使用代謝能力降低的微生物保護生物活性食物成分的制作方法

專利名稱：使用代謝能力降低的微生物保護生物活性食物成分的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有一種或多種活微生物和至少一種感興趣的生物活性食物成分的食品，其中使用所述活微生物和所述感興趣的生物活性食物成分，使得所述微生物對所述生物活性成分的代謝降低。
背景技術：
食物成分市場，尤其是生物活性肽或功能性肽的市場(即對消費者而言，局部地在消化道中或在進入循環系統后遙遠地在體內具有有益活性的肽)許多年來已經全面成熟。
生物活性肽被定義為在它們的原始蛋白質中無活性，但是一旦通過酶作用釋放，便具有特殊性能的氨基酸序列。它們還被稱為功能性肽。這些生物活性肽尤其能對消化系統、身體的防御(例如抗微生物或免疫調節作用)、心血管系統(尤其是抗血栓形成或抗高血壓作用)和/或神經系統(例如阿片型的鎮靜和止痛作用)產生作用(見下面的表1和2)。
下面的表1列舉通過人乳和牛乳蛋白水解釋放的主要功能性肽。
表1

(*)氨基酸序列不完全相同(**)H人乳/C牛乳下面的表2比較了迄今已知的乳源功能性肽的主要生理活性。
表2

表2(繼續)

表2(繼續)

表2(繼續)

表2(繼續)

通常通過植物蛋白(例如大豆蛋白)或動物蛋白(例如酪蛋白或乳清蛋白)的水解得到這些肽，該水解是通過酶和/或發酵方法產生的，通常伴隨活性部分的濃縮，這個步驟通常對提供“健康益處”目標是必需的。健康益處的這些肽的生產和使用已經是大量文獻的主題(尤其見Danone World Newsletter No.17，September 1998)。
能接受這樣的成分的食物載體中，由于發酵乳制品的健康益處歸因于存在發酵劑和發酵產品(即來源于用乳酸菌轉化存在于乳中的底物的分子)，主要考慮發酵的乳制品。至今，科學界特別考慮發酵劑的特性。最近研究者開始對發酵產品產生興趣，所述發酵產品中的某些肽占據特定的位置，因為它們是眾多的并且是特定的生物信使。因此發酵的乳制品似乎特別適于用作水解例如從乳品底物，例如酪蛋白或乳清蛋白得到的生物活性肽的載體。
然后出現了主要的問題用于生產新鮮乳制品(例如酸奶、發酵的乳特制品、發酵的基于乳的飲料等)的微生物，尤其是乳酸菌通常能消耗肽以滿足它們的營養需求，更尤其是滿足它們的氮需求。這在下文中稱為“肽的代謝”。具體而言，乳酸菌具有幾個降解和/或轉運系統，所述降解和/或轉運系統允許它們代謝肽，然后使它們從介質中消失1/蛋白水解系統(PRT壁蛋白酶)，其切開蛋白質和巨肽以方便它們的同化作用(“細胞外代謝系統”)。
2/向細胞內轉運的系統，其中之一對大小接近10個氨基酸的寡肽具有特異性，另外一個適用于轉運二肽和三肽(乳桿菌具有另外的三肽透性酶系統)(“向細胞內轉運的系統”)，和3/能將肽降解成氨基酸的細胞內酶系統(含有約15種內源性肽酶和外源性肽酶)(“細胞內代謝系統”)。
假如乳中自然存在的肽量相對于乳酸菌的需求量太小，通常通過提供肽的補充物來加速它們的生長。然后這些將在發酵期間被完全消耗掉。
總之，由于(i)乳酸菌的氮需求，其中肽枸成乳中的主要來源，(ii)這些細菌有效消耗肽的能力，和(iii)發酵的基于乳的產品中大量乳酸菌的生存，最高到有效期限時，利用發酵的乳制品中基于功能性肽的成分是較困難的，或甚至不可能，因為這些成分通常在發酵期間，或甚至在到達有效期限的產品儲藏期間被乳酸菌消耗。
此外，由細菌引起肽的“不合時宜的”代謝引起的這種降解問題不僅對于給定的肽不是特異性的，而且對于特定的發酵劑(或可以發酵的微生物，優選細菌)也不是特異性的。
這是普遍的問題，不限于所考慮的肽和微生物。
例如提及生物活性肽αS1[91-100]的情況(見歐洲專利EP 0 714 910；尤其是Ingredia公司51-53，Avenue Fernand Lobbedez BP 946 62033Arras Cedex，法國，以商品名Lactium出售的乳蛋白水解產物中含有的具有松弛特性的肽)。因此，申請人觀察到在成品儲藏期間成品中乳酸菌群繼續代謝生物活性肽，作用僅僅10天后(對于有效期限是28天的新鮮產品)，約35％到55％的生物活性肽αS1[91-100]已經消失，這已經完全不能給消費者提供“健康”作用(數據未顯示)。
