專利名稱：代謝活性微生物及其生產方法
技術領域：
本發明涉及代謝活性細菌的制備物、包含此制備物的組合物例如益生素補充物或動物飼料及其用途，例如在治療疾病中的用途。本發明還涉及微生物的生長基質，該生長基質包含復合和簡單糖的混合物，和利用此生長基質制造有代謝活性微生物制備物的方法。
背景技術：
通常使用微生物有機體作為食品補充物。一個實例是已知對腸道微生物群落具有有益影響的益生菌，其可增加對傳染性疾病比如腹瀉的抵抗力。益生素還顯示出涉及血液化學修飾和免疫調節(見參考文獻部分中列在潛在健康益處之下的參考文獻)。
益生菌可在乳制品比如酸奶中發現并且已知有益健康的菌種包括那些來自腸球菌屬和乳桿菌屬的菌種。然而，益生素乳制品的保存期很短。消費者也能買到粉末或片劑形式的益生素。益生素另外的應用涉及在動物飼料中的使用。
目前保存細菌培養物的方法通常使用凍干法，也被稱作冷凍干燥法。在此方法中，通過升華作用從生物體除去水并且在加入水后生物體可以復活。然而，凍干的細菌沒有代謝活性并且眾所周知的是凍干的產物在室溫下保存幾周后通常喪失了它們大部分的復原能力(Fonseca et al andMurga et al)。
此外，許多商業益生素似乎并不包含標簽上所提及的所有菌種，并且存在的細菌中活細菌量經常是非常低的(J.Hamilton-Miller)。
現在本發明人已經確認，活的、有代謝活性細菌的穩定制備物可使用特定的生長基質來制備，該生長基質包含平衡量的復合和簡單碳水化合物。與現有技術中的益生素相比，根據本發明提供的制備物包含大量可在長期儲存期間保持穩定和活性的細菌。
發明內容
本發明的第一方面提供了包含活的、有代謝活性的細菌的制備物以及包含復合和簡單碳水化合物的混合物的生長基質，其中細菌表現出平衡的生長狀態，該狀態的特征在于當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時，細菌群保持穩定的水平。
本發明的一個基本特征是，在此制備物中細菌培養物可以在4℃、控制pH條件下至少5個月期間維持平衡狀態。在此狀態中，維持細菌的增殖率接近其死亡率。在優選實施方案中，接近平衡狀態的有代謝活性細菌群維持在108-109個活細胞/ml制備物。
所述生長基質包含復合和簡單碳水化合物(糖)的混合物。在本文中使用的術語“復合碳水化合物”或“復合糖”包括寡糖和多糖，而術語“簡單碳水化合物”或“簡單糖”包括單糖和二糖。
優選的是，生長基質中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml。在優選實施方案中，總的糖濃度為約30mg/ml，還原糖的濃度為約10mg/ml。
所述生長基質優選還包含蛋白質和肽成分。典型的是，基質中存在的蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，高分子量肽(分子量大于5000道爾頓)的總量為100μg/ml-300μg/ml。在特定的實施方案中，蛋白質和肽的濃度可以是約2mg/ml，高分子量肽的濃度可以是約250μg/ml。
所述生長基質可以包含另外的成分，例如纖維素、淀粉、β-葡聚糖、戊聚糖、多酚、核糖核酸、脂質、磷酸鹽、類黃酮(flavenoids)、氨基酸、維生素(B1、B2、C和E)、硅酸鹽和微量元素。
在優選實施方案中，生長基質來源于發芽的谷物。最優選的是，用下文描述的方法制備生長基質。
本發明比目前的益生素制備物具有優勢，因為有代謝活性細菌可以保存許多個月而沒有退化或喪失活性。目前使用的凍干細菌制備物通常即便有也只含很少的有代謝活性細菌。此外，凍干的細菌制備物一旦再水化，將喪失它們的一些特性和活性。同樣，再活化細菌的貯藏壽命很短并且只能保存很短的時間。在用于宿主動物之前，凍干的細菌通常不被再水化。如果它們被再水化，那么它們必須在當天使用，否則活力將迅速喪失并且會因為污染生物而腐敗。
現有技術的凍干制備物的另一個問題是吸濕(從空氣中吸收水分)并且因此包裝物必須在開封后的幾天內使用，否則部分的水化作用將引起活力的快速喪失。
根據本發明的制備物避免了上面列舉的有關使用凍干的細菌培養物的問題。此外，發明人也顯示了根據本發明制備的細菌培養物比通過現有技術中的已知方法制備的細菌明顯更加強壯，其能夠使細菌在宿主動物體內更快地定居并且能容忍哺乳動物消化道的苛刻環境(在實施例5中舉例說明)。
發明人已經克服了常規上使用的制備物的問題，通過使用具有平衡營養供給的，復合和簡單糖、蛋白質和肽形式的生長基質，并結合控制pH和冷藏條件。在這些條件下，制備物中的細菌持續緩慢地生長。溫度、pH、階段生長和基質的組合強制形成了接近平衡的生長狀態，從而活的、有代謝活性細菌的高濃度可以維持至少5個月。
在一個實施方案中，保存時維持制備物的pH為3.8-4.5。在一個特定實施方案中，保存期間制備物的pH維持在約4.0。可通過加入合適的緩沖劑或緩沖試劑的組合來方便地控制制備物的pH。優選的緩沖劑包括，例如，檸檬酸三鈉或磷酸緩沖劑。本領域的標準方法描述了緩沖劑，比如檸檬酸三鈉或磷酸緩沖劑的使用。
在優選實施方案中，制備物中的細菌是乳酸菌。在本文中使用的術語“乳酸菌(LAB)”描述的是一組革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、非運動性厭氧細菌，它們將碳水化合物發酵成乳酸。這個組包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和腸球菌屬(Enterococcus)。
在優選實施方案中，所述細菌屬于乳桿菌屬或腸球菌屬。在最優選實施方案中，乳酸菌屬于以下菌種中的至少一種屎腸球菌(Enterococcus faecium)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。在一個優選實施方案中，使用屎腸球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌的組合。
所述制備物還可以包含抗真菌劑，例如滅菌的山梨酸鉀和/或抗氧化劑，比如維生素C。
在本發明第二方面中還提供了包含碳水化合物復合混合物的微生物(特別是細菌)的生長基質。所述生長基質包括包含糖的單體、二聚體、低聚體和多聚體的復合和簡單糖的混合物。
