使用表達巢蛋白的干細胞顯像新生血管的血管發生模型的制作方法

專利名稱：使用表達巢蛋白的干細胞顯像新生血管的血管發生模型的制作方法
技術領域：
公開的發明涉及這樣的觀察，即巢蛋白(nestin)表達是內皮細胞增殖的 標記。巢蛋白表達對血管發生而言是一種特別有效的標記物，特別是針對 與肺瘤相關的血管發生。具體地，巢蛋白可以作為一種針對諸如神經膠質 瘤、血管母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤、和腦膜瘤的腦部腫瘤的極好 的內皮標記物。
背景技術：
巢蛋白和波形纖維蛋白(vimentin)與膠質纖維酸性蛋白(GFAP)—樣是一 種中間連絲(intermediate filament),并4皮4企測到大量存在于生長中的大鼠和 人的胚胎中樞神經系統中的神經上皮干/祖細胞中(Lendahl, U等人，Cell (1990) 60: 585-595; Messam， C A.等人，Exp. Neurol. (2000) 161: 585-596 ; Tohyama, T.等人，Lab. Invest. (1992) 66: 303-313; Tohyama, T，等人,Am. J PathoL (1993) 143:258-268))。巢蛋白也許和波形纖維蛋白一起，通過神經 上皮細胞中的共聚合作用形成中間連絲束(Eliasson, C.等人，J. Biol. Chem. (1999) 274: 23996-24006 ; Rutka, J, T.等人，Int. J. Dev. Neurosci. (1999) 17: 503-515)。
巢蛋白mRNA在處于胚胎發育期第15天(E15)的大鼠胚胎的大腦中高 度表達，然后下降直到產后第12天(P12)，并且從產后第18天到成體期消 失(Lendahl, U.等人，同上)。使用小鼠中巢蛋白轉基因促進的P-半乳糖苷酶 表達分析，在神經管閉合(E9)后立即在神經上皮細胞和體節中檢測到LacZ 活性(Zimmerman,L.等人，Neuron (1994) 12: 11-24)。在E14.5和E16.5 ， LacZ染色在小鼠胚胎紋狀體和大腦皮層中增生的腦室區域變得更強，在成熟皮 層中表達水平下降，局限在室管膜細胞群中。
在人類神經膠質瘤和成膠質細胞瘤中也檢測到基本的巢蛋白表達
(Dahlstrand, J.等人，CancerRes (1992) 52: 5334-5341)。同諸如纖維狀細胞的 星形細胞瘤這樣的次惡性形式相比，在高度惡性的神經膠質瘤尤其是成膠 質細胞瘤中頻繁觀察到巢蛋白的免疫染色。相反地，在非腫瘤的腦組織中 很少可通過免疫染色檢測到巢蛋白，但巢蛋白有時在血管內皮中有微弱的顯示。
巢蛋白mRNA大概長6.2千堿基，并且其基因包含三個內含子。有趣 的是，神經上皮細胞特異性的巢蛋白表達是由巢蛋白基因的第二個內含子 驅動的，而肌肉前體特異性表達卻是由第 一個內含子驅動的(Lothian, C.等人: Eur. J. Neurosci. (1997) 9: 452-462; Zimmerman, L，等人，同上)。
先前在七種人類神經膠質瘤/成膠質細胞瘤衍生的細胞系中檢驗到了 巢蛋白的表達(Kurihara， H.等人.，Gene Cher. (2000) 7: 686-693)。根據 Northern印跡分析，表達水平從高(U251， KG-1C)到無法檢測(NP-2， LN-Z308, T98G)之間變化。雖然惡性化的程度總體上反映了紳瘤在體內的倍 增時間，然而表達的水平并不和細胞系的生長速度平行。神經細胞特異性 的調節物，包括在基因5'上游區域之前的第二個內含子，驅動LacZ以和每 一細胞系中mRNA表達水平相應的程度表達(Kurihara,H.等人，同上)。這 種神經膠質瘤/成膠質細胞瘤細胞系中巢蛋白表達水平的可變性導致了對 從低度到高度惡性化過程中人類神經膠質瘤/成膠質細胞瘤中的巢蛋白表 達的重新評^\
雖然在結腸直腸癌內皮中報導了許多和血管發生相關的基因，但巢蛋 白并未包括在其中(Croix， B. S.等人，Science (2000) 289: 1197-1202)。在腦腫 瘤內皮中的與血管發生相關的基因可能與在結腸直腸癌內皮中的不同。值 得注意的是即使在腦腫瘤細胞中沒有發現巢蛋白表達，在腦腫瘤內皮中也 發現了強烈的巢蛋白表達。
發明概述
表達巢蛋白的細胞，其由能在再生中的表皮和真皮中增殖的熒光蛋白 (FP)來標記，反映了巢蛋白陽性的細胞群體，這些細胞在應答于損傷時出現增殖并從靠近病灶位點的突起遷移。巢蛋白表達作為與腫瘤相關的血管發 生的標記特別有用。具體地，巢蛋白可以作為針對諸如神經膠質瘤、血管 母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤、和腦膜瘤等腦部腫瘤的極好的內皮標 記物而起作用。因此，已描述的發明具有作為一種血管發生模型的用途。
在優選的實施方案中，公開的發明涉及一種監測血管發育的方法，包 括提供血管發生干細胞，其中所述干細胞包含表達盒，該盒編碼在巢蛋白
調控元件遺傳控制下的熒光蛋白(FP);在宿主中培養'所述干細胞；并且監測 導致血管發育的干細胞的血管發生活性。
在本發明的一方面，血管發生干細胞是表達巢蛋白的細胞，例如毛嚢 細胞或者肺瘤細胞。這些細胞能夠在體外或者體內生長。腫瘤細胞的例子 包括黑色素瘤、神經膠質瘤、血管母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤、和 腦膜瘤。
本發明的另 一方面利用了 一種或多種在巢蛋白調控元件控制下的熒光 蛋白。這些蛋白質的例子包括綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、藍 色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)。優選地，巢蛋白調控元件是由人巢 蛋白基因第二內含子編碼的。
本發明的另一方面涉及利用宿主生物體。宿主生物體優選是脊推動物。 特別優選的宿主生物體是哺乳動物或者鳥類。優選的哺乳動物宿主的例子 包括小鼠、大鼠、兔、犬和貓。優選的鳥類宿主的例子包括雞和雞卵。
在公開的本發明的一個實施方案中，血管發生干細胞包括巢蛋白調控 下的第一熒光蛋白，并且宿主生物體包含巢蛋白調控下的第二熒光蛋白， 其中第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。
公開的本發明的另一個實施方案涉及篩選血管發生調節劑的方法，包 括提供血管發生干細胞，其中干細胞包含表達盒，該盒編碼一種在巢蛋白 調控元件遺傳控制下的熒光蛋白(FP);在血管發生調節試劑存在時于宿主中 培養這種干細胞；并且其中監測所述干細胞的血管發生活性。