因為生物活性肽的消耗是發酵劑代謝活性的結果，可以預想通過破壞所有的或部分微生物來減少這種現象，例如通過適當的熱處理(熱殺菌或巴氏殺菌)。在這種情況下，可能保留生物活性肽αS1[91-100](例如在75℃加熱約1分鐘后)。
然而，這樣的溶液具有許多缺點-熱殺菌發酵的乳品物質必須在加熱之前添加使用穩定劑(果膠、淀粉、角叉菜膠等)，使得過程復雜化并且實際上增加了配方的成本；-工業生產線更復雜并且需要較大的特殊投資；-產品不再受益于與含有活發酵劑(例如酸奶)的產品相關的名稱，結果失去了與消耗乳酸發酵劑相關的利益；和-通常負面的感官影響很顯著。
因此，需要含有活微生物例如酸奶和一種或多種感興趣的生物活性食物成分的食品，其中保護這些感興趣的生物活性食物成分免于被所述活微生物代謝，而且同時保留食品的感官質量。

發明內容
通過本發明，申請人提供了可滿足現有需求的解決方案。
因此，本發明的一個主題是含有一種或多種活微生物和至少一種感興趣的生物活性食物成分的食品，其特征在于，使用所述活微生物和所述感興趣的生物活性食物成分，使得所述活微生物對所述生物活性成分的代謝降低。
因此，申請人已經能展示能有效地保護一種或多種感興趣的生物活性食物成分免于被活微生物代謝，只要一種和另一種使用條件適當。
這樣的適當的使用條件可使用多種手段，包括a)使用代謝生物活性成分的能力已被降低的活微生物；和/或b)向活微生物施用故意“在牧場傳遞”的誘餌(decoy)食物成分；和/或c)使用生物活性成分的物理性保護，尤其是通過包封它們。
在此方面應當指出，一種或多種或甚至所有的這些手段可以在相同食品中有利地組合。
如前面的一般說明中簡要指出的，根據本發明，術語“代謝的”或“代謝”旨在表示通過一種或多種活微生物轉化或降解底物，目的是將其作為營養物源消耗，并且最后結果是其或多或少全部從介質中消失。
用于本發明的目的，如果與一種成分的代謝低于當所述成分沒有被本發明中提供的至少一種手段保護時，該相同成分的代謝有所降低，則該成分的代謝被“降低”了。
有利地，并且理想地，這種降低了的代謝趨向于零，或甚至是零，相當于所述成分的代謝很少，近乎沒有，或甚至沒有。
根據本發明的一個具體實施方案，所述食品制備3周后，相對于剛剛制備后產品中存在的感興趣的生物活性食物成分量，所述食品中感興趣的生物活性食物成分的剩余量為約50％到100％。
優選地，所述剩余量為約80％到100％。
根據本發明，短語“所述食品中感興趣的生物活性食物成分的剩余量”旨在表示當所述產品在適當儲藏條件(例如，對于新鮮產品為約4℃到10℃)下保持3周時，相對于開始時，即產品剛剛生產后其中存在的感興趣的生物活性食物成分的百分率，所述食品中存在的感興趣的生物活性食物成分的百分率。
根據本發明的一個具體實施方案，所述感興趣的生物活性食物成分選自-蛋白質，-肽，-它們的類似物或衍生物，和-它們的組合。
優選地，所述感興趣的生物活性食物成分選自生物活性肽αS1[91-100](見歐洲專利EP 0 714 910)、肽C6-αS1194-199(見美國專利US 6 514 941)、肽C7-β177-183(見美國專利US 6 514 941)、肽C12-αS123-34(見美國專利US 6 514 941)、酪蛋白磷酸肽、α-酪嗎啡肽、α-酪蛋白、外啡肽(exorphin)、酪激肽、β-酪嗎啡肽、酪蛋白巨肽(CMP)，還稱為糖巨肽(GMP)或酪蛋白糖巨肽(CGMP)、casoxine、casoplatellins、片段50-53、β-乳嗎啡樣肽、lactoferroxin、肽Val-Pro-Pro(見歐洲專利EP 0 583 074)、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln(見專利申請EP 0 737 690)、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu(見專利申請EP 0 737 690)、Tyr-Pro(見專利申請EP 1 302 207和專利EP 0 821 968)、Ile-Pro-Pro(見Nakamuraet al.，1995；和日本專利JP 6 197 786)，它們的片段、類似物和衍生物，含有它們的蛋白質和/或肽以及它們的組合(回顧，尤其見Danone World Newsletter No.17，September 1998)。
