本發明屬于分子遺傳育種技術領域，具體涉及梨果心大小主效qtl位點的分子標記marker37152及其引物對和應用。
背景技術：
梨(pyrusl.)是我國重要的經濟作物，面積和產量均居世界首位。梨果心大小是梨果實品質重要的經濟性狀，直接關系到果實可食率的大小。小果心是育種工作者重要的育種目標之一。
梨為多年生木本植物，世代周期長，結果晚。傳統育種中，主要利用果實表型進行優良基因的選擇，需要經過童期后方能進行觀察，且易受到外界環境的影響，育種手段存在耗時長、消耗大、隨機性強的問題。以分子標記為主要手段的基因型選擇技術可有效解決以上問題。而以構建雜交群體進行連鎖作圖并定位果心大小性狀qtl(quantitativetraitloci，數量性狀基因座)是目前開發與果心大小qtl緊密連鎖分子標記的主要方法。通過此方法獲得的與果心大小緊密連鎖的分子標記可用于分子標記輔助育種，并在苗期進行目標性狀的提前選擇。
目前，國內外仍未見梨果心大小性狀的qtl定位報道。因此，開展梨果心大小主效qtl的定位，并開發相連鎖的分子標記，建立分子標記輔助育種體系可在苗期進行果心大小的鑒定，能有效提高該性狀的育種效率。
技術實現要素：
本發明目的是提供一種梨果心大小主效qtl位點fcs的分子標記marker37152及其引物對。
本發明另一目的是提供分子標記marker37152的引物對在檢測與梨果心大小主效qtl位點連鎖的分子標記marker37152的方法。
本發明又一目的是提供分子標記marker37152用于檢測梨果心大小的方法。
本發明又一目的是提供分子標記marker37152的引物對在梨分子育種中的應用。
本發明再一目的是提供分子標記marker37152在梨分子育種中的應用。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
本發明提供一種梨果心大小主效qtl位點的分子標記marker37152的引物對，所述引物對的正向引物序列如seqidno:1所示，反向引物序列如seqidno:2所示。
本發明還提供了一種梨果心大小主效qtl位點的分子標記marker37152，所述分子標記marker37152位于登錄號為ajsu00000000.1的‘碭山酥梨’基因組scaaffold468.0的第180673～180849堿基處；分子標記marker37152的實際長度為200bp，其dna序列為如seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5中所示的任意一種；分子標記marker37152與梨果心大小主效qtl位點的遺傳距離為0cm。
本發明還提供了上述引物對在引物對在檢測與梨果心大小主效qtl位點連鎖的分子標記marker37152的方法，包括以下步驟：以待檢測梨的基因組dna為模板，利用分子標記marker37152的引物對為引物進行pcr擴增，擴增產物經過ta克隆并測序，得到長度557bp大小的dna序列；將上述dna序列與分子標記marker37152的堿基序列進行比對，若上述dna序列內含有如seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5所示的3種序列中的任何一種序列信息，則表明存在與qtl位點連鎖的分子標記marker37152。
上述梨果心大小主效qtl位點被命名為fcs，位于梨基因組的第12染色體，定位到‘紅茄梨’ב晚秀梨’聯合遺傳連鎖圖譜的99.33cm處，貢獻率為20％。
本發明還提供了上述分子標記marker37152用于檢測梨果心大小的方法，包括以下步驟：以待檢測的梨基因組dna為模板，利用分子標記marker37152的引物對為引物進行pcr擴增，得到長度557bp大小的dna序列；將上述dna序列與分子標記marker37152的堿基序列進行比對，若上述dna序列內含有seqidno:3所示的序列信息，則該梨果心為大果心表型；若上述dna序列內同時含有seqidno:4和seqidno:5所示的序列信息，則該梨果心為小果心表型。
本發明還提供了上述分子標記marker37152的引物對在梨分子育種中的應用。
本發明還提供了上述分子標記marker37152在梨分子育種中的應用。
本發明中對梨果心大小的定義如下：
根據梨的果心橫徑與果實橫徑的比值大小，把果心大小劃分為大果心、中等果心、小果心三個表型級別，比值大于等于0.5為大果心，比值大于0.4小于0.5為中等果心，比值小于等于0.4為小果心。
相比現有技術，本發明的有益效果在于：
1.目前普遍認可的應用于分子輔助選擇的連鎖標記與目標性狀的距離需≤5.0cm，而本發明所采用的分子標記marker37152與梨果心大小主效qtl位點fcs的遺傳距離為0cm，連鎖十分緊密，大大提高了分子標記篩選梨果心大小主效qtl的準確性和該性狀的育種效率，具有良好的應用價值，可加快對梨果心大小性狀的改良。
2.本發明所采用的分子標記marker37152的實際長度為200bp，更加有利于不同種質間基因差異的比較和梨果心大小性狀相關功能基因的挖掘。
附圖說明
圖1為本發明梨果心大小主效qtl位點在‘紅茄梨’和‘晚秀梨’的聯合遺傳圖譜第12連鎖群上的位置圖。其中，lg代表連鎖群，lg后的數字代表連鎖群數；連鎖群上左側的數字是標記之間的遺傳距離，單位為cm，右側表示的是分子標記的名稱；連鎖群右側的實心長方形指示qtl作圖區間，連鎖群右側的曲線圖為qtl的lod分布圖。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限定本發明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例一梨果心大小qtl位點的定位及其連鎖分子標記的獲得