在上面有關本發明第一方面的描述中基本上給出了生長基質的優選特征。因此，生長基質中存在的碳水化合物(簡單糖加上復合糖)總量優選為20mg/ml-40mg/ml，更優選25mg/ml-35mg/ml和最優選約30mg/ml。在這個總碳水化合物(糖)含量中，還原糖(單糖)的總量優選為5mg/ml-20mg/ml，更優選5mg/ml-15mg/ml和最優選約10mg/ml。
盡管簡單和復合碳水化合物是生長基質的關鍵成分，應該理解的是生長基質還可以包含另外的成分，比如提供細菌生長氮源的蛋白質。由此生長基質優選包含的蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，優選約2mg/ml。在這個總的蛋白質/肽含量中，高分子量肽(分子量大于5000道爾頓)的總量可以是100μg/ml-300μg/ml，典型的為約250μg/ml。生長基質中蛋白質和肽成分的準確特征(例如氨基酸序列)通常不是本發明的內容。
所述生長基質可包含另外的成分，例如纖維素、淀粉、β-葡聚糖、戊聚糖、多酚、核糖核酸、脂質、磷酸鹽、類黃酮(flavenoids)、氨基酸、維生素(B1、B2、C和E)、硅酸鹽和微量元素。基質中這些額外成分的準確特征和相對量沒有特定的限制。如果優選的話，生長基質是源自天然植物來源，例如發芽的谷物，這些另外的成分通常是天然存在的生物分子。
所述生長基質可包含各種添加物比如緩沖劑和其它用來改善基質性能和/或延長保存期的物質。這樣的添加物可以包括，例如，抗真菌劑、抗氧化劑等。
在優選實施方案中，所述生長基質可以包含顆粒物質，例如直徑不超過1mm的顆粒。
可從發芽的谷物開始使用下文描述的制造方法制備生長基質。然而，本發明不限于根據此方法制備的基質。可以用合成的方式制備顯示基本相似特性的生長基質，例如將必需的復合和簡單碳水化合物與上面列舉的任何另外成分一起進行混合。
本發明的另一方面提供了制備微生物的生長基質的方法，所述方法包括 將發芽的谷物糖化，其中混合發芽的谷物與水成液并置于限制復合碳水化合物向簡單碳水化合物轉化程度的時間和溫度條件下，從而獲得復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽的混合物，和 從經過處理的發芽谷物中分離復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽的混合物，從而獲得生長基質。
本文中使用的術語“發芽的谷物”或“麥芽”表示用麥芽制造方法處理谷物的產物。在釀造領域中麥芽制造是眾所周知的方法。
在典型的麥芽制造方法中，使谷物發芽以誘導貯存營養物的活動化(mobilisation)。發芽的種子產生大量酶以動員(mobilize)貯存的蛋白質和碳水化合物，包括將淀粉水解成麥芽糖的α-淀粉酶。優選的實施方案涉及大麥的使用，但是在本發明的范圍內可以使用其它谷物，比如稻、小麥、玉米和燕麥或甚至它們的混合物。發芽的方法通常是眾所周知的。應該理解的是可以通過提供發芽的谷物或包含碳水化合物、蛋白質和酶混合物的合成基質來實施本方法。
優選的是，在進一步的處理之前碾壓發芽谷粒。通過碾壓使谷物破裂促進了糖化步驟中水的進入和營養物的提取，同時避免谷物粉碎以參與隨后從經過處理的發芽的谷物中分離生長基質。
制備的麥芽經過糖化步驟，該步驟類似于釀造方法中所用的糖化步驟(例如見Kunze，W.Technology Brewing and Malting(1996))。術語“糖化”在釀造領域中是眾所周知的，并且涉及將發芽的谷物在加熱到確定溫度的水中攪動來制備麥芽汁的過程。在糖化步驟中，發芽谷物中的復合碳水化合物被降解成麥芽糖。
本發明的方法也涉及糖化(mash)步驟，其中發芽的谷物與水成液(通常是水)混合并且將混合物加熱至各種規定的溫度。然而，這個糖化步驟與典型啤酒釀造的糖化方法不一致。啤酒釀造的目的在于盡可能多地將碳水化合物轉化成簡單糖，隨后發酵成酒精。與此相比，本發明的方法中特別地選擇糖化步驟的條件從而限制轉化成簡單(還原)糖的程度，剩余相當數量更復雜的低聚體和多聚體形式的碳水化合物。
在非限制性實施方案中，可以限制碳水化合物的轉化程度，使得得到的生長基質中存在的以總碳水化合物含量百分比(w/w)形式表示的簡單(還原)糖的量為10％(w/w)-50％(w/w)。
期望的復合糖向簡單糖有限轉化可通過在短時間內增加糖化步驟中的溫度來實現，典型地為30分鐘，并且不讓發芽谷物/水的混合物在中間溫度靜置。傳統釀造方法包括在60-65℃和70-74℃靜置，因為這使得酶產生高濃度的簡單糖(主要是麥芽糖)。由此，在本發明的優選實施方案中，糖化步驟不包括在60℃-65℃和/或70℃-74℃的溫度下靜置。
在特定的實施方案中，糖化步驟包括將發芽的谷物與水在30℃-45℃的溫度下混合，靜置混合物1-2個小時，在20-40分鐘內使溫度升至75℃-85℃，優選30分鐘，隨后使混合物在75℃-85℃靜置60-90分鐘。在較高的溫度下，混合物中存在的任何酶都將失活并且可以提取營養物。通常優選76℃-80℃，尤其是78℃的較高溫度。在此步驟中，溫度需要在足夠長的時間內足夠的高，從而使制備物中存在的所有酶失活。應該理解的是，所用的溫度和時間可以根據所用谷物的類型稍微改變。
本文描述的方法尤其限制復合糖向簡單糖轉化的量。此外，在30℃-45℃下最初的靜置提供的另外益處在于，它使氨基酸和肽的釋放最大化。通常優選所述范圍內較高一端的溫度，即40℃-45℃或特別是約45℃。此步驟的目的是將谷物中存在的貯存蛋白質水解成可用的氨基酸和肽。實現期望的水解所需的時間和溫度的最佳組合可以根據所用谷物的類型稍微改變。
在用來支持微生物的生長的生長基質中期望存在高濃度的蛋白質、肽和氨基酸，因為它提供了有用的氮源。在傳統釀造中所用的典型糖化方法通常不包括在此溫度范圍內的靜置，因為啤酒制造通常不尋求在打算用來發酵產生酒精的麥芽汁中獲得高的蛋白質或氨基酸含量。
當糖化步驟完成時，例如已經從現有的“經過處理的”發芽谷物中提取了所有期望的營養物，使用任何合適的手段可以從麥糟中分離產生的包含復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽的混合物從而獲得生長基質。典型地這包括粗過濾，例如使用1mm過濾材料比如楔形-鐵絲籃，產生包含粗顆粒的溶液。本發明方法的特征是所述生長基質未被澄清化，正如通常標準釀造中制備麥芽汁的情形。在傳統釀造中，通常將麥芽汁澄清化以去除所有粗的顆粒，由此產生清澈的液體。