甚至更優選，所述感興趣的生物活性食物成分選自生物活性肽αS1[91-100]，其片段、類似物或衍生物，含有它們的蛋白質和/或肽以及它們的組合。
術語“類似物”指初始化合物(在此情況下指蛋白質或肽)的任何經修飾形式，所述經修飾形式可能是天然的或合成的，其中一個或多個原子(例如碳、氫或氧原子)或雜原子(例如氮、硫或鹵素)已被添加到初始化合物的結構中或從初始化合物的結構中除去，從而得到新分子化合物。
用于本發明的目的，“衍生物”是具有相似性或含有與參照化合物(蛋白質或肽)共同的結構單元的任何化合物。一方面，該定義還包括某些化合物，其單獨或與其它化合物一起可作為通過一個或多個化學反應合成參照化合物的前體或中間產物，另一方面，該定義還包括可從所述參照化合物單獨或與其它化合物一起通過一個或多個化學反應形成的化合物。
因此，“衍生物”的上述定義至少包含蛋白質和/或肽的水解產物，尤其是胰蛋白酶水解產物、水解產物級分以及水解產物和/或水解產物級分的混合物。
此外，上面提及的術語“類似物”和“肽或蛋白質的衍生物”包括，例如糖基化或磷酸化的肽或蛋白質，或者經過任何化學基團接枝的肽或蛋白質。
根據本發明的另一個實施方案，所述感興趣的生物活性食物成分尤其可以是糖或脂肪酸。
有利地，所述活微生物的特征在于代謝感興趣的生物活性食物成分的能力有所降低或甚至是零。
根據本發明，“代謝的能力降低”是使得發酵期間代謝的感興趣的生物活性成分量(因此從介質中消失)小于或等于成分起始量(發酵之前)的40％。
這在數學上通過下式來反映Qr≥0.6Qo(1)
其中Qr剩余的生物活性成分的量(存在于發酵后的介質中)Qo生物活性成分的初始量。
可通過與MS/MS型檢測器偶聯的HPLC液相色譜來測量生物活性成分的剩余量Qr。下面的實施例中給出實驗程序的實例。
優選地，所述活微生物是野生株和/或天然變體和/或通過基因工程得到的突變體。
在本專利申請中，術語“變異株”和“變體”旨在表示主要通過選擇性突變從參照株得到的具有感興趣的期望性能，即上述的代謝所述感興趣的生物活性食物成分的能力降低或為零的菌株。
用于本發明的目的，“突變體”或“突變株”是由參照株通過定點誘變技術得到的菌株。與上述定義的變體相似，這樣的突變體具有感興趣的期望性能。
通過選擇性突變得到天然變體的技術，或通過基因工程，尤其是使用載體通過基因轉化得到突變體的技術是本領域技術人員公知的。在此方面，尤其可參考出版物Sambrook和Russel(2001)。具體而言，本領域技術人員可從Biswas et al.(1993)描述的試驗操作中得到選擇性突變方案的啟示。
根據本發明的一個具體實施方案，所述活微生物是活的細菌，優選活的乳酸菌。
優選地，所述活細菌中選自下述的至少一種機制的能力降低了-蛋白質和肽的細胞外代謝系統，-將肽轉運到細胞內的系統，或-肽的細胞內代謝系統。
短語“代謝和/或轉運機制的能力降低”在此表示上述的代謝和/或轉運機制的能力(或活性)不允許其在發酵期間代謝和/或轉運約40％以上的感興趣的生物活性成分。
甚至更優選地，所述機制在所述活菌中是非功能性的。
具體而言，所述降低或非功能性能力的機制是將肽轉運到細胞內的系統。
更具體而言，所述肽轉運系統是AMI系統(例如見Garault et al.，2002)或OPP系統(在保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)中Peltoniemiet al.，2002；在乳桿菌(L.lactis)中Detmerset al.，1998)。
可用于本發明中的活細菌尤其可選自-鏈球菌屬(Streptococcus spp)，優選嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)；-乳桿菌屬(Lactobacillus spp)；-乳球菌屬(Lactococcus spp)；和-雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp)。
