專利名稱：一種大麥耐低氮性狀鑒定及篩選的方法
技術領域：
本發明屬于大麥育種技術領域，涉及以種子作為繁殖方式的大麥的耐低氮性狀篩 選和鑒定。
背景技術：
大麥是制造啤酒的主要原料，也是優良飼料。近年來，隨著我國啤酒工業的迅猛發 展，對啤酒大麥的需求越來越大。氮素是作物生長必需的營養元素，為了保證了作物高產和 穩產，就必須大量施用氮肥。近年來，隨著氮肥的大量使用，在促進作物增產、穩產的同時， 也帶來了諸多弊端，如經濟效益下降、氮肥利用率降低、環境污染等等，不僅造成了巨大的 經濟損失，而且嚴重污染了環境，對人類健康構成了潛在的威脅。啤酒大麥要求籽粒蛋白質 含量的優級標準為10% _12%，但生產上往往為了追求產量而增大氮肥施用量或生育中后 期重施追肥，結果籽粒蛋白質含量超標，因而降低了大麥的釀造品質。因此，篩選和培育耐 低氮、氮高效大麥新品種將是解決這些問題的理想途徑。從目前的研究手段來看，耐低氮的篩選一般采用苗期和全生育期相結合的方法， 通過溶液培養試驗、盆栽試驗和田間試驗調查不同指標，從而評價品種的耐低氮性。田間試 驗結果比較可信，但往往受到空間和時間的限制；而溶液培養試驗和盆栽試驗就可以就某 些形態學和生理指標對大批量的基因型在早期進行快速篩選，并且培養條件可以準確無誤 地進行重復，但其可信性有待商榷。以往也有關大麥氮高效利用和耐低氮的研究，有的只是 通過盆栽法對大麥苗期氮素生理利用率的遺傳效應作了初步探索，并對對苗期大麥耐低氮 性進行了初步的評價和篩選，有的通過田間試驗研究了低氮脅迫下不同基因型大麥成熟期 氮素利用相關性狀及產量的遺傳變異。但這些都沒有把大麥苗期耐低氮相關性狀和產量性 狀結合起來對耐低氮性進行評價和篩選。因此采用溶液培養試驗結合田間試驗的方法研究 了大麥耐低氮性，既可以比較苗期大麥各基因型在正常供氮和低氮脅迫間的差異，又可以 比較成熟期大麥各基因型在施肥和不施肥間的差異，同時兼顧了溶液培養的簡單、重復性 好等特點和田間試驗的真實性，為科學評價大麥耐低氮性提供了較好的保證，從而也為大 麥苗期快速有效的耐低氮篩選奠定基礎。本領域需要通過快速有效的手段來揭露在生產上被長期掩蓋的大麥耐低氮品種 材料，挖掘大麥種質庫中耐低氮種質資源，以獲得以種子作為繁殖方式的大麥耐低氮性狀 生產品種或者耐低氮種質資源，從而能夠在較少的施肥栽培模式中或者在我國貧瘠的土地 上進行種植生產，以提高經濟和環保效益，并且更廣泛的利用土地資源，篩選更多的耐低氮 遺傳種質資源也可以為我國進一步的大麥耐低氮育種服務。
發明內容
本發明針對大麥耐低氮篩選和鑒定方面的不足，提供一種新的大麥耐低氮篩選和 鑒定的方法，且苗期篩選條件易于統一控制，不受外界自然條件的限制，而田間試驗又比較 有說服力，保證結果準確可靠。
因此，本發明第一方面提供一種大麥耐低氮篩選和鑒定的方法，該方法包括1)使用溶液培養液培養大麥麥苗，設低氮和正常供氮2個處理，約4-5周后收苗， 對苗期生物學及相關生理指標進行調查，所述生理指標包括氮素生理利用率、單株吸氮量、 地上部干重、株高和分蘗數，進行苗期耐低氮評價和篩選；2)用相同的品種在麥作區進行大田試驗，設正常施氮肥和不施氮肥2個處理，成 熟后測產對大麥進行耐低氮評價和鑒定；3)建立苗期和成熟期大麥耐低氮性的相關性，確立苗期篩選指標，從而在苗期對 大麥耐低氮性進行篩選。在一優選實施例中，所述低氮的氮濃度范圍是0. 1-0. 8mmol/L,正常供氮的氮濃度 范圍是 l_3mmol/L。在另一優選實施例中，所述低氮的氮濃度范圍是0. 2-0. 6mmol/L，正常供氮的氮濃 度范圍是 1. 5-2. 5mmol/L0在一優選實施例中，所述溶液培養液的pH為5. 5-6. 0。在一優選實施例中，所示溶液培養液的pH為5. 6-5. 8。在一優選實施例中，所述氮源以NH4NO3形態供應于溶液培養液中。在一優選實施例中，所述苗期篩選指標為苗期氮素生理利用率和/或分蘗數。在一優選實施例中，篩選獲得苗期氮素生理利用率相對值> 1.8、分蘗數相對值 ^ 0. 