本發明還涉及
1. 一種監測血管發育的方法，包括
提供血管發生干細胞，其中所述干細胞包含表達盒，該表達盒編碼在 巢蛋白調控元件遺傳控制下的熒光蛋白； 在宿主中培養所述干細胞；和監測導致血管發育的干細胞血管發生活性。
2. 項1的方法，其中所述血管發生干細胞是表達巢蛋白的細胞。
3. 項2的方法，其中所述表達巢蛋白的細胞是毛嚢細胞。
4. 項3的方法，其中所述毛嚢細胞生長在體外培養物中。
5. 項2的方法，其中所述表達巢蛋白的細胞是腫瘤細胞。
6. 項5的方法，其中所述腫瘤細胞來自選自黑色素瘤、神經膠質瘤、 血管母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤和腦膜瘤組成的組的腫瘤類型。
7. 項1的方法，其中所述焚光蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、紅色焚 光蛋白(RFP)、藍色焚光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)組成的組。
8. 項1的方法，其中所述巢蛋白調控元件是由人巢蛋白基因第二內含 子編碼的。
9. 項1的方法，其中所述宿主生物是脊推動物生物體。
10. 項9的方法，其中所述宿主生物體是哺乳動物或鳥類。
11. 項10的方法，其中所述哺乳動物宿主選自小鼠、大鼠、兔、犬和 貓組成的組。
12. 項9的方法，其中所述宿主生物體是雞或者雞卵。
13. 項1的方法，其中所述血管發生干細胞包含處于巢蛋白調節控制 下的第一熒光蛋白，并且宿主生物包含處于巢蛋白調節控制下的第二熒光 蛋白，其中的第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。
14. 一種篩選血管發生調節劑的方法，包括
提供血管發生干細胞，其中所述干細胞包含表達盒，該表達盒編碼在 巢蛋白調控元件遺傳控制下的熒光蛋白；
在血管發生調節試劑存在下于宿主細胞中培養干細胞；和 其中監測所述干細胞的血管發生活性。
15. 項14的方法，其中所述血管發生干細胞是表達巢蛋白的細胞。
16. 項15的方法，其中所述表達巢蛋白的細胞是毛嚢細胞。
17. 項16的方法，其中所述毛嚢細胞生長在體外培養物中。
18. 項15的方法，其中所述表達巢蛋白的細胞是腫瘤細胞。
19. 項18的方法，其中所述肺瘤細胞來自選自黑色素瘤、神經膠質瘤、 血管母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤和腦膜瘤組成的組的肺瘤類型。20. 項14的方法，其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、紅色 熒光蛋白(RFP)、藍色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)組成的組。21. 項14的方法，其中所述巢蛋白調控元件是由人巢蛋白基因第二內 含子編碼的。22. 項14的方法，其中所述宿主生物是脊推動物生物體。23. 項22的方法，其中所述宿主生物體是哺乳動物或鳥類。24. 項23的方法，其中所述哺乳動物宿主選自包括小鼠、大鼠、兔、 犬和貓組成的組。25. 項23的方法，其中所述宿主生物體是雞或雞卵。26. 項14的方法，其中所述血管發生干細胞包含處于巢蛋白調節控制 下的第一熒光蛋白，并且宿主生物包含處于巢蛋白調節控制下的第二熒光 蛋白，其中的第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。附圖簡述圖la-e顯示了來自ND-GFP轉基因小鼠背側皮膚真皮面的視圖。圖中 標尺代表100pm的距離。圖2a-g顯示了植入棵鼠皮下組織的ND-GFP觸須毛嚢(vibrissa follicle) 圖像(標尺，100pm)。圖3a-c顯示了在棵鼠腎嚢之下移植的ND-GFP觸須毛嚢的圖像(標尺， 100,)。圖4a顯示了移植前分離的ND-GFP觸須毛嚢。圖4b顯示了移植后10 天棵鼠受創傷皮膚中的ND-GFP觸須毛嚢圖像。圖4c和4d顯示了來自圖 4b區域的高放大倍數圖像，顯示為白色陰影框。圖4e是ND-GFP觸須毛嚢 移植進入創傷棵鼠皮膚的示意圖。(標尺，100(im)實施發明的方式公開的本發明提供了研究血管發生的模型系統。在一個優選的實施方 案中，血管發生內皮干細胞由編碼熒光蛋白的表達系統標記，所述熒光蛋 白的表達由已被公開為來自在血管發生內皮干細胞中優選表達的基因的調 控序列所控制。所述表達系統提供可視標記物用來觀察血管發生過程。表優選用于控制標記蛋白的表達。因此，公開的模型系統使用編碼一種或多 種巢蛋白調控序列控制下的熒光蛋白的血管發生干細胞來模擬血管發生。血管發生干細胞公開的模型系統使用標記的祖細胞或干細胞作為血管發生的標記物。 巢蛋白表達對于干細胞諸如中樞神經系統干細胞、神經上皮干細胞和毛嚢 鞘祖細胞是極好的的標記物。巢蛋白也是某些癌細胞的極好的標記物，如黑色素瘤(melanoma)和具體是腦腫瘤諸如神經膠質瘤(glioma)、血管母細胞 瘤(hemangioblastoma)、 神經鞘瘤(Schwannoma)、 髄母細胞瘤 (medulloblastoma)、 禾口月S月莫瘤(meningioma)。巢蛋白是一種中間連絲，它可作為中樞神經系統祖細胞的標記。具體 地，具有巢蛋白調控序列控制下的綠色熒光蛋白的轉基因小鼠已經生成并 用于中樞神經系統干細胞的自我更新和多潛能的顯示。雖然，在一個優選 的實施方案中，巢蛋白可能與檢測試劑諸如綠色熒光蛋白連接以利于分離 過程，這些細胞的其它標記能用于分離毛嚢干細胞以及其它任何檢測試劑。 例如，可以在體外或原位對細胞進行測定并4企測標記的結合伴倡、抗體、 或者結合的核酸。在將毛嚢干細胞(hair follicle stem cell)附著于固體支持物 上的實施方案中，測定可以采用其它類型的信號分子，其中未結合的信號 分子能與結合在細胞上的信號分子分離。例如，信號分子可用放射性同位 素(例如，125I， 131I， 35S, 32P， 14C或3H);光散射標簽(Genicon Sciences Corporation, San Diego，CAand see等，美國專利號6,214, 560);酶或蛋白質 標簽(例如焚光蛋白(FP)或過氧化物酶)；或另一種發色標記或染料(例如， 德克薩斯紅)進行標記。此外，FACS或其它的細胞分離機制可以用于分離 細胞。毛嚢干細胞的定位根據毛發周期而變化。在巢蛋白-FP轉基因小鼠的毛 發初始生長的早期，表達巢蛋白的細胞定位于位于毛嚢干細胞所在的毛嚢 突起中的皮脂腺正下方的永久上端毛嚢(permanent upper hair follicle)之中。 