優選地，所述活細菌選自-嗜熱鏈球菌，其于2002年1月24日以I-2774號保藏在CNCM(國家微生物菌種保藏中心(Collection nationale de cultures desmicroorganisms)(法國巴黎巴斯德研究所)；-嗜熱鏈球菌，其于2004年5月10日以I-3211號保藏在CNCM；-嗜熱鏈球菌，其于2004年9月16日以I-3301號保藏在CNCM；-嗜熱鏈球菌，其于2004年9月16日以I-3302號保藏在CNCM；甚至更優選地，所述活細菌是2004年5月10日以I-3211號保藏在CNCM的嗜熱鏈球菌。
有利地，本發明的食品至少包含活的嗜熱鏈球菌和乳桿菌屬細菌。
優選地，所述活的嗜熱鏈球菌選自2002年1月24日以I-2774號保藏在CNCM的嗜熱鏈球菌、2004年5月10日以I-3211號保藏在CNCM的嗜熱鏈球菌、2004年9月16日以I-3301號保藏在CNCM的嗜熱鏈球菌、2004年9月16日以I-3302號保藏在CNCM的嗜熱鏈球菌。
本發明的食品中活微生物含量可以變化，并且將由本領域技術人員根據他在本領域中的一般知識進行選擇。實際上，優選尋找標準總含量，例如以每克食品中107～109個細菌的數量級。
根據本發明的一個具體實施方案，所述感興趣的生物活性食物成分被包封起來。
根據本發明，術語“包封的”和“包封”旨在表示在微粒型的賦形劑中使用保護活性成分的方法以使得允許控制釋放這個活性成分。在這種情況下，所述有效成分由一種或多種感興趣的生物活性食物成分組成。
這種包封提供了對本發明的補充解決方案，因為其允許所述感興趣的生物活性食物成分避免被所述活微生物代謝。
此外，非常有利地，包封允許得到感官上更可接受的成品，例如通過掩蓋某些生物活性成分，尤其是某些肽的或多或少的強烈苦味。
最后，包封允許感興趣的生物活性食物成分到達小腸而不被降解，并且不受傷害地穿過小腸屏障，以便在那里發揮它們的作用。
根據本發明的另一個具體實施方案，所述食品還包含至少一種誘餌食物成分。
根據本發明，術語“誘餌食物成分”用于表示能用作活微生物的營養源(尤其是氮源)的食物成分(優選地，肽、蛋白質、它們的類似物或衍生物以及它們的組合)，并且旨在優先被所述微生物代謝，以便使所述微生物轉為顯然旨在優先保存的感興趣生物活性成分。因此，誘餌成分表示微生物的營養源，其被故意消耗，以便盡可能多地保留所述感興趣的生物活性成分。在此方面，所述誘餌食物成分起到該感興趣的生物活性成分轉運的競爭性抑制劑作用。
應當指出，可有利地組合上述的具體實施方案。
優選地，本發明的食品是發酵產品。
更優選地，所述發酵的食品是乳制品或植物性產品。
根據本發明，術語“乳制品”用于表示乳，以及基于乳的產品，例如奶油、冰淇淋、黃油、乳酪或酸奶；二級產品例如乳清或酪蛋白；還包括含有乳或乳組分作為主要成分的任何制備的食物。
術語“植物性產品”特別用于表示從例如水果汁和植物汁，包括大豆汁、燕麥汁或水稻汁的植物基本成分(plant base)中得到的產品。
此外，“乳制品”和“植物性產品”的上述定義各自包含基于乳制品和植物性產品的混合物的任何產品，例如乳和水果汁的混合物。
本發明的一個主題還包括制備上述食品的方法，其中將一種或多種活微生物和一種或多種被包封的感興趣生物活性食物成分添加到意圖構成所述食品的混合物中。
根據一個實施方案，相繼地將所述感興趣的生物活性食物成分添加到所述混合物中。
可替代地并且優選地，同時將所述感興趣的生物活性食物成分添加到所述混合物中。
微生物生長條件取決于所述微生物，并且是本領域技術人員公知的。作為實例，應當指出，嗜熱鏈球菌的最適宜生長溫度通常為約36℃到42℃；德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckii spp.Bulgaricus)(典型地存在于酸奶中)的最適宜生長溫度通常為約42℃到46℃。
作為一般規則，通過快速冷卻可實現發酵停止，這可使得微生物的代謝活性降低，這種發酵停止取決于達到的pH。
根據本發明的一個具體實施方案，直接在意圖構成所述食品的混合物中制備所述感興趣的生物活性食物成分。這被稱為原位合成所述感興趣的生物活性食物成分。
在原位合成的情況中，可預想在原位合成所述感興趣的生物活性食物成分之前、期間或之后，將所述活微生物添加到意圖構成所述食品的混合物中，其中沒有偏好性。
本發明的一個主題還包括將上述食品用作功能性食物。