在根據本發明方法所制備的生長基質中存在一些顆粒物對隨后用于支持細菌生長是有益處的，因為它即可以緩慢釋放營養物又提供了附著細菌培養物的顆粒表面。
如果是必需的話，根據本發明制備的生長基質可以在進一步應用前進行滅菌。應該理解的是，這能通過煮沸約一小時來實施或者通過在120℃高壓滅菌約20分鐘來實施。
如果需要的話可以向生長基質加入緩沖劑或幾種緩沖成分，例如，如果生長基質隨后將用于制造根據本發明第一方面的細菌制備物。優選的緩沖劑與在有關本發明第一方面中所列舉的緩沖劑一樣。如果生長基質要進行滅菌，緩沖劑可以根據需要在滅菌之前、期間或之后加入。
在本發明另一方面中還涉及生產活的、有代謝活性和穩定的微生物的方法，包括 使微生物在包含復合和簡單糖、蛋白質和肽的混合物的生長基質中生長，從而獲得微生物制備物，和 將得到的制備物冷卻至約4℃，其中微生物處于接近平衡的生長狀態，所述狀態的特征在于當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時，制備物中的細胞群可以維持穩定的水平，和任選地在約4℃保存制備物。
在此方法的優選實施方案中，所述微生物是細菌。
在特定的實施方案中，細菌在生長基質中生長，直到它們的濃度達到2×108-1×109集落形成單位/ml。在這時，培養物(或發酵物)被冷卻至約4℃并且溫度、pH、生長階段和剩余基質組成的組合提供了允許在長期保存期間維持接近平衡生長狀態的平衡條件。在這個可以維持至少5個月的接近平衡狀態中，有代謝活性的細菌群被維持在108-109個活細胞/ml的基本穩定的水平上。然而，應該理解的是，在接近平衡狀態的活細胞的精確量可以根據所用細菌的菌種稍微改變。
根據本發明這個方面的方法包括“生長步驟”，其中微生物(例如細菌)在生長基質中生長，直到它們達到能夠在隨后保存期間實現接近平衡條件的濃度。該方法的重要特征是所用的生長基質提供均衡的營養供應，該營養供應包含復合和簡單糖的混合物，其中碳水化合物含量的很大比例是可用作微生物的能源的復合糖形式。這種混合物幫助在生長步驟期間限制立即可用的能量。生長基質的組成和優選特征優選地如上面有關本發明第一和第二方面中描述的。優選使用本文中描述的制造方法從發芽的谷物制備生長基質。然而，應該理解的是，不必嚴格地使用根據此方法制備的生長基質。使用通過混合所需比例的復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽而合成制備的生長基質可以獲得相似的結果。
在進行生長步驟時，必須注意不能使微生物生長時間過長，以避免產生酸性條件，否則酸性條件將抑制進一步的生長以及限制所得制備物的保存期。另一方面，如果過早地終止生長步驟，這將限制生物量生產。在微生物生長期間，制備物的pH可用作接近平衡狀態的指示器。在典型的實施方案中，乳酸菌培養物可以生長至pH達到4.5+/-0.3個單位。
應該理解的是生長基質的pH可以根據所用微生物(例如細菌)的最佳pH范圍稍微改變。在典型的實施方案中(適用于乳酸菌)，在保存期間pH應該維持在3.8-4.5。優選的是，將緩沖劑，比如檸檬酸三鈉或磷酸鹽加入生長基質從而控制微生物生長期間和隨后保存期間的pH。
應該理解的是，微生物(例如細菌)生長至接近平衡狀態的步驟的準確時機取決于所用菌種。微生物生長可以在任何合適的培養裝置中進行。在特定實施方案中，生長步驟可以在發酵容器中通過發酵的方式進行。
在優選實施方案中，所用微生物是乳酸菌。優選菌種屬于腸球菌屬和乳桿菌屬。如果使用主要由簡單糖組成的“常規”生長培養基培養這樣的菌種，過度的能量供應將使乳酸菌產生過量的酸，這將限制生物量的產生和所得培養物的保存期。相比之下，本發明方法所用的生長基質中存在的糖的復合混合物提供用在初始生長步驟中的能源，還用于產物保存期間的維持。
根據本發明，可以使用細菌的單一菌種(或其它微生物)實施生長步驟。在本發明的優選實施方案中，兩種或多種不同的細菌(微生物)菌種可以在分開的生長培養基中獨立生長并且隨后在冷卻步驟之前或之后混合在一起。用于獨立培養兩種或多種不同細菌菌種的生長培養基可以是相同或不同的組成。因此，可以最佳化培養單一細菌菌種的生長條件并且隨后將培養物組合在一起，用于在允許維持培養物中各個單一菌種平衡生長的條件下的保存。
在此方法的其它實施方案中，如果它們的生長率是相當的，使得一個菌種不能支配整個菌群，那么兩種或多種不同的細菌菌種(或其它微生物)就可以在相同生長基質中的同一培養物中一起培養。生長步驟之后，可以通過標準方法分析制備物以確定微生物純度并計數微生物。也可以在分開的生長基質中一起培養兩種或多種不同的微生物(例如細菌)組合，隨后將培養物一起組合在終產物中。組合培養物可以同樣地與單一細菌菌種培養物混合。
用于本方法生長步驟的起始培養物包括，例如，凍干的細菌或液體培養物。
應該理解的是，使用本發明方法制備的微生物制備物可以在冷卻步驟后立即使用，但是更典型的是在使用之前保存制備物。為了在培養物中維持接近平衡的生長狀態，保存的最佳溫度為約4℃，但是技術人員應該理解的是保存溫度可以稍微改變。方便起見，可以在長期保存之前將由此方法產生的接近平衡的培養物的等分樣分裝成合適的滅菌包裝。
本發明方法的一個關鍵優勢在于，當在延長的時間內保存時，典型地是至少5個月，產生的接近平衡的培養物保持存活性和完整性。然而，應該理解的是，在使用之前培養物必須實際保存至少5個月對于本方法而言并不是必需的。
為避免真菌或酵母的生長，在保存之前，可以加入抗真菌劑，比如滅菌的山梨酸鉀。抗真菌劑主要是為了防止最終用戶使用期間，一旦產品容器被打開時由酵母或真菌引起的腐敗。此外，可以加入有助于防止保存期間產品腐敗的抗氧化劑，例如，維生素C。應該理解的是，還可以使用本領域熟知的其它試劑作為抗真菌劑或抗氧化劑。
在本發明的另一方面中還涉及產生活的、有代謝活性的和穩定的微生物制備物的可選擇方法，其不需要活躍的生長步驟。這種方法包括以下步驟 將微生物加入包含復合和簡單糖、蛋白質和肽的混合物的生長基質以形成微生物制備物，其中微生物以提供接近平衡生長狀態的濃度加到生長基質中，所述接近平衡生長狀態的特征在于當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時，制備物中的微生物群可以維持穩定水平，和任選地在約4℃保存制備物。