在突起部分的表達巢蛋白的細胞相對較小，呈卵形并通過小的樹突相互連 接而圍繞著發干(hair shaft)。圖3顯示了毛嚢中表達巢蛋白的細胞的定位是 依賴于毛發周期的。在毛發生長終期(telogen)和毛發初始生長初期，熒光蛋 白陽性的細胞，例如，表達巢蛋白的細胞，主要位于突起區域(bulgearea)。在毛發生長終期和毛發初始生長的早期已經看到表達熒光蛋白的毛嚢干細 胞。來自于毛發生長終期的毛嚢干細胞顯示為是原始的并且已經定位，它 們優選進行收獲，雖然這些細胞可以從毛發周期的任何階段收獲。申請號10/251，657,題為"巢蛋白表達的毛嚢干細胞"的美國專利探討了收獲的技術， 在此處引用作為參考。在毛發初始生長中期和晚期，表達熒光蛋白的細胞定位于上部外根鞘 和突起區域而不是毛發基質球中。這些觀察結果提示表達巢蛋白的細胞形 成了外根鞘，其與觀察到的毛嚢干細胞的行為一致。免疫組織化學染色的 結果顯示巢蛋白、熒光蛋白、角蛋白5/8和角蛋白15共定位于毛嚢突起細 胞、外根鞘細胞和皮脂腺的基底細胞中。這些數據進一步表明在毛嚢突起 部中表達巢蛋白-熒光蛋白的細胞是毛嚢干細胞。巢蛋白驅動的綠色熒光蛋 白也一皮發現在嚢間神經狀網絡中高度表達。神經干細胞中、毛嚢干細胞中 和嚢間神經狀網絡中巢蛋白的普遍表達提示它們的共同起源。在一般應用中，將標記的細胞引入宿主生物體，在這里細胞生長并且 分化以形成新生血管。新生血管一般與宿主生物體中存在的血管交叉合流 (anastomosis)。利用標準的植入方法諸如移植、經皮注射和植入可以將標記 的細^^植入到任何合適的宿主中并且讓其發展和發育。才直入可以以本領域已知的任何方式來實施。在一個實施方案中，將毛 嚢干細胞或由其分化的細胞經系統注入受試者體內。在另一方面，將毛嚢 干細胞或由其分化的細胞直接注入受試者的器官或組織中。優選地器官或 組織是視網膜、大腦、肝或與心血管相關的組織或肌肉，例如心臟或肺。 另外，也涉及附著或生長在合成支持物上然后進行植入的細胞或組織。與 由其源細胞而來的受試者相比，毛嚢干細胞或由其分化的細胞能夠被異源 移植到不同受試者中。然而，由于毛嚢干細胞的可得性，在一個優選的實 施方案中細胞能夠從待治療的受試者體內獲取并且如果需要，可以生長以 提供分化的細胞，并且可以對干細胞或分化的細胞進行自體移植。由于本 發明的干細胞足夠原始因而當移植時宿主不太可能排斥所述細胞，所以還 考慮了毛嚢干細胞庫的用途。將標記細胞移植入脊推動物中的技術包括通過在需要位置的進行手術 原位移植(SOI)的直接移植。腎嚢中的移植是優選的種植位點。當標記的細 胞是胂瘤細胞時，移植的位點一般是腫瘤細胞來源的位置。合適的位點包括肺、肝、胰腺、胃、乳房、卵巢、前列腺、骨髓、大腦和其它對惡性敏 感的組織。 一旦標記細胞已經移植，脊推動物就成為用于研究血管發生的 模型系統。標記的細胞于是可以發展發育并且在脊推動物遠離種植位點的 位點監測FP標記細胞的出現。監測可以對脊推動物整體進行直接觀察，例 如用熒光顯微鏡，或將組織切片進行顯微檢查。用作模型的合適的脊推動物受試者優選哺乳動物受試者，最優選諸如 兔、大鼠、小鼠、犬、貓等方便的實驗動物。為了和人類受試者更接近的 相似性，應該使用靈長類動物。特別有用的受試者是對肺瘤發育敏感的受 試者，例如有受損免疫系統的受試者， 一般為棵鼠或SCID小鼠。任何適當 的脊推動物受試者都能使用，主要根據方便以及與最終目標系統的相似性 指導受試者的選擇。體外系統如組織培養物也能作為合適的宿主。適合于 這種研究的系統包括固體支持的培養物諸如那些在膠原凝膠等上維持的培 養物。標記的細胞可以通過在體外使用標準的直接基因傳遞方法或者在體內 從轉基因宿主中收獲標記的細胞而制備。直接的基因傳遞方法包括使用脂質體、磷酸4丐沉淀、電穿孔和基因槍。優選脂質體轉染。例如，優選地使用編碼在巢蛋白調控元件控制下的熒光蛋白或其它標記的逆轉錄病毒載體 制備標記的癌癥細胞。優選地熒光蛋白標記的毛嚢干細胞從轉基因動物源 中收獲。巢蛋白表達調控元件用于區別性地驅動血管發生干細胞中編碼熒 光蛋白的序列的表達，由此制成干細胞標記物用于血管發生。熒光蛋白所述模型通常涉及產生一種或多種熒光蛋白標記的細胞。熒光蛋白標 記的細胞是通過將表達系統導入宿主細胞而制得，其中表達系統包括在一 種或多種巢蛋白調控序列控制下的熒光蛋白。在一個優選的實施方案中， 對脊推動物宿主生物體優選哺乳動物或鳥類宿主進行修飾以包含一種或多 種熒光蛋白標記的細胞。對這些細胞進行培養或讓其在宿主生物體內生長。多年來多種焚光蛋白已經被用作標記。最初分離的蛋白發射綠色波長并且被稱作綠色焚光蛋白(GFP)。因此，盡管包括紅色熒光蛋白、藍色熒 光蛋白和黃色熒光蛋白等的多種顏色蛋白已經得到制備，通常綠色熒光蛋 白仍成為這些熒光蛋白的通用標記。這些蛋白的性質已經在下述文獻中探討過，例如美國專利6，232, 523; 6, 235， 967; 6, 235，968和6,251,384,在此 將其全部引用作為參考。這些專利描述了使用各種顏色的熒光蛋白監測轉 基因鼠中細胞生長和肺瘤轉移。另外，在美國專利申請號09/812,710中這 些熒光蛋白已經用于監測由啟動子介導的表達；在美國專利申請號 10/192,7400中用于監測細菌感染并且在美國臨時申請號60/425， 776中用 于監測細胞分離。在美國臨時申請號60/404,005和60/427,604中披露了 使用不同顏色的熒光蛋白標記細胞的細胞核和細胞質，由此在美國臨時申 請號60/445， 583中描述了相同顏色的一致熒光。在此引用所有這些文獻作 為參考。巢蛋白巢蛋白是一種可作為祖細胞或干細胞標記物的中間連絲基因。(智人屬 (//omo ^p/ms)巢蛋白(NES)， mRNA (NM-OOMH))。巢蛋白的表達將干 細胞和更加分化的細胞區分開來。神經上皮干細胞表達巢蛋白并且當它們 由增殖性干細胞分化成有絲分裂后的神經元時強烈下調巢蛋白(Lendahl，等 人，(1990) Cell 60: 585-595.)。巢蛋白也在肌肉前體中表達但不在成熟肌肉 細胞中表達。在轉基因動物中，巢蛋白基因第一和第二內含子中獨立的細 胞類型特異性元件分別一致地將報告基因的表達指向發育中的肌肉和神經 前體。巢蛋白第二內含子包含一個在中樞神經系統干細胞中行使功能的增 強子(Zimmerman，等人，(1994)N euron 12: 11-24; (//owo s，.em nestin gene, intron2 (AF004335))。這些元件的鑒定有利于對發生在某些祖細胞或干細胞 最終分化時，對基因表達轉換控制機制的分析。下列實施例意在說明公開發明的范圍，并不以任何方式對其進行限制。