術語“功能性食物”意指不依賴其營養作用，有利地影響身體的一個或多個靶功能的食品。因此，它可導致食用正常量所述產品的消費者健康和/或舒適狀況的改善和/或降低發病的風險。可特別提及的“功能性食物”的活性實例包括抗癌、免疫刺激、促進骨骼健康、抗應激、阿片、抗高血壓、增強鈣利用度或抗微生物活性(Functional Food Sciencein Europe，1998)。
可將這樣的功能性食物用于人和/或動物。
本發明的一個主題還包括在食品中使用對感興趣的生物活性食物成分的代謝能力降低的活微生物，以保護所述感興趣的生物活性食物成分免于被所述活微生物代謝。


通過下面附圖舉例說明本發明，所述附圖不以任何方式限制本發明。
圖1LC-MS色譜圖舉例說明乳酸發酵期間包含在成分Lactium中的生物活性肽αS1[91-100]的消失。調節MS/MS檢測器，使得僅僅顯示m/z離子＝634.5Da(雙帶電肽αS1[91-100]的質量)的信號，它在片段化后產生m/z＝991.5Da；771.5Da；658.3Da(肽αS1[91-100]的特征性片段)的子離子。
圖2乳品“混合物”用由菌株I-2783(2002年1月24日保藏在CNCM)、I-2774(2002年1月14日保藏在CNCM)、I-2835(2002年4月4日保藏在CNCM)和I-1968(1998年1月14日保藏在CNCM)的混合物組成的發酵劑進行發酵前和發酵后，通過LC-MS/MS鑒定和量化成分Lactium中的主要肽。發酵后，發現這些肽僅僅是痕量的并且合并到基線中。“？”表示序列的鑒定是不可能的或不確定的；因而僅僅報道了該肽的質量。
圖3在用乳酸發酵劑Hansen YC380發酵達到pH4.7之前(1)和之后(2)，含有1.5g/L DMV C12水解產物的乳品“混合物”的比較性肽圖譜(LC-MS/MS色譜圖)。實際上水解產物的所有肽，包括生物活性肽C12(片段αS1[23-34])在使用發酵劑的菌株代謝后消失。
圖4舉例說明在10℃儲藏期間，成品中生物活性肽αS1[91-100]剩余量變化的曲線，所述成品由95％的用含有菌株I-2783、I-2774、I-2835和I-1968的發酵劑發酵的物質和5％的含有肽αS1[91-100]的已調味糖漿組成。以4個獨立試驗E1、E2、E3和E4的形式進行該實驗。
圖5舉例說明發酵后添加到發酵產品中，然后在75℃加熱1分鐘并且在10℃儲藏到有效期限的生物活性肽αS1[91-100]剩余量變化的曲線。
圖6舉例說明在10℃儲藏到有效期限期間，成品中生物活性肽αS1[91-100]剩余量的變化，所述成品由95％的用含有菌株I-2774和甲酸鹽的發酵劑發酵的物質和5％的含有肽αS1[91-100]的已調味糖漿組成(以Lactium的形式提供，1.5g/kg成品)。
圖7舉例說明在發酵之前添加到成品中的生物活性肽αS1[91-100]剩余量的變化，所述成品由使用含有菌株I-2774和甲酸鹽的發酵劑發酵的乳品物質組成。
具體實施例方式
閱讀下面的僅僅為了舉例說明目的給出的實施例，本發明的其它特征和優點將更明顯。
實施例實施例1不施用要求保護的發明，利用感興趣的生物活性成分1.1)包含在水解產物Lactium中的生物活性肽αS1[91-100]的實施例當在制備乳品“混合物”(將乳粉末化)步驟中、衛生熱處理(即95℃、8分鐘)之前以及因此在發酵之前添加肽或蛋白質型的成分時，使用通常以粉末形式提供的這些成分更簡單方便。在此情況下，代謝活性肽的風險很高。例如，使用含有生物活性肽(酪蛋白αS1的片段91-100)的功能性成分例如Lactium(Ingredia，法國)的情形就是如此。
程序通過水解120g/L脫脂奶粉制備介質，補充1.5g/L Lactium成分(相當于約30mg/L生物活性肽αS1[91-100])，然后在95℃巴氏滅菌8分鐘。
添加乳酸發酵劑至比例為0.02％，并且在所選發酵劑的最適宜溫度進行發酵(37到42℃)直到pH達到4.70。
如下所述通過與MS/MS型檢測器偶聯的HPLC液相色譜法分析剩余的肽，尤其是生物活性肽αS1[91-100]-用水、甲醇和三氟乙酸(50/50/0.1％)的混合物，以約1比6的比率稀釋發酵的介質來制備樣品。離心后的上清液組成發酵介質中肽內容物的代表性樣品。