8的麥苗，其為耐低氮大麥麥苗，其中，所述苗期氮素生理利用率相對值為低氮脅迫下 的性狀值/正常供氮下的性狀值。本發明另一方面還提供一種耐低氮大麥篩選和鑒定的方法，該方法包括使用溶液培養液培養大麥麥苗，設低氮和正常供氮2個處理，4-5周后收苗，測量 氮素生理利用率和分蘗數；其中，氮素生理利用率相對值> 1. 8、分蘗數相對值> 0. 8的麥苗選為耐低氮大 麥，其中，所述苗期氮素生理利用率相對值為低氮脅迫下的性狀值/正常供氮下的性 狀值。在一優選實施例中，所述低氮的氮濃度范圍是0. l-0.8mmol/L，正常供氮的氮濃度 范圍是 l_3mmol/L。在另一優選實施例中，所述低氮的氮濃度范圍是0. 2-0. 6mmol/L,正常供氮的氮濃 度范圍是 1. 5-2. 5mmol/L0在一優選實施例中，所述溶液培養液的pH為5. 5-6. 0。在一優選實施例中，所示溶液培養液的pH為5. 6-5. 8。在一優選實施例中，所述氮源以NH4NO3形態供應于溶液培養液中。在一優選實施例中，所述方法還包括將篩選得到的麥苗進行大田實驗，設正常供 氮處理和低氮處理，成熟后測定對大麥進行耐低氮評價和鑒定。在一優選實施例中，所述氮素生理利用率=地上部干物重/地上部氮素積累 量 X100%o
圖1顯示大麥各相對性狀值，其中，1 相對氮素生理利用率；2 相對單株吸氮量； 3 相對地上部干重；4 相對苗高；5 相對分蘗數；6 相對籽粒產量。圖2顯示大麥各相對性狀的變異系數，其中，1 相對氮素生理利用率；2 相對單株 吸氮量；3 相對地上部干重；4 相對苗高；5 相對分蘗數；6 相對籽粒產量。
具體實施例方式本申請提供一種大麥耐低氮篩選和鑒定的方法，該方法包括1)使用溶液培養液培養大麥麥苗，設低氮和正常供氮2個處理，約4-5周后收苗， 對苗期生物學及相關生理指標進行調查，所述生理指標包括氮素生理利用率、單株吸氮量、 地上部干重、株高和分蘗數，進行苗期耐低氮評價和篩選；2)用相同的品種在麥作區進行大田試驗，設正常施氮肥和不施氮肥2個處理，成 熟后測產對大麥進行耐低氮評價和鑒定；3)建立苗期和成熟期大麥耐低氮性的相關性，確立有效的苗期篩選指標，從而在 苗期對大麥耐低氮性進行規模化和快速有效的篩選。溶液培養試驗在實驗室溫室中進行，溶液培養液的配置方法參照國際水稻所營養 液配方，并可略作改動。在一具體實施例中，溶液培養液的配方可以如下表1所示(單位mg/L)表 1大量元素NH4NO3114.3NaH2PO4 · 2H2050. 4K2SO489. 3CaCl2110.8MgSO4 · 7H20405. 0微量元素MnCl2 · 4H201. 875(NH4) 6Mo7024 · 2H20 0. 093H3BO31. 168ZnSO4 · 7H200. 044CuSO4 · 5H200. 039鐵鹽FeSO4 · 7H200. 028Na2EDTA0.037所用試劑為常用化學試劑，在一般化學試劑公司就可以購買，培養液pH通常在 5. 5-6. 0范圍內。優選的，該溶液培養液的pH可在5. 6-5. 8的范圍內。本領域技術人員將理解，可對上表所示的濃度作出適當的變動，例如有大約5% (例如3%左右、2%左右、左右，或更低的變動范圍)或更低的變動，由此配制得到的培 養基仍然具有所需的生物學功能，仍能用于實施本發明。例如，以MgSO4 -IW2O為例，每升培養液中可含有大約384. 8-425. 3mg的MgSO4 · 7H20(約5%的變動幅度)。其它成分的濃度 也可如此變動。此外，該溶液培養液中的成分也可使用功能和性質相同或相似的成分加以替換。在實施本發明時，可先消毒種子，例如用1 % NaClO消毒大約30分鐘，用清水沖洗 干凈后，在30士2°C浸種4-5小時，25士2°C催芽過夜，露白后播種到經高溫高壓滅菌的蛭石 中。可在兩葉一心時，挑選整齊一致的幼苗，去胚乳后用海綿條固定在打孔的泡沫板上，然 后放入盛有清水的周轉箱(例如40CmX27CmX10Cm)中，恢復兩到收三天后換上如前文所 述的營養液，每塊泡沫板上平均分布約30個孔(7X5)。在一個實施方式中，設3個品種，每個品種5株，設低氮(0. 4mmol/L)和正常供氮 Omrno 1/L) 2 個處理。低氮的氮濃度范圍可以是0. 1-0. 8mmol/L，例如可以是0. 2-0. 6mmol/L，更優選為