實施例1增殖性上皮細胞表達巢蛋白如由在靜態培養的牛主動脈內皮細胞中表達的高水平巢蛋白所表明 的，增殖性上皮細胞表達巢蛋白。在下面討論的實施例中使用牛主動脈內 皮細胞(BAECs)以檢查內皮巢蛋白的表達。內皮巢蛋白在靜態培養中通過細胞分裂而增殖，而增殖在生理層流(大約15 dyn/cm2)下降低(Malek， A. M.等人，JAMA (1999) 282 : 2035-2042)。通 過Northern印跡分析和免疫染色檢測到巢蛋白在靜態培養的BAECs中強烈 表達。為了檢查巢蛋白表達是否是增殖依賴的，對BAECs進行15 dyn/cm2 的切變壓力流測試持續12小時。將用剃刀從牛胸主動脈內表面刮下的牛主動脈內皮細胞(BAECs)用于 后面實驗中。隨后將BAECs在含有具有20%胎牛血清的RPMI 1640的6孔 板里進行培養。當BAECs形成了直徑3到6 mm的集落時，將細胞轉移到 新的6孔板中，其中胎牛血清減少到10%。通過7到12次傳代對生長在卵 石狀片層構造中的培養細胞系進行選擇并保存在液氮中備用。在0.5mm厚的石英蓋玻片上培養BAECs。翻轉蓋玻片并放置于平行平 板式流動槽中(內部尺寸16 mm寬x35mm長x200mm深)，正如先前描 述的(Negishi， Y.等人，XPterioscler. Shromb. Vasc. Biol. (2001) 21: 785-790)。將 此裝置于37。C放置在C02培養箱中。在先前描述過的方程的基礎上計算切 變壓力強度(Negishi, Y.等人，同上)。流速調整到15 dyn/cm2，和生理流速相 適應。接下來在pH 7.4的含4%聚曱醛的0.1 M磷酸緩沖液中固定BAECs持 續24小時(組織)或1小時(培養的細胞)。使用含50mMNH4Cl的PBS 處理BAECs以淬滅任何游離的曱醛，接著在第一抗體溫育前通過0.1%皂苷 和0.4%牛血清白蛋白處理使其具有通透性。首先將BAECs和1: 5000稀釋 的抗巢蛋白的第一抗體一起溫育。對于BAECs,第二抗體使用吲哚二羧基 氰(indodicarbocyanide)偶聯的親和純化的驢抗兔IgG (紅色)(Jackson hnmunoresearch, West Grove, Peimsylvania)。 纟田月包才亥通過4 ， 6- 二氛基 (diamidino)-2-苯基吲哚復染為藍色。為了 Northern印跡分析，從BAECs中提取總RNA，通過6. 3%曱醛/ 50%曱酰胺變性，在含6.6°/。曱醛的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，隨后印跡到尼 龍膜上(Amersham Life Science, Tokyo, Japan)。使用來自人巢蛋白DNA片段 (560 bp)的探針進行雜交，該才果針通過隨機引發法(random priming procedure) 用"P脫氧-CTP標記。甘油醛-3-磷酸脫氪酶探針用作對照。為了進行Western印跡，在裂解緩沖液(70 mM Tris-HCl, pH 6.8， 11.2% 甘油，3% SDS, 0.01%溴酚藍，5% 2-巰基乙醇)中溶解U251人成膠質細胞瘤細胞獲得細胞裂解物。隨后將細胞裂解物在還原條件下于7.5%聚丙烯酰胺
凝膠上電泳，隨后印跡到硝酸纖維素膜上用l:7500稀釋的兔抗人巢蛋白抗 血清進行探測。巢蛋白印跡使用ECL探測系統(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom)進行檢測。
通過Northern印跡分析發現巢蛋白mRNA的表達隨切向壓力流而顯著 減弱。而且，通過免疫染色確認了流動依賴性(flow-dependent)巢蛋白表達下 降。
實施例2
對于大腦腫瘤的巢蛋白免疫染色
通過注射合成的覆蓋人巢蛋白序列c末端n個氨基酸的寡聚肽在家兔
中激發針對巢蛋白的多克隆抗體。通過Western印跡發現此抗體與從U251 細胞提取的210到240kD蛋白質反應，正如先前報道的一樣(Messam, C. A. 等人，同上；Tohyama, T.等人，同上(1992))。免疫印跡顯示為雙重體 (doublet),可能因為碳水化合物的修飾差異導致，正如先前報道的那樣 (Messam,C.A.等人，同上)。當合成的寡聚肽加入到U251細胞裂解物中時免 疫印跡消失，表明免疫印跡代表巢蛋白。
使用包括波形纖維蛋白、GFAP、角蛋白和肌間線蛋白(desmin)的其它 中間連絲進一步檢驗這種抗體的交叉反應性。針對人波形纖維蛋白的抗體 和U251與HeLa細胞提取物的反應都顯示出略超過50-kD分子量標記位置
的條帶，但和HeLa細胞提取物的反應則沒有。使用合并的小鼠單克隆抗體， 抗細胞角蛋白AE1/AE3檢測角蛋白，所述抗細胞角蛋白AE1/AE3識別酸性 和堿性角蛋白的廣泛亞家族。所述抗細胞角蛋白AE1/AE3識別來自HeLa 細胞提取物中大約50kD的蛋白，但與U251細胞提取物反應微弱。針對人 肌間線蛋白的抗體與U251和HeLa細胞提取物的反應沒有顯示任何條帶。 非免疫的(nonimmune)兔血清與U251和HeLa細胞提取物反應沒有顯示任何 人工(artifactual)條帶。因此，針對巢蛋白的抗體顯示出與先前報道的巢蛋白 分子大小的蛋白質相應的大條帶(Messam, C. A.，等人,同上；Tohyama, T.等 人，同上(1992))，但其并不與其它中間連絲發生交叉反應。隨后用這種抗體對71個腦腫瘤樣本進行免疫染色。71個人腦腫瘤樣本
包括57個神經膠質瘤和14個其它腦腫瘤。神經膠質瘤包括6個世界衛生 組織(WHO)—級腫瘤、11個二級腫瘤、18個三級腫瘤和22個四級腫瘤。 其它腦肺瘤包括4個血管母細胞瘤、3個腦膜瘤、2個非典型腦膜瘤和兩個 神經鞘瘤。全部71個腦肺瘤都在Gunma大學醫學院 (Gunma University School of Medicine )神經外科切除。這些診斷建立在依據位于Gunma大學 醫學院(Gunma University School of Medicine )病理學系的修訂版WHO分 類的常規病理檢驗的基礎上。
在含4。/。聚曱醛的0.1 M磷酸緩沖液、pH7.4中固定人腦腫瘤和肺瘤組 織持續24小時(組織)或1小時(培養的細胞)。小片的組織樣本包埋入 優化的切片溫度化合物中以進行顯微切片。組織切面首先和1: 5000稀釋的 針對巢蛋白的第 一抗體一起溫育。對于大腦或腫瘤組織，可使用LSAB2/HRP 染色試劑盒作為第二抗體反應系統。步驟包括第二抗體反應然后是和辣根 過氧化物酶標記的《連霉親合素系統的酶反應。在酶反應中，過氧化物酶催 化3-氨基-9-乙基咔唑(ethylcarbazole)成為可溶的棕色產物。
