一種促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法
【專利摘要】本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法。本發明方法從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得大量脂肪源細胞，同時采用納米分子探針標記，MRI動態示蹤其對不同時期血管損傷的修復，經體外實驗驗證了GFP-ADSCs能高表達periostin蛋白，periostin能調控脂肪干細胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；經體內實驗顯示了過表達periostin的ADSCs體內移植能促進缺血下肢血管新生。本發明方法能為臨床實踐中改善干細胞移植治療嚴重肢體缺血性疾病的療效提供新的參考策略和思路。
【專利說明】—種促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法。
【背景技術】
[0002]隨著人口的老齡化和飲食結構的改變,動脈粥樣硬化(arterial sclerosis, AS)所導致的外周動脈疾病(PAD)的發病率逐年升高，周圍動脈閉塞或狹窄引起的肢體缺血、缺氧、壞死嚴重影響和危害中老年人的健康。目前臨床上現有技術的內科藥物治療、外科手術和腔內介入治療(球囊擴張及支架)等方法，雖能不同程度地改善患者的病情和預后，但部分患者的遠期療效尚不理想，對部分已失去手術和介入治療機會的終末期患者甚至面臨截肢的嚴重后果。因此，急需尋找一種新的治療方法來提高療效、改善下肢缺血患者的預后。
[0003]隨著再生醫學及臨床轉化醫學研究的進展，干細胞移植治療缺血性疾病展現了較好的臨床應用前景，為下肢缺血患者帶來新的希望。有研究發現，與自體骨髓和外周血干細胞相比，脂肪組織供區豐富，脂肪干細胞(ADSCs)采集更方便、體外擴增能力更強，免疫源性相對較低。已有研究相繼證實將自體或異體脂肪干細胞(ADSCs)移植用于缺血下肢的治療，可以促進新生血管的形成，但同時國內外大量文獻及本申請發明人的前期研究結果均表明該干預方案對嚴重肢體缺血性疾病的療效不佳，其療效尚有待提高。研究還進一步證實:移植的ADSCs在缺血部位的存活、遷移歸巢及促進血管新生的能力均顯減弱，是影響療效的關鍵。
[0004]Periostin從小鼠成骨細胞系MC3T3_ElcDNA文庫中克隆出的一種具有調節成骨細胞分化和粘附的功能骨粘附分子(Takeshita ;1993年)，曾命名為成骨細胞特異因子(0SF-2),其為細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白的一種。1999 年 Horiuchi 等在骨膜和牙周韌帶中發現該蛋白并重新命名為periostin。所述Periostin蛋白的分子量約為90KDa，其包含的四個氨基酸序列與果蠅的成束蛋白基因fasciclin I (FAS I)密切相關。之前的研究認為該蛋白僅特異性表達于骨組織，目前越來越多的研究證實其在牙周韌帶、皮膚、腫瘤、心臟瓣膜等組織中均有表達。還有研究發現periostin在正常的血管組織中不表達，但當肌肉、血管受到損傷、低氧等刺激時卻表達升高；因此，相關研究人員推測該periostin蛋白可能與血管損傷修復有著密切的關系。其中,Gyongyosi等發現在頸動脈球囊損傷血管內膜后，periostin蛋白于血管損傷后3天及7天分別在血管中膜以及血管內膜中開始表達，且在血管損傷的晚期階段28天仍在血管內膜中高表達；Stanton等發現在平滑肌細胞中過表達periostin基因能夠顯著增強細胞的遷移能力，而periostin特異性抗體能阻斷該效應；同時發現缺氧可誘導periostin蛋白在肺動脈血管平滑肌中表達，表明在慢性缺氧狀態下periostin蛋白可參與肺血管的重構；臨床實踐研究觀察到，下肢缺血或組織損傷時導致的局部肌肉組織處于低灌流狀態，其必然導致創傷愈合組織內細胞處于低氧、低營養的應激條件下，業有研究證實低氧能夠直接誘導內皮細胞或者干細胞的凋亡；Ouyang等觀察腫瘤細胞和內皮細胞在低氧刺激下的反應,結果顯示periostin不但能夠抑制低氧狀態下的腫瘤細胞的凋亡，還能抑制應激狀態(低氧、低營養狀態)所誘導的內皮細胞的凋亡；Kuhn及Dorn等研究發現在心肌梗死大鼠模型，經periostin治療數周后心肌細胞重新進入細胞分裂周期并增殖分化，治療組梗死面積較非治療組明顯減小，且梗死區及其周圍區域新生毛細血管及小動脈血管密度均高于非治療組Jiriwardena等采用組織形態學分析方法檢測口腔鱗癌組織中的血管密度，證實過表達periostin的組織中血管密度明顯增高，對體外培養的臍靜脈內皮細胞用不同濃度的periostin處理并進行小管評分，結果顯示periostin能以劑量依賴的方式促進毛細血管新生。上述研究均表明:periostin能夠促進細胞的遷移、歸巢以及新生血管的形成。但是，ADSCs遷移到內皮損傷部位的數量及再內皮化或再血管化的效率較低。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是克服現有技術存在的Periostin在脂肪干細胞(ADSCs)中表達水平低的缺陷和不足，提供一種促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法。