-將該樣品注入裝備適于肽分析的Waters Symmetry型柱(5μm2.1×150mm，WAT056975，Waters France，5，Rue Jacques Monod，78280Guyancourt)的Agilent 1100型HPLC色譜系統(來自AgilentTechnologies France公司，1 rue Galvani，91745 Massy Cedex，France)中，溫度為40℃和流速為0.25ml/分鐘。常規地用溶劑A(水+0.106％甲酸)中溶劑B(乙腈+0.100％甲酸)的增加梯度洗脫肽，時間在40分鐘到2小時，作為所需拆分的函數。
-使用特殊的MS/MS型檢測器進行檢測，例如用離子阱儀器如Esquire3000+(Bruker Daltonique，rue de l’Industrie，67166Wissembourg Cedex)，其或者已被調節用于全面分析肽含量(MS-MS模式)，或者被調節用于有肽的特征片段對該肽進行精確和具體定量。例如，從其質量(質量為634.5Da的雙帶電離子)分離肽αS1[91-100]并且從其片段化后特征子離子(m/z為991.5Da、771.5Da和658.3Da的離子)強度來定量。甚至更具體而言，由氘化兩次的相同合成肽組成的內標(993.5Da的特征片段)使得有可能考慮上述肽和放棄任何與基質相關的干擾。
圖1舉例說明了結果。
在此階段(由菌株I-2783(2002年1月24日保藏在CNCM)、I-2774(2002年1月14日保藏在CNCM)、I-2835(2002年4月4日保藏在CNCM)和I-1968(1998年1月14日保藏在CNCM)的混合物組成的發酵劑，或例如發酵劑YC380(Chr.Hansen SA，Le Moulin d’Aulnay，BP64,91292 ARPAJON Cedex France)的發酵劑發酵之前)，證實了發酵后95％以上的生物活性肽αS1[91-100]被消耗。
這些觀察顯示，前述生物活性肽的摻入本身不適于生產這樣的食品，尤其是乳制品，其中補充一定量的能隨時間而保持足夠穩定，從而可在消費者中觀察到期望效果的生物活性肽和/或蛋白質。
1.2)利用其它感興趣的生物活性肽的實施例圖2和3舉例說明了結果。
成分Lactium含有許多其它肽，其中一些潛在地有生物活性(例如酪蛋白αS1的片段23-34，其還由DMV International公司以成分C12銷售)。值得一提的是，實際上通過添加Lactium提供的所有肽在發酵期間大部分被消耗掉。
不管它們的來源(來源于多種酪蛋白αS1、αS2、κ或β)和它們的大小(從2～3個殘基到高達12個殘基和更多)，所有的肽在發酵過程全部被消耗掉。
1.3)使用其它發酵劑利用生物活性肽αS1[91-100](Lactium)為了核對這種現象不是上述段落1.1)中使用的兩種發酵劑所特有的，以相同的試驗為基礎，測試了主要的工業發酵劑、還有多種包括在這些發酵劑組成中的純菌株由奶粉重構成乳，向其中加入1.5g/L劑量的Lactium，將其在標準條件(發酵劑的最適宜溫度為37到42℃，在pH4.7時終止發酵，重復兩次)下發酵。然后分析發酵前和發酵后樣品中生物活性肽αS1[91-100]的量。
下面表3給出由純菌株得到的結果表3

上述表3反映了在含有1.5g/L Lactium的乳品混合物發酵期間，多種工業株和發酵劑對生物活性肽αS1[91-100]的消耗，通過它們各自的在CNCM(法國巴黎巴斯德研究所)保藏的號碼和日期確定純菌株。
表3顯示在標準乳品混合物發酵期間，所有試驗發酵劑和菌株代謝94％到100％的生物活性肽αS1[91-100]。因此使用這種成分在標準條件下生產的含有隨時間保持足夠穩定，從而在消費者中產生作用之量的生物活性肽和/或蛋白質的食品，尤其是乳制品是不可能的。
另外，為了核對這種現象不是成分Lactium所特有的，使用相同的試驗研究了發酵劑與其它基于生物活性肽的成分的各種組合(重構的乳+1.5g/L劑量的試驗成分，在標準條件下發酵，在pH4.7終止發酵，重復兩次)。下面表4敘述了多種試驗組合。
表4
表4

由DMV International公司生產的成分C12和CPP是含有生物活性肽的乳蛋白水解產物，所述生物活性肽分別靶向高血壓的控制和礦物的同化。
在所有試驗中可看到，不管其性質和大小如何，所有實驗發酵劑均具有較大的代謝所述肽的能力。
1.4)發酵后添加上述研究步驟的合理替代是在發酵后引入功能性成分(“延遲分化型”工藝)，例如用于發酵物質調味的糖漿。根據這個程序使用相同量的Lactium成分得到圖4舉例說明的結果。