盡管如前所述(Dahlstrand， J.，等人,同上)一些血管內皮細胞顯示出偶然 的微弱染色，但正常大腦皮層組織不會被這種抗體免疫染色。在膠質母細 胞瘤(glioblastoma)(WHO IV級)中， 一般的巢蛋白染色隨著腫瘤細胞發育進 程呈纖絲分布。在這種肺瘤中染色的強度被分類為4+。巢蛋白染色也在圓 形肺瘤細胞中以鈕狀(button-like)簇的形式明顯存在(惡性寡聚星形瘤細胞 (anaplastic oligoasgrocytoma),染色強度3+)。在一些III級和IV級的神經膠 質瘤中，染色局制在增殖的內皮，(膠質母細胞瘤，IV級)(惡性寡聚突膠質 細胞瘤，III級)。在低等級的神經膠質瘤中，在相當數量的腫瘤中染色微弱 到可以忽略，但沿著肺瘤的內皮可以注意到清晰的染色，(寡突膠質細胞瘤, II級)。在其它腦腫瘤(神經鞘瘤和腦膜瘤)中這種趨勢更明顯，它們的內皮有 針對巢蛋白的強烈陽性免疫染色然而腫瘤細胞卻一點也沒有染色。因此， 腫瘤內皮細胞表達巢蛋白與惡性的WHO等級無關。
實施例3
血管母細胞瘤中的巢蛋白表達由于巢蛋白在增殖中的內皮細胞中表達，懷疑它甚至在血管母細胞瘤 中表達，這是因為成血管母細胞被認為是造血細胞和成血管細胞的前體
(Eichmann， A.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. UNA (1997) 94: 5141-5146)。為了
檢查這種組織，檢測了四種人血管母細胞瘤。 一種內皮細胞標記，von Willebrand因子，可以沿著血管母細胞瘤的內皮和孩支細管進行陽性免疫染色 (Bohling， T.,等人.，IARC Press (2000), Lyon, France, 223-226)。
巢蛋白也主要地在血管母細胞瘤的微細管中進行免疫染色。然而包含 稀薄細胞質和突起狀(convex-shaped)細胞核的常見內皮細胞不是巢蛋白染 色陽性的。因為內皮細胞的外形類似于普通脈管，這種類型的內皮細胞可 以被很好的區分并且缺失了巢蛋白表達。包含血管母細胞瘤的巢蛋白陽性 細胞可以反應真正轉變的血管母細胞瘤。因此，巢蛋白不僅是針對神經上 皮干細胞與神經膠質瘤也是針對血管母細胞瘤和正在增殖的內皮細胞的標 記蛋白質。
實施例4
血管母細胞瘤中的巢蛋白免疫染色
中間連絲蛋白質，巢蛋白，標記中樞神經系統的祖細胞。 通過將綠色熒光蛋白放置于巢蛋白調控序列的控制之下來選擇性標記 祖代(progenitor)中樞神經系統干細胞。先前已經披露了在毛發初始生長早期 或毛嚢生長階段、在巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠中由綠色焚光蛋白熒 光標記的表達巢蛋白的細胞，出現在位于毛嚢干細胞所在的毛嚢突起中的 皮脂腺的正下方的永久上端毛嚢里。這就是毛嚢外根鞘干細胞的定位位點。 位于突起部分的表達巢蛋白的細胞相對較小，呈卵形并通過小的樹突相互 連接圍繞著發干。表達巢蛋白的細胞在毛嚢中的精確定位隨毛發周期而變 化。
這些觀察結果顯示表達巢蛋白的細胞對皮膚的再生發揮作用。這些數 據顯示在毛嚢突起部位的由綠色熒光蛋白標記的表達巢蛋白的細胞確實不 僅是毛囊外根鞘的而且也是表皮的祖細胞。
目前使用了皮膚創傷的幾種不同模型并且每一種模擬了.臨床情況的不 同方面且準確性的程度不同。經過穿孔活體檢查損傷后在第1、 3、 5、7和 9天測定皮膚傷口的巢蛋白-綠色熒光蛋白表達。在第5天表達巢蛋白的細胞更廣泛地散布于真皮和表皮的基底層之中。到了第3天，檢測到了巢蛋
白-綠色熒光蛋白表達細胞的增加，并在損傷后第5到9天達到了最大的免
疫強度。
近來，Taylor, G.等人在Cell (2000) 102: 451-461中報導毛囊突起干細胞 具有潛在的雙能性，這是因為它們不僅能生成毛嚢細胞也能生成上皮細胞。 其它的實驗也提供了成年小鼠觸須(觸須線)毛嚢上端外根鞘中包含多潛 能干細胞的證據，此干細胞可以分化成為毛嚢基質細胞、皮脂腺基底細胞 和上皮。
近來，有報道說從哺乳動物皮膚真皮中分離到的多功能成熟干細胞， 其稱作皮膚衍生前體，能夠在培養物中增殖并且分化以產生神經元、神經 膠質、平滑肌細胞和脂肪細胞。然而，這些干細胞在皮膚中確切定位還是 未知的，它們的功能仍然是不清楚的。
本文公開了在毛嚢細胞中作為神經祖細胞標記物的巢蛋白的表達。巢 蛋白連接在熒光蛋白上(GFP)，這樣可以觀察到每個周期中表達巢蛋白的細 胞形成了毛嚢的主要部分。神經干細胞蛋白質一巢蛋白一在毛嚢干細胞中 的表達提示了 一種可能的聯系。
多潛能、巢蛋白陽性、纖維結合素陽性的干細胞(SKPs)能夠從新生的和 成熟的皮膚中生成，這些前體源于真皮，它們與間葉干細胞有所不同。單 個的SKPs克隆能夠分化成為神經外胚層和中胚層語系，包括(但可能不限 于)神經、神經膠質、平滑肌細胞和脂肪細胞。研究表明SKPs能夠經過至 少一年的時間而不會喪失產生這些分化細胞類型的能力。最后，人類研究 顯示相似的前體可能出現在成人皮膚中。因此，SKPs顯然代表了一種新的 多潛能成熟干細胞，它可能比其它成熟干細胞有更少的"偏向"。從可得到 的、潛在自體組織來源如哺乳動物皮膚中分離并且擴展得到這種干細胞的 能力具有重要的治療用途。
這些發現顯示GATA-3為特異反應性皮炎(AD)的關鍵決定因素。因此， 巢蛋白調控的FP轉基因鼠科動物模型與理解在過敏性皮膚疾病如AD中 Th2細胞和Th2細胞因子的作用的生理意義相關。
實施例5
巢蛋白-FP轉基因小鼠巢蛋白是一種中間連絲(IF)基因，它是中樞神經系統祖細胞和神經上皮
干細胞的標記物。將攜帶有在巢蛋白第二內含子增強子控制下的EGFP的增 強GFP(EGFP)的轉基因小鼠用來研究和目測檢驗CNS干細胞的自更新和多 能性。如由巢蛋白調控的EGFP表達所證明的，下面討論的工作顯示毛嚢干 細胞強烈地表達巢蛋白。
毛發初始生長期的誘導
用熱的松香和蜂蠟混合物對的6-8個星期大、處于毛發生長終期的巢蛋 白調控的GFP轉基因小鼠進行脫毛。在脫毛(毛發生長終期)前和脫毛后 第1-5天(毛發初始生長早期)、第8和10天(毛發初始生長中期(catagen) )、第14和15天(毛發初始生長晚期)以及第19和20天(毛發生長中期 )從背部皮膚切下樣本(5x5mm2)。將皮膚樣本分成兩部分， 一部分用于焚 光顯微檢查而另一部分用于冷凍切片。簡單的說，將皮膚樣本包埋入組織 冷凍包埋培養基中并在-8(TC冷凍過夜。使用LeicaCM1850恒冷切片機切出 8pm厚的切片。冷凍切片進行空氣干燥和二碘化丙錠復染用于熒光顯微檢 查。
熒光和共聚焦顯微檢查
切去s. c.組織后，在配備了 GFP光學配件的Nikon焚光顯微鏡下直接 觀察巢蛋白-GFP皮膚樣本的真皮上部分和表皮下部分。同時也使用了安裝 在具有10倍PlanApo物鏡的Nikon Optiphot上的MRC-600共聚焦成像系 統(Bio-Rad)。