在此方法的優選實施方案中，所述微生物是細菌。優選的細菌菌種與上面有關需要活躍生長步驟的方法中列舉的一樣。
此方法在施加接近平衡生長的條件之前，微生物(例如細菌)不需要在生長基質中生長。更確切的是，將微生物(例如細菌)起始培養物以一定的濃度接種至生長基質，所述濃度允許所得制備物在4℃和受控pH條件下保存至少5個月時維持平衡狀態。所述方法的起始培養物包括，例如，凍干的細菌或液體培養物。可以用超過一種的細菌菌種接種生長基質。優選的是，起始培養物中活細胞的濃度超過108個活細胞/ml。
通過生長基質中的營養物、溫度、pH和階段生長的組合再次達到接近平衡的狀態。在能夠維持至少5個月的接近平衡的狀態中，優選將有代謝活性的細菌群維持在108-109個活細胞/ml的穩定水平。還應該理解的是，接近平衡狀態的活細胞的準確量可根據所用細菌的菌種稍微改變。還應該理解的是，起始培養物的濃度和生長基質的pH可以根據所用細菌的種類稍微改變。
將在有關應用需要生長步驟的方法中所產生的接近平衡的培養物中描述的優選特征加以必要的變更應用于使用這種方法獲得的接近平衡的培養物。因此，在優選實施方案中，保存期間接近平衡的培養物的pH維持在3.8-4.5。優選的是，在保存期間使用緩沖劑，比如檸檬酸三鈉或磷酸鹽來控制pH。
在優選實施方案中，所用微生物是乳酸菌。優選的菌種屬于腸球菌屬和乳桿菌屬。
在此方法中所用的生長基質的優選特征與上面有關本發明第二方面中所描述的一樣。另一方面，使用本文中描述的方法從發芽的谷物制備所述生長基質是優選的但不是必需的。
有代謝活性細菌的制備物的用途 有益健康的益生素是眾所周知的(見，例如，Marteau，P.andRambaud，J-C，(1996)‘Therapeutic applications of probiotics inhumans’in Leeds，A.R.and Rowland，I.R.(eds.)Gut flora andhealth-past，present and future，Royal Society of Medicine Press Limited，London；Stark，B.A.and Wilkinson，(eds.)(1989)Probiotics.Theoryand Applications)。益生素已經顯示出對治療腹瀉和便秘、腸易激綜合征、癌的治療和預防與其它影響腸內微生物群落的疾病是有用的。
因此，發現了由本發明提供的細菌制備物在治療或預防影響微生物腸內群落的疾病中的特定效用，和在幫助維持健康微生物群落中更普遍的效用。
由此，本發明的另一方面提供治療和預防影響人或動物患者腸內微生物平衡的病癥的方法，包括向需要的患者施用有效量的根據本發明的有代謝活性和穩定的細菌制備物。
具體而言，本發明涉及治療或預防慢性炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克羅恩病。此外，根據本發明的細菌培養物可以給人或動物(例如哺乳動物或鳥)施用以全面維持健康的微生物群落，而不是用于治療特定的疾病。
在另外的實施方案中，本發明還涉及根據本發明的有代謝活性和穩定的細菌制備物在制備治療影響微生物腸內群落的疾病的藥物中的用途。
細菌制備物可以以本來形式使用，例如作為益生素補充物使用，或者在施用給人或動物對象之前它們可以與另外的成分混合，或者甚至不混合的與另外的成分一起施用。對于獸醫使用，可以很方便地將細菌制備物加到正常動物飼料中。在獸醫領域中發現所述制備物在治療鳥類，尤其是市售家禽(如在所附實施例中列舉的)，以及治療哺乳動物種類，例如牛、羊、馬、貓、狗等中的特定效用。
對于人的應用，所述細菌制備物可以以本來形式施用，或者在施用于人對象之前與另外的成分再次混合或配置后再施用。因此本發明包括含有根據本發明的細菌制備物加上一種或多種另外成分的組合物。通過實例的方式，可以加入另外的成分以改善人消費的組合物的可口性。如果為了便利，可以將根據本發明的制備物并入人消費用的食品或飲料中，只要這不影響細菌在制備物中的存活性。
對于人和/或獸醫的使用，可以將根據本發明的制備物方便地配制成單位劑量形式，單獨的或者是與一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體組合在一起。同樣，這種制劑不應該對細菌在制備物中的存活性有不利的影響。
結合附圖參考以下非限制性試驗實施例將更進一步理解本發明，其中 圖1a-1d顯示根據本發明描述的方法制備的植物乳桿菌液體培養物(“濕性”)與凍干的細菌制備物(“干性”)強壯性的比較。最先的兩個生長曲線(圖1a和1b)表明在非有害環境(non-hostile)中，根據本發明制備的細菌比凍干的制備物生長更快。圖1c中的生長曲線顯示通過本文描述的方法制備的植物乳桿菌(“濕性”)與凍干的細菌制備物(“干性”)在補充膽汁鹽的培養基中生長的比較。圖1d顯示通過本文描述的方法制備的植物乳桿菌(“濕性”)與凍干的細菌制備物(“干性”)在模擬哺乳動物消化道環境的低pH和存在膽汁鹽的條件下生長的比較。結果顯示根據本發明方法制備的細菌對有害環境有更強的抵抗性。
圖2a和2b顯示根據本發明制備的細菌的保存期增加。
圖3顯示細菌在小雞小腸中的建群。
具體實施例方式 實施例1使用基于大麥的培養基生產生長基質 (A)發芽(麥芽制造) 第一天 根據谷物的批次，將大麥在水中浸泡2-24小時。水中可含有0.1％(w/v)的次氯酸鈉(漂白劑)以抑制發芽階段污染物的生長。4小時之后，從谷物中排出水并且將谷物置于10-30℃的室溫下約1天時間。
第二天 將谷物在干凈水中另外浸泡4小時。這次和隨后的浸透的水中可以加入過氧化氫(0.1％w/v)。過氧化氫給發芽的谷物提供氧，并且作為消毒劑。作為選擇，可以使用次氯酸鈉。4小時后，從谷物中排出水并且將谷物放置約1天。對谷物偶爾的(例如每隔4小時)攪拌可以通過增加氣體交換、提供氧和去除二氧化碳來改善發芽。
