IL+蔗糖20g+瓊脂8 g，pH5. 8，高溫高壓滅菌。MS液體誘導培養基為MS培養基1L+0. Img NAA +5. Omg 6-BA+50mg秋水仙堿，pH5. 8，聞溫聞壓滅囷。固體分化培養基為MS培養基lL+0.05mg NAA+5. Omg 6-BA+20 g蔗糖+8 g瓊脂，pH5. 8，聞溫聞壓滅囷。生根培養基為MS培養基1L+0. 2 mg NAA+20 g蔗糖+8 g瓊脂，pH5. 8，高溫高壓滅菌。(2)按以下步驟培育四倍體紅心紅皮蘿卜
步驟一、挑選飽滿健康的純合二倍體紅皮紅心蘿卜種子(種子取自鎮江農科所)，在超凈工作臺上用70%乙醇表面消毒30s ;用1%升汞(氯化汞)溶液處理12min，無菌水沖洗3次；
步驟二、將無菌的紅皮紅心蘿卜種子接種到MS發芽培養基上，置于25°C、14 McT1培養5天，養成無菌苗；
步驟三、切取生長5天的無菌苗放入到含秋水仙堿的MS液體誘導培養基中，14 McT1光照下振蕩培養72 h ；
步驟四、將步驟三中秋水仙堿處理過的無菌苗用無菌水清洗2次，切割后接入到不含秋水仙堿的固體分化培養基中，在室溫25°C、光照時間為14 h.cT1、光照強度為2 000 Iux條件下培養，直至分化，生成再生芽；
步驟五、切取生長健康的再生芽接種至生根培養基上，再每天14小時光照、25°C下進行生根培養；3周后將根生長健壯的苗進行煉苗3天；移栽時用清水洗凈組培苗根部培養基，800倍75%百菌清浸泡基部2分鐘；把植株植于蔬菜育苗專用基質穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養10天后移栽，得到再生植株；
(3)對照實驗
對照組的實驗步驟及用品與實驗組相同，區別在于步驟三中的MS液體培養基中不含秋水仙堿，得到再生植株(對照)。取實驗組和對照組再生植株的嫩葉，用流式細胞儀檢測各植株倍性，確定發生變異植株的倍性水平。結果見表1，
表1 二倍體、四倍體蘿卜比較
權利要求
1.一種四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，包括以下步驟步驟一、選取健康飽滿的紅心紅皮蘿卜種子，表面消毒后，用氯化汞溶液浸泡處理12-15分鐘，再用無菌水沖洗干凈； 步驟二、將無菌的紅心紅皮蘿卜種子接種至MS發芽培養基，在25±3°C、14±2 McT1的條件下培養3-5天，得到無菌紅心紅皮蘿卜苗； 步驟三、將無菌紅心紅皮蘿卜苗切取接種至MS液體誘導培養基中，在MiZbcT1光照下振蕩誘導培養12 72小時； 步驟四、將誘導培養過的無菌紅心紅皮蘿卜苗接種至固體分化培養基中，在25±3°C、光照時間為14±2 Md'光照強度為2000±10001ux的條件下培養，直至分化，生成再生芽； 步驟五、切取再生芽接種至生根培養基，經煉苗后移栽至田間，得到再生植株，即四倍體紅心紅皮蘿卜植株。
2.根據權利要求I所述四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，其特征在于所述紅心紅皮蘿卜種子選取純合二倍體紅心紅皮蘿卜種子。
3.根據權利要求2所述四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，其特征在于所述MS發芽培養基是由MS培養基1L、蔗糖20g 30g和8g 9g瓊脂組成，pH為5. 8 6. O。
4.根據權利要求2所述四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，其特征在于所述MS液體誘導培養基由 MS 培養基 1L、0. I 0. 2 mg NAA、5. Omg 6. Omg 6-BA>5Omg 200 mg 秋水仙堿組成，PH5. 8 6. O。
5.根據權利要求2所述四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，其特征在于所述固體分化培養基由 MS 培養基 1L、0. Img 0. 2 mg NAA、5. 0 mg 6. 0 6_BA、20 g 30g 鹿糖、8 98瓊脂組成，口115.8 6.0。
6.根據權利要求2所述四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，其特征在于所述生根培養基由MS培養基1L、0. 2 0. 3 mg NAA、20 g 30g蔗糖、8 9 g瓊脂組成，pH5. 8 6. O。
7.根據權利要求3-6所述四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，其特征在于所述的MS培養基，以 IL 計，組成為=NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, CaCl2*2H20 440mg, KH2PO4 170mg,MgSO4*7H20 370mg，FeS04*7H20 27. 8mg，Na2EDTA 37. 3mg，H3BO3 6. 2mg，MnS04*H20 16. 9mg，ZnSO4^H2O 8. 6mg，Na2Mo04*2H20 0. 25mg，CuS04 5H20 0. 025mg，CoCl2WH2O 0. 025mg，KI0.83mg，肌醇lOOmg，甘氨酸2mg，煙酸0. 5mg，維生素BI 0. lmg，維生素B6 0. 5mg和余量的無菌水。
全文摘要
本發明涉及一種蘿卜的育種方法，尤其是一種四倍體紅心紅皮蘿卜的育種方法，屬于植物育種技術領域。本發明的方法主要是將滅菌后的紅皮紅心蘿卜種子，接種到MS發芽培養基上發芽，然后將無菌苗接入含秋水仙堿的MS液體誘導培養基中進行培養后再接入到不含秋水仙堿的固體分化培養基中培養，至分化生成再生芽，切取再生芽接種至生根培養基上生根培養，經煉苗和移栽，得到再生植株。經檢測，所得的四倍體紅心紅皮蘿卜與其同源二倍體相比在植株生長的各個階段均具優勢。其有益效果是提高了紅心紅皮蘿卜的產量的同時提高紅心紅皮蘿卜的紅色素含量，具有廣闊的市場前景。
文檔編號A01H4/00GK102613074SQ201210047249
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者姚悅梅, 張振超, 戴忠良, 潘永飛, 潘躍平, 秦文斌, 肖燕 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所, 鎮江瑞繁農藝有限公司