如圖4所示，甚至在發酵后在較冷的條件(4℃)下添加時，在儲藏期間，活性肽(以每kg成品中1.5g Lactium的相當量提供)被迅速降解，到有效期限時僅僅留下初始量的30％到40％。
因此，在成品的儲藏期間，成品中活乳酸菌群繼續代謝生物活性肽，使得僅僅10天后(對于有效期限是28天的新鮮產品)，35％到50％的肽αS1[91-100]已消失，這對消費者得到期望的效果是無法接受的。
1.5)包含感興趣的生物活性成分的發酵乳制品的熱處理在此情況下，可能保證肽αS1[91-100]的穩定性(圖5)，但是犧牲了成品的全面質量。特別是，該解決方案具有許多缺點-對發酵的乳品物質進行的熱殺菌必需使用在熱處理之前添加的穩定劑(果膠、淀粉、角叉菜膠等)，其使過程復雜化并且實際上增加了配方的成本；-工業生產線更復雜并且需要較大的具體投資；-產品不再受益于與含有活發酵劑的產品(例如酸奶)相關的名稱，結果失去了與消耗乳酸發酵劑相關的益處；和-感官影響(通常負面的)很顯著。
實施例2通過施用要求保護的發明，利用感興趣的生物活性成分基于工業發酵劑不消耗肽αS1[91-100]的能力，對工業發酵劑進行篩選。在測試的30種發酵劑中，除了一種發酵劑(含有唯一的菌株I-2774和甲酸鹽的發酵劑，其中所述株I-2774是微生物學上非典型的)以外，所有發酵劑在發酵期間基本上消耗所有肽αS1[91-100]。
測試了另外一種菌株這是1995年10月24日保藏在CNCM的菌株I-1630的天然變體(其自身消耗肽)。通過形成不具有肽轉運系統(AMI-系統)的天然突變體得到這種變體I-3211(2004年5月4日保藏在CNCM)。已有效證明了這種變體既不消耗肽αS1[91-100]，又不消耗大多數的其它肽。在中試水平和甚至在工業水平測試的應用中，通過利用包含菌株I-2774和甲酸鹽的發酵劑能成功地利用以成分Lactium(Ingredia)形式供應的生物活性肽αS1[91-100]。圖6顯示得到的穩定性結果。
甚至更特別是，在發酵之前，可有利地引入所述的肽(這簡化工業化了實施)，如圖7所示。
因此，發酵期間(在～41℃12小時期間)感興趣的肽的消失不超過初始量的3％到4％，而其它發酵劑實際上消耗所有的肽。在表4中描述的那些試驗的等同條件下，發酵后菌株I-2774和I-3211有效地達到大于85％的肽αS1[91-100]殘存水平。
菌株I-2774和I-3211大大降低的代謝肽的能力更廣泛地允許使用任何類型的生物活性肽，其中包括許多已經是確證試驗的主題的商業化水解產物。因此表4中描述的試驗成功地擴展至發酵劑/菌株I-2774和I-3211的用途。
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受理局保留

國際局保留

權利要求
1.一種食品，其含有一種或多種活微生物和至少一種感興趣的生物活性食物成分，其特征在于，使用所述活微生物和所述感興趣的生物活性食物成分，使得所述活微生物對所述感興趣的食物成分的代謝降低。
2.權利要求1的食品，其特征在于，所述食品制備3周后，相對于剛剛制備后產品中存在的感興趣的生物活性食物成分量，所述食品中感興趣的生物活性食物成分的剩余量為約50％到100％。
3.權利要求2的食品，其特征在于，相對于剛剛制備后產品中存在的感興趣的生物活性食物成分量，所述剩余量為約80％到100％。
4.權利要求1-3任一項的食品，其特征在于，所述感興趣的生物活性食物成分選自-蛋白質，-肽，-它們的類似物或衍生物，和-它們的組合。
5.權利要求4的食品，其特征在于，所述感興趣的生物活性食物成分選自肽αS1[91-100]、肽C6-αS1194-199、肽C7-β177-183、肽C12-αS123-34、酪蛋白磷酸肽、α-酪嗎啡肽、α-酪蛋白源外啡肽、酪激肽、β-酪嗎啡肽、酪蛋白巨肽、糖巨肽、casoxine、casoplatellins、片段50-53、β-乳嗎啡樣肽、lactoferroxin、肽Val-Pro-Pro、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu、Tyr-Pro、Ile-Pro-Pro，它們的片段、類似物和衍生物，含有它們的蛋白質和/或肽以及它們的組合。