第三天起 繼續浸泡、排水和放置循環，直到發芽谷物上出現的小根達到2-4mm長。此生長狀態表明谷物已經產生動員貯存營養物的酶。這些酶對‘糖化’期間隨后的產生生長培養基是非常重要的。可以對谷物進行更廣泛的改進，讓發芽階段直到小根達到幾毫米長為止。然而，太長的生長僅僅將營養物轉化成為植物的根和芽，其并不能用在發酵中。
(B)碾壓 當谷物已經充分發芽時，接著用滾筒碾磨機對它們進行碾壓。調整碾磨機以使谷物破裂開口但并不粉碎或完全變平。破裂谷物允許在糖化期間水的進入和營養的提取，同時避免谷物的粉碎從而有利于過濾步驟。
(C)生長基質的制備 在45℃將發芽的、碾壓的谷物與足夠覆蓋它們的水混合，并且將混合物在45℃保持1小時。
在45℃保持1小時之后，在30分鐘的期間將溫度升高至78℃。
將混合物放置在78℃條件下1小時。在78℃的放置后，通過過濾將經過處理的谷物分出。使用相對粗的過濾器(例如1mm縫隙楔形-鐵絲籃)產生含有相當大量懸浮固體的溶液。拋棄經過處理的谷物并且接下來加熱處理液體從而對其進行巴氏滅菌或消毒。在此特定的試驗中，液體被煮沸45分鐘。隨后加入緩沖劑(0.5％(w/v)檸檬酸三鈉)并且混合物被進一步煮沸15分鐘從而產生最終的生長基質。
實施例2生長基質的分析 (a)碳水化合物分析 使用苯酚-硫酸分析法測定總碳水化合物含量，用葡萄糖作為參考標準。(Dubois，M.，Gilles，K.A.，Hamilton，J.K.，Rebers，P.A.and Smith，F.(1956)Analytical Chemistry，vol.28.，p.350)。
使用Nelson-Somogyi方法測定還原糖，同樣用葡萄糖作為參考標準。(Somogyi，M.(1952)Journal of Biological Chemistry.，vol.195.，p.19)。
結果 基質中的總糖為20-40mg/ml(毫克每毫升)，還原糖為5-20mg/ml。
(b)蛋白質和肽分析 使用兩種分析法測定總蛋白質，用牛血清白蛋白作為參考標準 (i)雙縮脲試劑法(Itzhaki，R.F & Gill，D.M.(1964)AnalyticalBiochemistry，Vol.9.，p.401-410)。
(ii)由Ohnishi和Barr.改進的Lowry方法(Ohnishi，S.T.& Barr，J.K.(1978)Journal of Biological Chemistry，Vol.193，p.265)。
使用Bradford試劑測定分子量超過5000道爾頓的肽(Bradford，M.M.(1976)Analytical Biochemistry，Vol.72，p.248-254)。
結果 總蛋白質和肽為1-2mg/ml。
高分子量的肽(大于5000道爾頓)為100-300μg/ml。
實施例3產生有代謝活性的細菌培養物 (A)發酵 將根據實施例1制備的生長基質冷卻至37℃并加入細菌培養物。合適接種物的實例是凍干的細菌或液體起始培養物(典型地是營養培養液中1％(v/v)的過夜培養物)。
在此實施例中，以下細菌在兩個容器中生長 (i)屎腸球菌、植物乳桿菌 (ii)干酪乳桿菌 發酵進行16-20小時，直到pH達到4.5+/-0.3單位。隨后將發酵混合物冷卻至4℃并用標準技術評估質量(確定微生物的純度和計數細菌)。
在此，可以向發酵的培養液中加入消毒的山梨酸鉀(0.005％w/v終濃度)。這起到抑制任何真菌或酵母生長的作用，真菌或酵母可以由于最終用戶使用期間的污染而出現。
還可以加入作為抗氧化劑的維生素C(0.01％w/v終濃度)。
質量保證檢驗之后，如果需要的話，可以將不同的批次物混合從而獲得含有細菌菌種的復雜混合物的產物。
在此列舉的實施例中，混合兩批次的細菌產生含有屎腸球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌的終產物。
實施例4有代謝活性細菌培養物的保存期 為評估有代謝活性細菌培養物的保存期，將實施例2中獲得的包含屎腸球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌的細菌培養物批次在4℃(+/-1℃)保存。一周一次進行采樣，以0.1％(w/v)蛋白胨水連續稀釋的100μl等分試樣被涂布在瓊脂平板上。在約37℃培養平板約48小時，并計數細菌集落。
結果 下面的結果以每周每毫升集落形成單位的數量來說明由本發明方法制備的細菌的保存期(同樣見圖2)。已經根據本文中描述的同樣方法制備A和B批物，但它們是在不同的天數上制備的。
E.f＝屎腸球菌 L.p＝植物乳桿菌 L.c＝干酪乳桿菌 LAB＝乳酸菌 cfu/ml＝每毫升集落形成單位 表1 A批(8059) 總 周E.fL.pL.cLAB 0 2.7E+081.2E+089.0E+074.8E+08 1 2.0E+082.4E+081.9E+086.3E+08 2 2.4E+082.2E+081.5E+086.1E+08 3 3.0E+081.9E+089.0E+075.8E+08 4 3.0E+081.8E+088.0E+075.6E+08 5 3.5E+081.7E+086.0E+075.8E+08 6 3.0E+081.9E+085.0E+075.4E+08 7 3.1E+081.5E+083.0E+074.9E+08 8 2.8E+081.7E+083.0E+074.8E+08 9 2.5E+081.7E+083.0E+074.5E+08 10 2.5E+081.6E+082.0E+074.3E+08 11 2.2E+081.5E+083.0E+074.0E+08 12 2.0E+081.4E+083.0E+073.7E+08 13 1.6E+081.5E+082.0E+073.3E+08 14 1.5E+081.5E+082.0E+073.2E+08 15 1.5E+081.3E+082.0E+073.0E+08 16 1.4E+081.3E+082.0E+072.9E+08 17 1.2E+081.4E+082.0E+072.8E+08 18 6.0E+071.4E+081.0E+072.1E+08 19 4.0E+071.3E+082.0E+071.9E+08 20 3.0E+071.1E+082.0E+071.6E+08 21 4.0E+071.1E+082.0E+071.7E+08 22 