[0006]本發明的方法，以腺病毒為載體，采用基因轉染的方式，使干細胞過表達periostin,經體內、體外試驗證實,所述的periostin能促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生；本發明方法能為臨床實踐中改善干細胞移植治療嚴重肢體缺血性疾病的療效提供新的參考策略和思路。
[0007]具體而言，本發明的促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法，其特征在于，其包括:從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得大量脂肪源細胞，同時采用納米分子探針標記，MRI動態示蹤其對不同時期血管損傷的修復；其包括步驟:
[0008](I)用包括膠原酶和酵素酶的消化酶溶液分離、篩選獲得干細胞，本發明的實施例中獲取的干細胞為實驗GFP小鼠的脂肪源細胞(GFP-ADSCs)，對脂肪源細胞進行免疫熒光鑒定及流式分析鑒定；
[0009](2)以腺病毒為載體，采用基因轉染的方式，periostin轉染GFP-ADSCs，使GFP-ADSCs過表達調控蛋白；
[0010](3)檢測periostin調控脂肪干細胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的水平；
[0011](4)相關通路阻斷劑等共培養檢測GFP-ADSCs遷移、誘導分化能力、低氧抗凋亡能力，測定periostin調控ADSCs的抗凋亡、促增殖、促遷移能力的變化；
[0012](5)檢測獲得的過表達periostin的GFP-ADSCs在缺血組織中存活及遷移浸潤及促血管新生能力。
[0013]本發明方法中，步驟⑴中干細胞可為各種干細胞，包括成體干細胞、胚胎干細胞、誘導的全能干細胞；
[0014]本發明方法中，步驟(I)中的消化酶溶液中膠原酶NB4和酵素酶的濃度為
0.05-0.5%:
[0015]本發明方法中，步驟(I)的對脂肪源細胞進行免疫熒光鑒定及流式分析鑒定(CD11B/CD34/CD31/CD45/KDR/CD90/HLA-1/MHC-2 等);
[0016]本發明方法中，步驟(2)的調控蛋白為細胞外基質成分；本發明的一個實施例中，調控蛋白為periostin ；[0017]本發明方法中，步驟(2)的periostin轉染GFP-ADSCs的濃度為0-1000 μ mol/ml，最佳的濃度為10-100 μ mol/ml，標記的細胞量為O-1XlO8 ；
[0018]本發明方法中，通過觀察再生內皮細胞形態，免疫熒光、流式檢測⑶31、vWF, SMA的表達情況；
[0019]本發明方法中，進行部分標本的組織學觀察(HE，油紅，免疫熒光染色，透射電鏡等)，觀察小血管的密度及數量；
[0020]本發明方法中，通過Western-blot和Realtime-PCR測定periostin調控脂肪干細胞粘附、遷移及促進血管新生的能力。
[0021]本發明方法，從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得大量脂肪源細胞，同時采用納米分子探針標記，MRI動態示蹤其對不同時期血管損傷的修復，經體外實驗驗證了 GFP-ADSCs能高表達periostin蛋白,periostin能調控脂肪干細胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；經體內實驗顯示了過表達periostin的ADSCs體內移植能促進缺血下肢血管新生。本發明方法能為臨床實踐中改善干細胞移植治療嚴重肢體缺血性疾病的療效提供新的參考策略和思路。
[0022]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1:從GFP轉基因小鼠腹股溝脂肪組織中分離獲得GFP-ADSCs，
[0024]圖A為P3代光鏡下GFP-ADSCs，圖B為熒光顯微鏡下ADSCs發綠色熒光；流式檢測發現ADSCs高表達干細胞的特異性標記⑶90、⑶105、Sca-l，而造血系及內皮細胞系等標記⑶I lb、⑶31、⑶34、⑶45、⑶83、⑶133表達較低，免疫源性MHC-2陰性。
[0025]圖2:圖A為免疫熒光染色鑒定periostin在轉染及未轉染的GFP-ADSCs的表達情況，可見經轉然后P-ADSCs高表達periostin蛋白；圖B為Western Blot檢測轉染及未轉染的GFP-ADSCs表達periostin的差異；圖C數據統計圖進一步證實P-ADSCs高表達periostin 蛋白。
[0026]圖3 =Annexin檢測低氧培養條件下GFP-ADSCs的凋亡情況，其中顯示，經periostin基因轉染的GFP-ADSCs可以減少細胞的凋亡。
[0027]圖4:研究證實GFP基因可以示蹤ADSCs促進缺血下肢的血管新生，但是新生血管數量及密度較低，其中，
[0028]A為熒光顯微鏡下可以觀察示蹤色的GFP-ADSCs ；B為ADSCs可以促進血管新生，但是新生血管數量及密度較低。
[0029]圖5:經periostin基因轉染的GFP-ADSCs可以明顯促進缺血下肢的血管新生,新生血管較多，其中，M為⑶31染色；N為SMA染色；0為F4/80染色；P為MAC-3染色。
【具體實施方式】
[0030]實施例1促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生實驗，[0031](I)體外實驗:研究periostin調控脂肪干細胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；