免疫組織化學染色
通過使用DAKO ARK動物研究試劑盒(巢蛋白和角蛋白)并按照制造商 說明書的DAKO EnVision雙染色系統來檢測石蠟包埋的C57B16小鼠和巢 蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚切片中巢蛋白、角蛋白5、 8和15、和GFP的共 定位。簡單地說，通過在過氧化物酶封閉溶液中溫育5分鐘來淬滅皮膚樣 本中內源過氧化物酶的活性。載玻片隨后和預備好的生物素標記的第一抗 體(GFPmAb, 1: 100;巢蛋白mAb， 1: 80;角蛋白5/8 mAb, 1: 250;和角蛋白 15 mAb, 1: 100)—起溫育15分鐘，然后和鏈霉親合素過氧化物酶一起溫育15分鐘。通過和底物發色團3, 3'-二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)(DAB)或 者快速核酸紅一起溫育5分鐘以完成染色。棕色(DAB)或櫻桃紅(快速 核酸紅)染色用于抗原染色。巢蛋白mAb(大鼠401)由Iowa大學購得(Iowa City )。角蛋白5 / 8 mAb (MAB3228)和角蛋白15 mAb (CBL 272)由Chemicon購得。
具有巢蛋白控制的GFP表達的細胞位于處于毛嚢干細胞所在的毛嚢突 起中皮脂腺的正下方的毛發生長終期毛嚢的永久上部區域中。這些細胞相 對較小，呈卵形或圓形并通過小的樹突相互連接。
表達巢蛋白的細胞的定位和數量是依賴于毛發周期的。通過脫毛誘導 小鼠(6-8周大)毛發生長終期毛嚢的毛發生長初期后，接下來在發育的毛 嚢里進行GFP標記的巢蛋白生產細胞的發育和增殖。正如先前對毛嚢干細 胞的描述，在毛發生長終期毛嚢中的綠色熒光、巢蛋白表達細胞只位于上 端永久突起區域。脫毛后2到3天，表達巢蛋白的毛嚢細胞已經增殖并從 突起向下遷移。在毛發初始生長的中期和晚期階段，表達巢蛋白的毛嚢細 胞占據了外根鞘的上2/3，而從毛嚢下1/3以及毛發基質球中消失。在毛 發生長中期，當毛發球基質細胞經歷退化和變性時，外根鞘中表達巢蛋白 -GFP的細胞的數量隨著毛嚢皺縮一起減少。最終，到下一個毛發生長終期 這些細胞只位于突起處。
所述數據顯示表達巢蛋白的細胞包括毛嚢外根鞘的真性祖細胞或干細 胞。在毛發初始生長的高峰，整個毛嚢外根鞘2/3長度由表達巢蛋白的細 胞組成。這顯然是發源于處于毛發生長終期表達巢蛋白的細胞簇中并且隨 毛發周期同步增殖。大多數毛發初始生長期的毛嚢外根鞘一定是由這些推 定的干細胞衍生而來，因為考慮到物理、生理和時間障礙從周圍組織中大 量募集細胞是不太可能的。這些結果提供了關于活干細胞形成新毛嚢結構 重要部分的描述。
這些結果得到了其它發現的有力支持。近來，Oshima， H.等人在Cell (2001) 104: 233-245中報道成體大鼠觸須毛嚢外根鞘的上端區域包含有多能 干細胞，其響應形態發生信號從而生成多種毛嚢、皮脂腺和真皮。這些發 現和我們觀察到的外根鞘中的巢蛋白-GFP表達相一致。
這些巢蛋白-GFP表達的毛嚢祖細胞或干細胞也表達角蛋白5/8和角 蛋白15,其是毛嚢干細胞的潛在標記物。免疫組織化學染色的結果顯示巢蛋白、GFP、角蛋白5/8和角蛋白15共定位于毛嚢突起細胞、外根鞘細胞 和皮脂腺基底細胞中。這些數據進一步支持了在毛嚢突起中的表達巢蛋白 -GFP的細胞是外根鞘的祖代細胞。
最近的對于毛嚢生物學的關注潮已經揭示了除了在形成發干中明顯的 作用之外，功能和細胞類型的令人驚訝的復雜性。這里報道的觀察結果顯 示在毛嚢里的外根鞘祖細胞分享了先前在神經干細胞中發現的巢蛋白標 記。這一發現暗示了毛嚢細胞和神經干細胞之間可能的聯系。這些數據也 證實了先前所懷疑的情形，即，已經顯示出在毛發初始生長階段能夠表達 巢蛋白-GFP的突起細胞可增殖以形成大量的外根鞘。當然，表達巢蛋白的 細胞可能發揮了更廣泛的作用并且可作為整個毛嚢的干細胞而起作用。在 本案中，毛嚢的保留部分，例如，內層根鞘和基質，能夠從表達巢蛋白的 細胞中發源但隨著分化進程可能會丟失巢蛋白的表達。
實施例6 分離毛嚢干細胞
分離表達巢蛋白-GFP的毛嚢突起干細胞并在體外培養。切除毛發生長 終期的巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚樣本并切碎。隨后將切碎的組織在胰蛋 白酶(0.25 %)，膠原酶(0.4 %)和分散酶(l.O %)的混合物中、37。C消化兩小 時。在裝配了熒光光學配件的解剖顯微鏡下分離突起區域中有表達巢蛋白 -GFP細胞的單個毛嚢。接著在焚光解剖顯微鏡下使用精細注射器進一步分 離在毛嚢突起區域表達巢蛋白-GFP的細胞。
實施例6 生長的干細胞
把來自于毛嚢突起區域的表達巢蛋白-GFP的細胞轉移到不含生長因子 添加物的M21培養基中，這是一種用于神經球生長的典型神經維持培養基 (Uchida， N.,等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 14720-14725)。 12天 后，神經球狀集落出現。在另一個實驗中，從毛嚢突起區域分離的表達巢 蛋白-GFP的細胞以10細胞/證2的密度生長在包含曱基纖維素(1.2 %)的神 經干細胞培養基中，每兩天向該培養基中添加生長因子(EGF) (20 ng/ml)、 成纖維細胞生長因子(FGF) (20 ng/ml)和白血病抑制因子(Lif) (10 ng/ml)。當球體在培養基中出現時，將它們轉移到不含曱基纖維素的新平板上。次級 球體也是從一級球體產生的。接著分析這些球體的分化潛能。
實施例7
B16F10鼠科動物黑色素瘤細胞和巢蛋白表達
下面顯示用B16F10鼠科動物黑色素瘤細胞在體內和體外模擬內皮細 胞的行為和血管發生過程。在體外腫瘤細胞的索形成(cord formation)是由缺
體(VEGF受體2)的抗體所抑制。
B16F10鼠科動物黑色素瘤細胞系(B16F10)生長在DMEM培養基、10% FCS、 37 °C、 5。/。C02的條件下。將DsRed-2基因(CLONTECH)插入到基于 逆轉錄病毒的哺乳動物表達載體pLNCX (CLONTECH)中以形成pLNCX DsRed-2載體。逆轉錄病毒的生產是通過將pLNCX DsRed-2轉染進入PT67 包裝細胞進行的，這種包裝細胞產生包含DsRed-2基因的逆轉錄病毒上清 液。
B16F10在包含15%FCS的RPMI 1640培養基(GIBCO)中培養。感染前 24小時，將70%的融合PT67/RFP細胞轉移到含7% FBS培養基的新鮮 DMEM中。耙標細胞在感染前以1-2 x105每60 mm平4反的纟田月包密l,甫才反 生長18小時。