0.4-0.5mmol/L。正常供氮的氮濃度范圍可以是l-3mmol/L，例如可以是1. 5-2. 5mmol/L，更優選為
1.8-2. 2mmol/L0在一具體實施例中，低氮的氮濃度是大約0.4mmol/L，正常供氮的氮濃度是大約 2mmol/L。氮可以以NH4NO3形態供應，也可以其它無機氮源的形式提供。可每周更換一次營養液，每天補充水分，調pH為5. 5士0. 2左右。病、蟲害按常規 方法管理，約5周后收苗調查相關指標，如氮素生理利用率、單株吸氮量、地上部干重、苗高 和分蘗數。這樣對大麥苗期進行初步的耐低氮性評價。相關的生理指標可如下計算含氮量=地上部氮素積累量/地上部干物重X 100%氮素生理利用率=地上部干物重/地上部氮素積累量X 100%單株吸氮量=含氮量X平均單株地上部干重在具體實施時，在溶液培養試驗中，收獲的苗先用自來水沖洗干凈，再用去離子水 沖洗，測定苗高，數分蘗，然后取地上部苗，分別在105士5°C下殺青約30分鐘，70士3°C下烘 至恒重，測定地上部干物重，磨細過0. 25毫米篩，凱氏定氮法測定全氮。通過計算就可以得 出地上部氮素積累量。平均單株地上部干重為所測得的地上部干物總重/用于檢測地上部 干重的麥苗總數。田間試驗在試驗基地的農場進行。在一個具體實施方式
中，試驗所在地為稻、麥輪 作地，土質為壤土，表層土壤約20 士 3厘米厚，含有機質34. 5 士 3g/kg，全氮2. 42 士0. 3g/kg， 速效氮37. 35士;3mg/kg。試驗采用裂區設計，主區為肥料處理，設正常施氮肥和不施氮肥2 個處理，副區可根據實際檢測的品種劃分相應數量的小區，每個小區面積約為7. 5平方米， 3次重復(即每個處理每個品種都有3次重復，以消除不同位置土壤之間的差異)。在一個 實施例中，副區為3個品種。成熟后，收獲大麥籽粒，測產。這樣可以對大麥耐低氮性進行 真實可靠的評價和鑒定。在一具體實施例中，本申請獲得了對氮素不同反應的三種大麥品種，其中BI-04 耐低氮性最好，BI-45最敏感，BI-35介于兩者之間。把大麥苗期低氮脅迫下的性狀值/正常供氮下的性狀值即為大麥苗期耐低氮性 狀相對值，把大麥成熟期不施肥下的籽粒產量/正常施肥下的籽粒產量即為大麥耐低氮相對值，該值越高，耐低氮性也越強。通過苗期耐低氮性狀和成熟期耐低氮性狀間的相關性分析，發現在低氮脅迫下分 蘗數與籽粒產量呈極顯著正相關關系，相對氮素生理利用率、相對苗高與籽粒產量分別都 呈極顯著正相關關系，考慮到相對苗高變異系數特別小，因此可以認為以低氮脅迫下分蘗 數和苗期相對氮素生理利用率作為大麥苗期耐低氮篩選的重要指標，而苗期相對苗高作為 輔助篩選指標。從而為大麥苗期大規模快速有效的進行耐低氮評價和篩選服務。經進一步的比較研究所獲得實驗數據發現，大麥苗期氮素生理利用率相對值 ^ 1. 8、分蘗數相對值> 0. 8可以認為是耐低氮的材料。因此，本申請涉及一種耐低氮大麥篩選和鑒定的方法，該方法包括溶液培養大麥麥苗，設低氮和正常供氮2個處理，約4-5周后收苗，測量氮素生理 利用率和分蘗數；其中，氮素生理利用率相對值> 1. 8、分蘗數相對值> 0. 8的麥苗選為耐低氮大麥。在一個優選實施例中，上述方法還包括將篩選得到的麥苗進行大田實驗，設正常 供氮處理和低氮處理，成熟后測定對大麥進行耐低氮評價和鑒定。本申請的技術方案易于實施，既和以往單單研究苗期或成熟期的耐低氮性不同， 也和以往僅僅在實驗室或田間做耐低氮研究不同，而是同時通過苗期的溶液培養試驗和田 間產量試驗，比較分析了在兩種供氮條件下大麥苗期耐低氮相關性狀和成熟期籽粒產量的 變異情況，并尋找出苗期耐低氮相關性狀與成熟期產量性狀的相關性關系，從而在苗期可 以對大麥進行快速有效的耐低氮篩選，大膽淘汰苗期耐低氮性差的品種，把苗期耐低氮性 好的品種在進行田間進行產量試驗，從而獲得真正耐低氮性好的品種，結果真實可信。