1.0E+071.0E+081.0E+071.2E+08 表2 B批(8060) 總 周 E.fL.pL.cLAB 03.0E+081.3E+081.5E+085.8E+08 13.6E+081.6E+082.5E+087.7E+08 23.0E+081.5E+081.4E+085.9E+08 31.8E+082.2E+081.2E+085.2E+08 42.1E+081.0E+088.0E+073.9E+08 51.7E+081.0E+087.0E+073.4E+08 61.6E+082.0E+088.0E+074.4E+08 71.5E+081.4E+087.0E+073.6E+08 81.2E+081.5E+085.0E+073.2E+08 91.5E+081.1E+086.0E+073.2E+08 10 2.3E+081.0E+085.0E+073.8E+08 11 1.8E+081.0E+082.0E+073.0E+08 12 1.6E+081.0E+083.0E+072.9E+08 13 1.2E+081.1E+083.0E+072.6E+08 14 1.0E+081.1E+082.0E+072.3E+08 15 1.0E+081.0E+082.0E+072.2E+08 16 1.0E+081.0E+082.0E+072.2E+08 17 8.00E+07 9.00E+07 1.00E+07 1.8E+08 18 9.00E+07 9.00E+07 1.00E+07 1.9E+08 19 8.00E+07 8.00E+07 2.00E+07 1.8E+08 20 6.00E+07 8.00E+07 1.00E+07 1.5E+08 21 5.00E+07 7.00E+07 1.00E+07 1.3E+08 22 4.00E+07 8.00E+07 1.00E+07 1.3E+08 實施例5評估有代謝活性培養物和凍干細菌的強壯性 在這個系列試驗中，使用單菌株植物乳桿菌接種生長培養基。隨后通過監測在600nm的吸光度來測量在約37℃的生長(同樣可以通過檢查稀釋物在瓊脂平板上的生長來實施)。
‘濕性’表示細菌的液體培養物(由在此專利申請中描述的方法產生)。‘干性’表示細菌的凍干制備物，其僅在特定培養基培育之前被懸浮于MRS培養液(De Man，Rogosa and Sharpe Broth)。在每個配對培育中使用等量活的‘濕性’和‘干性’細菌。
(1)在富集和‘友好’培養基中的生長 將細菌接種到MRS培養液中，并監測它們的生長(×1＝接種物的終濃度為1×107cfu/ml；×2＝2×107cfu/ml)。結果顯示在圖1a中。此第一生長曲線表明在非有害環境中，液體培養物比凍干制備物的生長快很多。推測起來凍干制備物中的休眠細菌需要時間來再水化并起動和運行它們的新陳代謝。
(2)酸性沖擊的影響 將1％(v/v)的液體培養物、或1％(v/v)凍干細菌的懸浮液加入MRS培養液中，該培養液已經用HCl調節到不同的pH值。細菌在酸性培養液中培育1小時，隨后在MRS瓊脂平板上對樣品進行計數。
cfu＝每毫升集落形成單位 此結果表明‘濕性’細菌比‘干性’細菌能更好的在酸性環境中存活。因為胃的pH水平可以低至2，這明顯與細菌在胃轉運期間和其后期間的存活和適合度相關。
(3)pH和膽汁鹽的聯合影響 采用進一步的沖擊水平，在以下條件中比較‘濕性’和‘干性’細菌制備物的生長 (a)只有MRS培養液(圖1b) (b)補充有0.5％(w/v)膽汁鹽(Oxoid L55)的MRS培養液(圖1c) (c)在pH3.0的MRS中培養1小時，接著在含有膽汁鹽的MRS-培養液中生長(圖1d)。
來自試驗的聯合結果表明以下要點 ●‘濕性’細菌比‘干性’細菌生長的更快。
●酸性沖擊對‘干性’細菌比對‘濕性’細菌帶來更有害的影響。
●膽汁鹽抑制此兩種類型細菌，但是與‘濕性’細菌相比，可能給‘干性’細菌帶來更不利的影響。
●酸性沖擊之后暴露于膽汁鹽的聯合的連續作用明顯地減慢‘濕性’細菌的生長，但是殺死了‘干性’細菌(通過瓊脂平板上缺少集落來判斷)。
然而，雖然pH和膽汁耐受是非常重要的因素，但是有其它大量的益生細菌必須面對的挑戰，即有化學方面的又有微生物方面的。因此簡單地通過每克或每ml中集落形成單位的數量來判定細菌的存活力和總量是表明制備物作為功能性益生菌適合度的唯一指示。如果當細菌進入宿主時不是在活動狀態，它們非常有可能被殺死，或者在它們有機會建群之前，需要經過很長的消化道。因此，如果當益生素進入宿主時是處于代謝活性狀態，那么對它們在宿主內的應用是有益處的。根據本發明，細菌是活的和有代謝活性的形式，因此它們能夠抵擋GI道的有害環境。設計所述產物有代謝活性的特性來增加在宿主內存活和建群的機會。
實施例6對家禽小雞胃腸微生物群落的影響 介紹和方法 根據本文中描述的方法制備含有乳酸菌屎腸球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的益生素。檢驗益生素改變市售家禽(肉雞)單位的家禽小雞胃腸微生物群落的能力。
小雞的處理 從第一天(日齡(day old))到第三天給家禽小雞施用抗生素林可霉素(Lincospectin)。在第四天這些禽類不接受處理。在第五天，一半肉雞舍的雞以每5000只小雞1升的比率接受所述制備物。余下的雞舍的雞作為對照。在第六天，從每組中隨機選擇6只小雞處死，并且檢查腸的微生物群落。(集合來自每組中成對小雞的組織樣品，于是從每組得到3個樣品)。
微生物學分析 選擇用于分析的消化系統區域是上腸道，采自從小腸的起始部位向下到卵黃囊附著位點的部分。
來自成對小雞的胃腸組織和內容物在滅菌的蛋白胨水中被浸軟、稀釋，并且將樣品涂布在多種半選擇性瓊脂上。培養所述平板之后，與細菌的顯微鏡分析一起記錄集落的特征和數量。通過檢查集落特征、細胞形態和碳水化合物發酵特征(后者使用BioMerieux的‘api 50 CH’檢測試劑盒進行)實施乳酸菌菌種的鑒定。
結果 結果顯示在圖3中。
L1-L3＝經益生素處理的小雞(1-3對) C1-C3＝對照小雞(1-3對) SI＝小腸 cfu＝集落形成單位 正如所預期的，許多不同的微生物即存在于對照的又存在于益生素處理的小雞的胃腸道中。總的來說，在兩組小雞中存在相似量和類型的細菌，但是在特定菌種的分布和量上有明顯的差異。