把感染的B16F10細胞移植到宿主nu/nu小鼠中并且允許腫瘤細胞生 長。定位腫瘤樣本并將其與正常組織一起切除以進行熒光顯微觀察。通過 包含熒光蛋白的血管的出現，顯微圖像表明出血管發生活性的存在。
實施例8
皮膚中來自表達巢蛋白的毛囊細胞的新生血管
攜帶處于巢蛋白第二內含子增強子控制下的GFP的轉基因小鼠 (ND-GFP)被用于對自更新和多能CNS干細胞的研究和顯影。如由巢蛋白調 控的GFP表達所證明的，毛嚢干細胞強烈表達巢蛋白。
對于下面討論的結果，使用裝配了汞燈動力電源的Olympus IMT-2反轉 顯微鏡(Melville, NY)進行焚光顯微觀察。熒光顯微鏡有一套GFP濾光鏡 (Chroma Technology, Rockingham, VT)。同時也使用了安裝在具有Plan ApoIO倍物鏡的Nikon Optiphot上的MRC-600共聚焦成像系統(Bio-Rad)直接觀 察具有GFP表達的皮膚組織。
依照制造商的說明書，在空氣干燥的皮膚和冷凍切片中進行了針對 CD31和von Willebrand因子(VWF)的免疫組織化學染色，其中對于CD31 使用抗大鼠Ig辣根過氧化物酶(HRP)檢測試劑盒(BD Biosciences)或對于 VWF使用抗兔Ig (HRP)檢測試劑盒(BD Biosciences)。 CD31 mAb (CBL1337) 從Chemicon購得。VWF多克隆抗體(A0082)從DAKO購得。底物發色團 3， 3'-二氨基聯苯胺染色被用于進行檢測。
毛發初始生長期小鼠皮膚巢蛋白表達的顯影
使用轉基因ND-GFP小鼠(6-8周大具有幾乎專一的毛發生長終期(靜止 期)毛嚢)進行毛發初始生長期小鼠皮膚中巢蛋白表達的顯示。使用三溴乙醇 (tribromoethanol)(i. p.注射量，0.2mll.2%溶液/10g體重)麻醉小鼠。使用 用熱的松香和蜂蠟混合物對小鼠進行脫毛以誘導毛發初始生長。
當毛嚢處于毛發初始生長早期時，脫毛前和脫毛后第48和72小時在 麻醉狀態下切除背部皮膚樣本。皮膚樣本分成3部分， 一部分用于熒光顯 微檢測而其它的用于冷凍切片或者空氣干燥片段。用于冷凍切片的樣本包 埋入組織冷凍包埋培養基(DAKO)中并冷凍在-80。C過夜。用Leica CM1850 (Leica, Deerfield， IL)低溫切片機切出5pm厚的切片并進行空氣干燥。


圖1顯示了從ND-GFP轉基因小鼠的背側皮膚真皮側的視圖。圖IA顯 示了來自轉基因小鼠背部皮膚的相差顯微圖像。皮脂腺體(向下的箭頭)位于 發干(向上的箭頭)周圍。圖IB顯示了相差顯微圖像加上GFP的熒光。 ND-GFP細胞在毛嚢突起區域中是可見的并且也可以看見血管。毛嚢突起區 域位于皮脂腺下方。
圖1C顯示了 GFP的熒光。可以看見ND-GFP血管連 接于ND-GFP毛嚢。圖ID表示毛發生長終期毛嚢的示意圖，其中顯示了 ND-GFP毛嚢突起區域和血管網絡的位置。
圖1E也顯示了 GFP的焚光。可 見ND-GFP血管與ND-GFP毛嚢突起區相聯系。本圖中標尺代表100pm的 距離。
如
圖1A-D中所見，表達巢蛋白的毛嚢和ND-GFP-標記的皮膚脈管網絡 相互連接。免疫組織化學染色顯示脈管展示(display)CD31抗原和VWF，表
明它們是血管。ND-GFP觸須毛嚢到棵鼠創傷皮膚的移植
為了移植目的，通過手術獲得ND-GFP轉基因小鼠的觸須毛嚢。麻醉 轉基因小鼠并在無菌環境下進行所有的手術過程。切下包含觸須墊的上唇， 暴露其內表面。在雙目顯微鏡下切分毛嚢并使用精細鑷輕輕的沿著頸口從 墊上拔起以摘下毛嚢。隨后將所有的毛嚢保存在包含B-27添加物 (GIBCO/BRL)的DMEM/F-12培養基中。
如上所述，用三溴乙醇麻醉受體棵鼠。將完整厚度的皮膚樣本進行折 疊并且使用2-mm活檢穿孔器產生兩個分開約15mm的相鄰完整厚度傷口。 隨后移植ND-GFP觸須毛嚢。使用尼龍線(6-0)縫合切口。進一步切割移植 后小鼠的皮下組織樣本并通過熒光顯微鏡直接觀察，并且進行空氣干燥或 者準備冷凍切片以用于免疫組織化學染色。創傷后IO天麻醉小鼠并切下創 傷皮膚樣本進行分析。
圖2A-G顯示了移植到棵鼠的皮下組織的ND-GFP觸須毛嚢圖像。圖 2A顯示了移植28天后毛嚢的相差顯微圖像。預先存在的血管顯示在圖像 的底部。圖2B顯示了相同毛嚢的相差顯微圖像加上GFP的焚光。在這張 圖像中顯示出巢蛋白陽性血管和預先存在的血管相互連接。圖2C顯示了移 植后毛嚢的GFP熒光的圖像。在圖2B和2C中，可以看見ND-GFP血管從 移植后的ND-GFP毛嚢中生長出來并且和棵鼠皮膚中預先存在的血管聯系 在一起。圖2D和2E顯示了圖分別來自2B和2C的高放大倍數圖像。(f和 g)圖2F和2G顯示共定位的GFP信號和內皮細胞標記物CD31的圖像。圖 2F是熒光圖像，圖2G顯示空氣干燥并用CD31進行免疫組織化學染色的相 同視野的圖像。(標尺，100pm)
到第3天從移植后4果鼠皮膚的ND-GFP毛嚢中探測到了 ND-GFP脈管 的生長。正如在上面關于圖2所討論的，到28天，表達巢蛋白-GFP的脈管 已經發育成廣泛的分支網絡并且與受試棵鼠中存在的脈管交叉合流。免疫 組織化學染色顯示CD31抗原和GFP熒光共定位在新生血管中。
在棵鼠腎嚢下方移植ND-GFP觸須毛嚢細胞
按上述方式收獲觸須毛嚢。接著將所有的毛嚢保存在包含B-27添加物 的DMEM/F-12培養基中并置于冰上，直至將它們移植到6-8周大的"w/做 小鼠的腎嚢下方，這些小鼠按照上述方法麻醉。在受試小鼠的左側腹肋切 開，暴露出腎臟。將兩個毛嚢插入到腎嚢下方。再將腎臟放回原位，并且使用尼龍線(6-0)縫合切口 。在14天將每個移植鼠的腎臟切下并使用熒光顯
微鏡直接觀察。
圖3A-C顯示了移植的ND-GFP觸須毛嚢在棵鼠腎嚢下的圖像。可以看 到移植后14天ND-GFP脈管形成了網絡，這可通過相差顯微圖像(圖3A)、 相差顯微圖像加上GFP熒光(圖3B)和GFP熒光圖像(圖3D)看到。(標 尺，100pm)。 ND-GFP脈管顯示出與預先存在的血管發生交叉合流。
將ND-GFP觸須毛嚢移植到棵鼠腎嚢下方之后，第14天被觀察到圍繞 著移植的毛囊的ND-GFP血管網絡。ND-GFP脈管顯示出與預先存在的血管 發生交叉合流。
創傷皮膚中來自移植毛囊的ND-GFP脈管的增強生長
收獲包含移植的ND-GFP觸須毛發嚢的受創傷皮膚樣本用于熒光顯微 觀察。圖4A顯示了移植前分離的ND-GFP觸須毛嚢。圖4B顯示了移植后 10天棵鼠受創傷皮膚中的ND-GFP觸須毛嚢圖像。可以看見ND-GFP脈管 從ND-GFP觸須毛嚢向正在愈合的傷口的生長。圖4C和4D顯示了來自圖 4B區域的高放大倍數圖像，顯示為白色陰影框。圖4E是ND-GFP觸須毛 嚢移植進入創傷棵鼠皮膚的示意圖。(標尺，lOOpm)