申請人:的實驗表明，通過該法可以獲得有效的大麥耐低氮篩選和鑒定指標，并且 準確區分出了耐低氮型、氮敏感型和中間型三種大麥品種類型，也為苗期大規模耐低氮品 種篩選奠定了基礎。下文將以大麥為例對本發明進行描述。應理解，在不偏離本發明精神和范圍的情 況下可對本發明做出各種修改和變動。以下實施例僅僅是闡述性的，本發明的范圍由本申 請的權利要求加以限定。此外，應理解，上述各試劑的類型可以做一定的修改，只要滿足相 關元素的供給以實現本發明的發明目的即可。此外，組合本申請所公開的各種優選范圍所 得到的技術方案也在本申請的保護范圍之內。實施例實施例1 利用溶液試驗對大麥苗期耐低氮的評價和篩選溶液培養試驗在實驗室溫室中進行，營養液配置方法參照國際水稻所營養液配方 (略有改動)。種子用1 % NaClO消毒30分鐘，用清水沖洗干凈，30°C浸種5小時，25°C催芽 過夜，露白后播種到經高溫高壓滅菌的蛭石中，兩葉一心時，挑選整齊一致的幼苗，去胚乳 后用海綿條固定在打孔的泡沫板上，然后放入盛有清水的周轉箱(40CmX27CmX10Cm)中， 恢復兩天后換上營養液，每塊泡沫板上平均分布30個孔(7X幻，設3個品種，每個品種5 株，設低氮(0. 4mmol/L)和正常供氮Qmmol/L) 2個處理，以NH4NO3形態供應，3次重復，每 周更換一次營養液，每天補充水分，調PH為5. 5左右，病、蟲害按常規方法管理，5周后收苗 調查相關指標，如氮素生理利用率、單株吸氮量、地上部干重、苗高和分蘗數。這樣對大麥苗 期進行初步的耐低氮性評價。實驗結果見下表2和3。
含氮量=地上部氮素積累量/地上部干物重X 100%氮素生理利用率=地上部干物重/地上部氮素積累量X 100%單株吸氮量=含氮量X平均單株地上部干重地上部干物重和地上部氮素積累量如前文所述測量。表2 正常供氮水平下大麥相關性狀的基因型差異
品種氮素生理 利用率(g 干重/g氮)單株吸氮 量(mg)地上部干 重(g)苗高 (cm)分蘗數BI-0423.95士 0.830.0146士 0.0010a0.3501 士 0.0314a44.17士 1.37a2.67士 0.31a
BI-3523.34土 0.370.0172士 0.0027a0.4016士 0.0586a43.65土 2.25a3.20土 0.20abBI-4523.05土 0.340.0273 ± 0.0026b0.6285 士 0.0543b50.93 土 3.29b3.67士 0.31b變異系數 (%)1.9633.9732.208.7815.75
表3 低氮脅迫下大麥相關性狀的基因型差異品種氮素生理利 用率(g干重 /g氮)單株吸氮 量(mg)地上部干 重(g)苗高 (cm)分蘗 數BI-0445.80士 4.17a0.0086士 0.0009a0.3921 土 0.0410a38.23士 2.53a2.43 土 0.40
BI-3541.17士 0.32ab0.0070 士 0.0004b0.2876士 0.0187b37.22士 2.03a2.00土 0.20BI-4537.83 + 1.20b0.0100土 0.0006c0.3777士 0.0349a42.83 士 1.03b1.80士 0.40變異系數 (%)9.6217.5516.067.5915.58實施例2 利用大田試驗對大麥成熟期耐低氮的評價和鑒定田間試驗在試驗基地的農場進行，本次試驗所在地為稻、麥輪作地，土質為壤土， 表層20厘米厚土壤含有機質34. 5g/kg，全氮2. 42g/kg，速效氮37. 35mg/kg。試驗采用裂區 設計，主區為肥料處理，設正常施氮肥和不施氮肥2個處理，副區為3個品種，每個小區面積 約為7. 5平方米，3次重復。成熟后，收獲大麥籽粒，測產。這樣可以對大麥耐低氮性進行真 實可靠的評價和鑒定。所使用的大麥與實施例1苗期實驗所使用的大麥屬于相同品種。實驗同時也獲得了對氮素不同反應的三種大麥品種，其中BI-04耐低氮性最好，