乳酸菌 乳酸菌(LAB)的含量在制備物處理的小雞和對照小雞之間有非常顯著的差異。同時兩組有相當總量的LAB，對照小雞的微生物群落的優勢種是單一菌種，然而益生素處理的小雞存在有更廣范圍的菌種混合。
實施例7益生素制備物對鴕鳥幼雛的影響 實施一個試驗來評估根據本發明的制備物對鴕鳥幼雛的影響。該試驗進行4周時間，其中幼雛從第4天起患有腹瀉。一組用根據本發明的制備物處理，第二組使用廣譜抗生素和第三組使用維生素氨基酸補充物。試驗結果顯示用根據本發明制備物處理組的死亡率與抗生素處理組相比降低67％并且施用制備物可以緩解便秘、腹瀉、腸淤滯、異常行為和下垂。此外，與對照組相比，在益生素制備物處理組中觀察到體重增加27％。
在第二試驗中，其中給種雞施用100ml根據本發明的制備物，與對照組相比，可以觀察到施用所述制備物導致繁殖力增加。
因此，這些結果顯示施用根據本發明的益生素制備物影響了生長率、發病率和死亡率。
實施例8益生素制備物對哺乳動物的有益影響 在小規模獨立試驗中，評估根據本發明的制備物對患有慢性腸炎的貓和狗的影響并且發現了它在恢復正常的腸微生物群落中的用處。
在對人的試驗中，從自愿者中已經觀察到制備物在治療急性腹瀉中的有益影響并且可以醫治慢性腸不規則(chronic bowel irregularity)。
這種益處模式表明基于在此報導方法的產物具有控制人的急性和慢性胃腸功能紊亂(包括腸易激綜合征和炎性腸病、食物中毒、傳染性腹瀉和便秘)的顯著好處。現在正在實施一個完整的臨床試驗以支持迄今已獲得的結果。
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權利要求
1.一種包含活的、有代謝活性的細菌以及含有復合和簡單糖、蛋白質和肽的混合物的生長基質的制備物，其中所述生長基質中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，其中還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml，并且其中所述生長基質中蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，其中分子量大于5000道爾頓的肽的總量為100μg/ml-300μg/ml，其中制備物中的細菌表現出接近平衡的生長狀態，所述狀態的特征在于當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時細菌群保持在穩定的水平。
2.根據權利要求1的制備物，其中當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時細菌群保持108-109個活細胞/ml制備物的水平。
3.根據權利要求1或2的制備物，其中糖的總量為30mg/ml。
4.根據權利要求1或2的制備物，其中還原糖的總量為10mg/ml。
5.根據權利要求1或2的制備物，其中蛋白質和肽的總量為2mg/ml。
6.根據權利要求1或2的制備物，其中分子量大于5000道爾頓的肽的總量為250μg/ml。
7.權利要求1或2的制備物，其中pH維持在3.8-4.5。
8.根據權利要求7的制備物，其中pH維持在約4.0。
9.權利要求1或2的制備物，其中通過緩沖劑控制pH。
10.權利要求1或2的制備物，其中所述細菌是乳酸菌。
11.權利要求10的制備物，其中所述細菌屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。
12.權利要求10的制備物，其中所述細菌屬于腸球菌屬(Enterococcus)。
13.權利要求10的制備物，其包含屎腸球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌或嗜酸乳桿菌中的至少一種。
14.權利要求13的制備物，其包含屎腸球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌。
15.權利要求1或2的制備物，其另外包含抗真菌劑。
16.權利要求15的制備物，其中所述抗真菌劑是滅菌的山梨酸鉀。
17.權利要求1或2的制備物，其另外包含抗氧化劑。
18.權利要求17的制備物，其中所述抗氧化劑是維生素C。
19.一種用于微生物的包含復合和簡單糖、蛋白質和肽的混合物的生長基質，其中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，并且還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml，其中蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，并且分子量大于5000道爾頓的肽的總量為100μg/ml-300μg/ml。
20.權利要求19的生長基質，其中糖的總量為25mg/ml-35mg/ml。
21.權利要求20的生長基質，其中糖的總量為約30mg/ml。
22.權利要求19-21中任一項的生長基質，其中還原糖的總量為5mg/ml-15mg/ml。
23.權利要求22的生長基質，其中還原糖的總量為約10mg/ml。
24.權利要求19-21中任一項的生長基質，其中蛋白質和肽的總量為約2mg/ml。
25.權利要求19-21中任一項的生長基質，其中高分子量肽的總量為約250μg/ml。
26.一種制備用于微生物的生長基質的方法，所述生長基質中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，其中還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml，并且所述生長基質中中蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，其中分子量大于5000道爾頓的肽的總量為100μg/ml-300μg/ml，所述方法包括以下步驟