圖4的影像顯示出ND-GFP脈管從毛嚢向傷口生長。在移植的毛嚢附 近出現的傷口顯著地增強了脈管的生長。顯然，起源于毛嚢的脈管能夠響 應于傷口附近產生的血管發生信號。免疫組織化學染色顯示出CD31在生長 到傷口里的表達ND-GFP的脈管中表達。
討論
血管發生，毛細血管高度活躍的生長與破壞，已經在理解組織維持、 創傷修復和惡性腫瘤生長中占據了日益重要的角色。識別新血管的細胞來 源已經在學術上和治療方案中越來越重要。已經有大量的關于內皮細胞由 骨髓來源的干細胞生成的最近報道。這也是內皮干細胞可以從脂肪組織中 衍生的證據。然而，由于皮膚獨特的結構，這些先前確認的內皮干細胞的 來源可能不能用于提供皮膚血管。上面提供的結果顯示出先前未認識到的 毛嚢干細胞的重要功能是提供能在皮膚中形成血管的內皮細胞。
毛嚢干細胞的全部潛能可能比這里報道的更加廣泛。 一些調查發現從 哺乳動物真皮層分離出的成熟多潛能干細胞一稱作由皮膚衍生的前體一可 以在培養中增殖并分化成神經元、神經膠質、平滑肌細胞和脂肪細胞。然而，這些干細胞在皮膚中的確切定位還是未知的，它們的功能也是不清楚 的。本篇報道指出毛嚢是用于皮膚血管的干細胞的重要來源并且很可能也 可以用于其它組織。這些結果支持了毛嚢細胞對創傷修復和皮膚移植物的 存活有重要意義的報道。
實施例9
用于篩選血管發生促進復合物的血管發生模型
為了實現移植目的，如實施例8所述，手術收獲來自ND-GFP轉基因 小鼠的觸須毛嚢。隨后將所有毛嚢保存在含有B-27添加物(GIBCO/BRL)的 DMEM/F-12培養基中。
麻醉受試棵小鼠，將一個完整厚度的皮膚樣本進行折疊并且使用2-mm 活檢穿孔器產生兩個分開約15 mm的相鄰完整厚度傷口 。隨后移植ND-GFP 觸須毛嚢。使用尼龍線(6-0)縫合切口。
小鼠分為實驗組和對照組。實驗組接受了一系列的處理，包括血管內 皮生長因子、包含在可藥用載體中的已知的血管發生促進復合物。對照組 小鼠只接受載體。
處理后，繼而切下移植小鼠的皮下組織樣本并直接在熒光顯微鏡下觀 察，并且進行空氣干燥或準備進行用于免疫組織化學染色的冷凍切片。從 實驗組和對照組中獲得樣本中血管發生活性的程度。同對照組樣本相比實 驗組樣本顯示了基于GFP活性總量的高度的血管發生活性。
本實施例顯示出披露的模型系統具有篩選血管發生試劑的用途。
實施例10
用于篩選血管發生移植復合物的血管發生模型
為了移植目的，如實施例8所述，通過手術獲得來自ND-GFP轉基因 小鼠的觸須毛嚢。隨后將所有毛嚢保存在含有B-27添加物(GIBCO/BRL)的 DMEM/F-12培養基中。
麻醉受試棵鼠，將完整厚度的皮膚樣本進行折疊并且使用2-mm活檢穿 孔器產生兩個分開約15 mm的相鄰完整厚度傷口。隨后移植ND-GFP觸須 毛嚢。使用尼龍線(6-0)縫合切口。小鼠分為實驗組和對照組。實驗組接受了 一系列的處理包括血管抑制 素、包含在可藥用載體中的已知的血管發生抑制復合物。對照組小鼠只接
受載體。
處理后，繼而切下移植小鼠的皮下組織樣本并直接在熒光顯微鏡下觀 察，并且進行空氣干燥或準備進行用于免疫組織化學染色的冷凍切片。從 實驗組和對照組中獲得樣本中血管發生活性的程度。同對照組樣本相比實
驗組樣本顯示了基于GFP活性總量的降低程度的血管發生活性。
本實施例顯示出披露的模型系統具有篩選抗血管發生試劑的用途。
實施例11
將表達FP的毛嚢細胞移植入FP轉基因宿主
在轉基因小鼠中制備表達ND-GFP的觸須毛嚢細胞。將轉基因宿主生 物，履/歷小鼠進行改造以便表達巢蛋白調控下的RFP。如實施例8所討論 的，將表達ND-GFP的觸須毛嚢細胞移植到在ND-RFP轉基因宿主生物體 中制造的皮膚傷口中。
收獲包含移植的ND-GFP觸須毛嚢細胞的創傷皮膚樣本用于熒光顯微 觀察。移植前對分離的ND-GFP觸須毛嚢進行顯微觀察。移植10天后顯示 受創傷的nu/nu ND-RFP小鼠皮膚中的ND-GFP毛嚢的圖像。可以看見 ND-GFP脈管從ND- GFP觸須毛嚢向正在愈合的傷口生長。還能看見從傷 口中伸出的ND-RFP脈管。
權利要求
1.一種監測血管發育的方法，包括提供血管發生干細胞，其中所述干細胞包含表達盒，該表達盒編碼在巢蛋白調控元件遺傳控制下的熒光蛋白；在宿主中培養所述干細胞；和監測導致血管發育的干細胞血管發生活性。
2. 權利要求1的方法，其中所述血管發生干細胞是表達巢蛋白的細胞。
3. 權利要求2的方法，其中所述表達巢蛋白的細胞是毛嚢細胞。
4. 權利要求3的方法，其中所述毛嚢細胞生長在體外培養物中。
5. 權利要求2的方法，其中所述表達巢蛋白的細胞是腫瘤細胞。
6. 權利要求5的方法，其中所述腫瘤細胞來自選自黑色素瘤、神經膠 質瘤、血管母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤和腦膜瘤組成的組的腫瘤類 型。
7. 權利要求l的方法，其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、 紅色熒光蛋白(RFP)、藍色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)組成的組。
8. 權利要求l的方法，其中所述巢蛋白調控元件是由人巢蛋白基因第 二內含子編碼的。
9. 權利要求l的方法，其中所述宿主生物是脊推動物生物體。
10. 權利要求9的方法，其中所述宿主生物體是哺乳動物或鳥類。
11. 權利要求10的方法，其中所述哺乳動物宿主選自小鼠、大鼠、兔、 犬和貓組成的組。
12. 權利要求9的方法，其中所述宿主生物體是雞或者雞卵。
13. 權利要求l的方法，其中所述血管發生千細胞包含處于巢蛋白調 節控制下的第一熒光蛋白，并且宿主生物包含處于巢蛋白調節控制下的第 二熒光蛋白，其中的第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。
全文摘要
本發明涉及使用表達巢蛋白的干細胞顯像新生血管的血管發生模型。公開的發明涉及這樣的觀察結果，即巢蛋白表達是內皮細胞增殖的標記。巢蛋白表達作為標記對于血管發生，特別是對于與腫瘤相關的血管發生特別有用。具體地，巢蛋白可以作為針對諸如神經膠質瘤、血管母細胞瘤、神經鞘瘤、髓母細胞瘤、和腦膜瘤的腦部腫瘤的極好的內皮標記物而起作用。因此，公開的發明涉及這種標記作為模型化血管發生活性的基礎的用途。
文檔編號A01K67/027GK101514356SQ200910133849
公開日2009年8月26日 申請日期2004年10月28日 優先權日2003年10月28日
發明者天羽康之, 平 姜, 李玲娜, 萌 楊 申請人:抗癌公司