6.權利要求1-5任一項的食品，其特征在于，所述活微生物對所述感興趣的生物活性食物成分代謝的能力降低。
7.權利要求6的食品，其特征在于，所述活微生物是野生株和/或天然變體和/或通過基因工程得到的突變體。
8.權利要求1-7任一項的食品，其特征在于，所述活微生物是活細菌，優選是乳酸菌。
9.權利要求8的食品，其特征在于，所述活細菌中的選自下列至少一種機制的能力降低了-蛋白質和肽的細胞外代謝系統，-將肽轉運到細胞內的系統，或-肽的細胞內代謝系統。
10.權利要求9的食品，其特征在于，所述機制在所述活細菌中是非功能性的。
11.權利要求9或10的食品，其特征在于，所述機制是將肽轉運到細胞中的系統。
12.權利要求11的食品，其特征在于，所述肽轉運系統是AMI系統或OPP系統。
13.權利要求8-12任一項的食品，其特征在于，所述活細菌選自-鏈球菌屬(Streptococcus spp)，優選嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)；-乳桿菌屬(Lactobacillus spp)；-乳球菌屬(Lactococcus spp)；-雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp)。
14.權利要求13的食品，其特征在于，其至少包含活的嗜熱鏈球菌和乳桿菌屬細菌。
15.權利要求13或14的食品，其特征在于，所述活嗜熱鏈球菌選自-嗜熱鏈球菌，2002年1月24日以I-2774號保藏在CNCM(國家微生物菌種保藏中心(Collection nationale de cultures desmicroorganisms)(法國巴黎巴斯德研究所)；-嗜熱鏈球菌，2004年5月10日以I-3211號保藏在CNCM；-嗜熱鏈球菌，2004年9月16日以I-3301號保藏在CNCM；-嗜熱鏈球菌，2004年9月16日以I-3302號保藏在CNCM。
16.權利要求15的食品，其特征在于，所述活細菌是2004年5月10日以I-3211號保藏在CNCM的嗜熱鏈球菌。
17.權利要求1-16任一項的食品，其特征在于，所述感興趣的生物活性食物成分被包封起來。
18.權利要求1-17任一項的食品，其特征在于，其還包含至少一種誘餌食物成分。
19.權利要求1-18任一項的食品，其特征在于，其是發酵的產品。
20.權利要求19的食品，其特征在于，其是乳制品或植物性產品。
21.制備權利要求1-20任一項的食品的方法，其特征在于，相繼地將所述活微生物和所述感興趣的生物活性食物成分添加到意圖構成所述食品的混合物中。
22.制備權利要求1-20任一項的食品的方法，其特征在于，同時將所述活微生物和所述感興趣的生物活性食物成分添加到意圖構成所述食品的混合物中。
23.制備權利要求1-20任一項的食品的方法，其特征在于，直接在意圖構成所述食品的混合物中制備所述感興趣的生物活性食物成分。
24.制備權利要求23的食品的方法，其特征在于，在原位合成所述感興趣的生物活性食物成分之前，將所述活微生物添加到意圖構成所述食品的混合物中。
25.制備權利要求23的食品的方法，其特征在于，在原位合成所述感興趣的生物活性食物成分期間，將所述活微生物添加到意圖構成所述食品的混合物中。
26.制備權利要求23的食品的方法，其特征在于，在原位合成所述感興趣的生物活性食物成分之后，將所述活微生物添加到意圖構成所述食品的混合物中。
27.權利要求1-20任一項的食品用作功能性食物的用途。
28.代謝感興趣的生物活性食物成分的能力降低的活微生物在食品中用于保護所述感興趣的生物活性食物成分免于所述活微生物的代謝的用途。
全文摘要
本發明涉及含有活微生物和感興趣的生物活性食物成分的食品，其中組織所述活微生物和所述感興趣的生物活性食物成分，使得降低所述活微生物對所述生物活性成分的代謝。更具體而言，本發明涉及降低代謝生物活性成分能力的活微生物的用途。
文檔編號A23L1/305GK101060786SQ200580039975
公開日2007年10月24日 申請日期2005年10月17日 優先權日2004年10月22日
發明者佩吉·加羅, 讓-米歇爾·福里, 熱羅姆·芒戈, 克洛艾·貝亞爾, 蒂埃里·圣－丹尼斯 申請人:達能日爾維公司