將發芽的谷物糖化，其中將發芽的谷物與水成液混合并置于限制復合碳水化合物向簡單碳水化合物轉化程度的時間和溫度條件下，從而獲得復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽的混合物，其中所述糖化步驟包括將發芽的谷物與水在30℃-45℃的溫度下混合，靜置混合物1-2個小時，在20-40分鐘內使溫度升至75℃-85℃，和隨后使混合物在75℃-85℃靜置60-90分鐘，和
從經過處理的發芽谷物中分離復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽的混合物，從而獲得生長基質。
27.根據權利要求26的方法，其中所述糖化步驟不包括60℃-65℃和/或70℃-74℃溫度下的靜置。
28.根據權利要求26或27的方法，其中通過粗過濾從經過處理的發芽谷物中分離復合和簡單碳水化合物、蛋白質和肽的混合物。
29.根據權利要求26或27的方法，其中所述生長基質未被澄清化。
30.根據權利要求26或27的方法，其中所述谷物是大麥、小麥、稻、燕麥或玉米。
31.根據權利要求26或27的方法，其中所述生長基質是經過滅菌的。
32.根據權利要求26或27的方法，其中向生長基質中加入緩沖劑。
33.一種可通過權利要求26-32中任一項的方法獲得的生長基質。
34.一種制備有代謝活性和穩定的微生物制備物的方法，其包括以下步驟
使微生物在包含復合和簡單糖、蛋白質和肽的混合物的生長基質中生長，從而獲得微生物制備物，其中所述生長基質中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，其中還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml，并且其中所述生長基質中蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，其中分子量大于5000道爾頓的肽的總量為100μg/ml-300μg/ml，和
將得到的制備物冷卻至約4℃，其中微生物處于接近平衡的生長狀態，所述狀態的特征在于當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時，制備物中的微生物群可以維持穩定的水平，和
任選地在約4℃保存制備物。
35.權利要求34的方法，其中兩種微生物生長在一種生長基質中。
36.權利要求34或權利要求35的方法，其中兩種或多種微生物生長在分開的生長基質中并且在于約4℃保存之前將它們混合在一起。
37.一種制備有代謝活性和穩定的微生物制備物的方法，其包括以下步驟
將微生物加入包含復合和簡單糖、蛋白質和肽的混合物的生長基質中以形成微生物制備物，其中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，并且其中還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml，其中蛋白質和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，并且其中分子量大于5000道爾頓的肽的總量為100μg/ml-300μg/ml，其中所述微生物以提供接近平衡生長狀態的濃度加到生長基質中，所述接近平衡生長狀態的特征在于當在約4℃和控制pH條件下保存至少5個月時，制備物中的微生物群可以維持穩定水平，和
任選地在約4℃保存制備物。
38.權利要求34或37的方法，其中微生物是細菌。
39.權利要求38的方法，其中所述細菌是乳酸菌。
40.權利要求39的方法，其中所述細菌屬于乳桿菌屬。
41.權利要求39的方法，其中所述細菌屬于腸球菌屬。
42.權利要求39-41中任一項的方法，其中制備物中細菌的濃度為108-109個活細胞/ml。
43.權利要求34或37的方法，其中所述生長基質是權利要求19-25或33中任一項定義的生長基質。
44.根據權利要求34或37的方法，其中根據權利要求26-32中任一項的方法制備所述生長基質。
45.權利要求34或37的方法，其中在保存制備物之前加入抗真菌劑。
46.權利要求45的方法，其中所述抗真菌劑是滅菌的山梨酸鉀。
47.權利要求34或37的方法，其中在保存制備物之前加入抗氧化劑。
48.權利要求47的方法，其中所述抗氧化劑是維生素C。
49.權利要求34或37的方法，其中所述制備物的pH維持在3.8-4.5。
50.權利要求49的方法，其中通過緩沖劑控制pH。
51.一種通過權利要求38-50中任一項的方法可獲得的有代謝活性和穩定的細菌制備物。
52.一種包含根據權利要求1-18或51中任一項的有代謝活性和穩定的細菌制備物的動物飼料。
53.一種適合人消費的食品或飲料，其包含根據權利要求1-18或51中任一項的有代謝活性和穩定的細菌制備物。
54.一種藥物組合物，其包含與一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑混合的根據權利要求1-18或51中任一項的有代謝活性和穩定的細菌制備物。
55.一種用作藥物的根據權利要求1-18或51中任一項的有代謝活性和穩定的細菌制備物。
56.根據權利要求1-18或51中任一項的有代謝活性和穩定的細菌制備物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預防影響哺乳動物對象的腸微生物平衡的病癥。
57.根據權利要求56的用途，其中所述影響腸微生物平衡的病癥是慢性炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克羅恩病。
58.根據權利要求1-18或51中任一項的有代謝活性和穩定的細菌制備物在制備維持哺乳動物對象的腸微生物平衡的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及有代謝活性細菌的制備物、包含這種制備物的組合物例如益生素補充物或動物飼料及其用途，例如治療影響腸道微生物平衡的疾病。同時也描述了微生物的生長基質，所述基質包含復合和簡單糖的混合物，和利用這種生長基質制造有代謝活性微生物制備物的方法。
文檔編號A23K1/00GK101603021SQ200910149539
公開日2009年12月16日 申請日期2005年9月27日 優先權日2004年9月27日
發明者蒂莫西·圖伯 申請人:馬蒂吉姆英國企業有限公司