8BI-45最敏感，BI-35介于兩者之間。實驗結果見下表4。
表4 兩種施肥水平下大麥籽粒產量性狀基因型差異
權利要求
1.一種大麥耐低氮篩選和鑒定的方法，該方法包括1)使用溶液培養液培養大麥麥苗，設低氮和正常供氮2個處理，約4-5周后收苗，對苗 期生物學及相關生理指標進行調查，所述生理指標包括氮素生理利用率、單株吸氮量、地上 部干重、株高和分蘗數，進行苗期耐低氮評價和篩選；2)用相同的品種在麥作區進行大田試驗，設正常施氮肥和不施氮肥2個處理，成熟后 測產對大麥進行耐低氮評價和鑒定；3)建立苗期和成熟期大麥耐低氮性的相關性，確立苗期篩選指標，從而在苗期對大麥 耐低氮性進行篩選。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述低氮的氮濃度范圍是0.1-0. 8mmol/L, 正常供氮的氮濃度范圍是l-3mmol/L。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述溶液培養液的pH為5.5-6. 0，所述 氮源以NH4NO3形態供應于溶液培養液中。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述苗期篩選指標為苗期氮素 生理利用率和分蘗數。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，篩選獲得苗期氮素生理利用率相對值 ^ 1. 8、分蘗數相對值> 0. 8的麥苗，其為耐低氮大麥麥苗，其中，所述苗期氮素生理利用率 相對值為低氮脅迫下的性狀值/正常供氮下的性狀值。
6.一種耐低氮大麥篩選和鑒定的方法，該方法包括使用溶液培養液培養大麥麥苗，設低氮和正常供氮2個處理，4-5周后收苗，測量氮素 生理利用率和分蘗數；其中，氮素生理利用率相對值> 1. 8、分蘗數相對值> 0. 8的麥苗選為耐低氮大麥，其中，所述苗期氮素生理利用率相對值為低氮脅迫下的性狀值/正常供氮下的性狀值。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述低氮的氮濃度范圍是0.1-0. 8mmol/L, 正常供氮的氮濃度范圍是l-3mmol/L。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述溶液培養液的pH為5.5-6. 0，所述 氮源以NH4NO3形態供應于溶液培養液中。
9.如權利要求6-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將篩選得到的 麥苗進行大田實驗，設正常供氮處理和低氮處理，成熟后測定對大麥進行耐低氮評價和鑒 定。
10.如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述氮素生理利用率=地上部干 物重/地上部氮素積累量X 100%。
全文摘要
本發明提供一種大麥耐低氮篩選和鑒定的方法，該方法包括利用溶液培養法對苗期耐低性性狀進行篩選和鑒定，利用大田試驗對成熟期耐低氮性狀進行篩選和鑒定，通過對苗期和成熟期相關性的建立對大麥耐低氮性進行有效的評價，以便在苗期對大麥耐低氮性進行快速有效的篩選和鑒定。本發明實施方法簡易，實驗室部分精確可控，田間部分真實準確，使得結果有效可靠。
文檔編號A01G1/00GK102106247SQ20091020061
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者何婷, 王亦菲, 陸瑞菊, 陳志偉, 黃劍華 申請人:上海市農業科學院, 上海科立特農科(集團)有限公司, 上海綠劍農業科技有限公司