[0032]GFP轉基因小鼠腹股溝脂肪組織中經消化酶溶液處理分離獲得GFP-ADSCs，以腺病毒為載體，采用基因轉染的方式，使GFP-ADSCs過表達periostin及相關通路阻斷劑等共培養檢測GFP-ADSCs體外遷移、多向誘導分化能力、低氧抗凋亡能力測定，結果顯示，GFP-ADSCs高表達periostin蛋白，經periostin基因轉染的GFP-ADSCs可減少細胞的凋亡；熒光顯微鏡下ADSCs發熒光；流式檢測顯示ADSCs高表達干細胞的特異性標記⑶90、CD105、Sca-Ι，而造血系及內皮細胞系等標記CDllb、CD31、CD34、CD45、CD83、CD133表達較低，免疫源性MHC-2陰性；
[0033]所述的periostin轉染GFP-ADSCs的濃度為0-1000 μ mol/ml,標記的細胞量為O-1XlO8 ；
[0034]所述的的消化酶溶液中膠原酶NB4和酵素酶的濃度為0.05-0.5% ；
[0035](2)體內實驗:測定過表達periostin的ADSCs體內移植促進缺血下肢血管新生的能力；
[0036]將獲得的過表達periostin的GFP-ADSCs，體內移植修復Apo E基因敲除的動脈粥樣硬化小鼠下肢缺血，測定過表達periostin的GFP-ADSCs在缺血組織中存活及遷移浸潤能力，以及缺血組織的新生血管密度及肢體缺血的變化；
[0037]其中，通過觀察再生內皮細胞形態，免疫熒光、流式檢測⑶31、vWF, SMA的表達情況；部分標本進行組織學觀察(HE，油紅，免疫熒光染色，透射電鏡等)，觀察小血管的密度及數量；通過Western-blot和Realtime-PCR探討periostin調控脂肪干細胞粘附、遷移及促進血管新生能力；結果顯示，ADSCs可促進血管新生，但是新生血管數量及密度較低；經periostin基因轉染的GFP-ADSCs可明顯促進缺血下肢的血管新生，新生血管較多，本發明方法，經體外實驗驗證了 periostin調控脂肪干細胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；經體內實驗顯示了過表達periostin的ADSCs體內移植能促進缺血下肢血管新生。
【權利要求】
1.一種促進干細胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法，其特征在于，其包括:從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得脂肪源細胞，同時采用納米分子探針標記，MRI動態示蹤其對不同時期血管損傷的修復；其包括步驟: (1)用包括膠原酶和酵素酶的消化酶溶液分離、篩選獲得干細胞或脂肪源細胞，對脂肪源細胞進行免疫熒光鑒定及流式分析鑒定； (2)以腺病毒為載體，采用基因轉染的方式，periostin轉染脂肪源細胞使脂肪源細過表達調控蛋白； (3)檢測periostin調控干細胞或脂肪源細胞粘附、遷移及低氧刺激下抗 凋亡的水平； (4)相關通路阻斷劑共培養檢測干細胞或脂肪源細胞遷移、誘導分化能力、低氧抗凋亡能力，測定periostin調控干細胞或脂肪源細胞的抗凋亡、促增殖、促遷移能力的變化； (5)檢測獲得的過表達periostin的干細胞或脂肪源細胞的存活及遷移浸潤及促血管新生能力。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中干細胞為成體干細胞、胚胎干細胞或誘導的全能干細胞。
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的消化酶溶液中膠原酶NB4和酵素酶的濃度為0.05-0.5%。
4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)的對脂肪源細胞進行CDllB/⑶34/⑶31/⑶45/KDR/⑶90/HLA-1/MHC-2免疫熒光鑒定及流式分析鑒定。
5.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的調控蛋白為細胞外基質成分，選自調控蛋白periostin。
6.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的periostin轉染脂肪源細胞的濃度為Ο-ΙΟΟΟμπιοΙ/ml，標記的細胞量為0-1 X 108。
7.按權利要求6所述的方法,其特征在于,所述步驟(2)的periostin轉染脂肪源細胞的濃度為 10-100 μ mol/ml。
8.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通過觀察再生內皮細胞形態，免疫熒光、流式檢測CD31、vWF、SMA的表達情況。
9.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，通過HE，油紅，免疫熒光染色和透射電鏡檢測組織標本的小血管的密度及數量。
10.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，通過Western-blot和Realtime-PCR測定periostin調控脂肪干細胞粘附、遷移及促進血管新生的能力。
【文檔編號】C12Q1/68GK103969442SQ201310041328
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月1日 優先權日:2013年2月1日
【發明者】陸信武, 秦金保, 李祥祥, 葉開創, 楊心蕊, 蔣米爾 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院