(1)以梨品種‘紅茄梨’為母本、‘晚秀梨’為父本配置雜交組合，獲得171株f1代雜交群體。期間部分植株死亡，剩余161株用于構建‘紅茄梨’和‘晚秀梨’的聯合遺傳連鎖圖譜。
(2)采用slaf標記技術，利用dna限制性內切酶haeiii和rsai對f1群體單株和雙親基因組dna進行酶切，進行3’端加a處理、連接dual-index測序接頭、pcr擴增、純化、混合樣品、切膠選取目的片段，文庫質檢合格后用illuminahiseqtm進行測序，獲得slaf標記。其中slaf標記技術的實驗操作程序參考xsun.dliu.xzhang等(slaf-seq:anefficientmethodoflarge-scaledenovosnpdiscoveryandgenotypingusinghigh-throughputsequencing[j].plosone.2013:8(3):e58700)的方法。
slaf標記的篩選方法如下：(1)過濾父母本測序深度10×以下的標記；(2)過濾slaf序列中snp數目大于5的標記；(3)過濾親本完全純合的多態性標記；第四：過濾基因型覆蓋所有子代個體少于70％的標記；(4)過濾卡方檢驗(p＜0.05)的多態性標記。
按照上述篩選方法，根據f1群體各個標記的親本序列特征進行‘cp’模型分型，共分為lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd5種分離類型，缺失標記記為“-”，統計符合slaf標記在f1作圖群體中的分離數據，最后獲得符合‘cp’模型的高質量slaf標記3984個，結合207個ssr標記，通過joinmap4.0軟件對多態性標記位點進行連鎖分析，最終構建了一張包含4191個標記的‘紅茄梨’和‘晚秀梨’的高密度聯合遺傳連鎖圖譜：4191個標記位點分布在17個連鎖群，命名為lg1～lg17，覆蓋基因組長度1893.61cm，標記間平均距離為0.47cm。
(3)在果實成熟期，調查f1代群體果實橫徑和果心橫徑，計算果心橫徑與果實橫徑的比值，根據比值的大小把果心大小劃分為大果心、中等果心、小果心三個級別，比值大于等于0.5為大果心，比值大于0.4小于0.5為中等果心，比值小于等于0.4為小果心。
本發明中測定了2015年結果的80株‘紅茄梨’和‘晚秀梨’的雜交后代f1代單株的果心大小，測量結果如表1所示，2015年結果的80株f1代單株中小果心有21株，中等果心有33株，大果心有24株，2株數據缺失。根據計算的果心橫徑與果實橫徑的比值，使用mapqtl5.0軟件通過置換檢驗(permutationtest)(次數>1000)確定閾值，采用區間作圖(intervalmapping)檢測出lod峰值的標記位點。
表12015年結果的80株f1雜交單株的果心大小數據
(4)結果表明，2015在‘紅茄梨’和‘晚秀梨’群體的聯合遺傳連鎖圖譜上的第12連鎖群檢測到果心大小的qtl位點，該位點被命名為fcs，位于梨基因組的第12染色體，如圖1所示，fcs定位到‘聯合遺傳連鎖圖譜的99.33cm處，與其連鎖最近的分子標記為marker37152，fcs與分子標記marker37152的遺傳距離為0cm，lod值為3.73，貢獻率為20％，該qtl位點fcs為主效qtl。
上述分子標記marker37152位于登錄號為ajsu00000000.1的‘碭山酥梨’基因組scaaffold468.0的第180673～180849堿基處；分子標記marker37152的實際長度為200bp，其dna序列為如seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5中所示的任意一種；分子標記marker37152與梨果心大小主效qtl位點的遺傳距離為0cm。值得說明的是，分子標記marker37152是利用兩端測序得到的，包含read1和read2兩個序列，共200bp，read1和read2兩個序列間有76bp未包含snp的堿基，用n代替。
其中檢測與梨果心大小主效qtl位點fcs連鎖的分子標記marker37152的方法，包括以下步驟：以待檢測梨的基因組dna為模板，利用分子標記marker37152的引物對為引物進行pcr擴增，擴增產物經過ta克隆并測序，可得到長度557bp大小的dna序列；將上述dna序列與分子標記marker37152的堿基序列進行比對，若上述dna序列內含有如seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示的3種序列中的任何一種序列信息，則表明存在與qtl位點fcs連鎖的分子標記marker37152。
上述分子標記marker37152的引物對如下：
正向引物seqidno.1為：5'tgcaccttggttgacgtgcaagttg3'；
反向引物seqidno.2為：5'aggattttatttactaaatgagtgc3'。
pcr擴增體系為(20μl)：10×buffer(mg2+plus)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10mmol/l正向引物0.6μl，10mmol/l反向引物0.6μl，taqdna聚合酶0.5u，dna模板50ng，雙蒸水補加至總體積為20μl；
pcr擴增的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共32個循環；72℃延伸10min。
實施例二分子標記marker37152及其引物在梨分子育種中的應用
(1)以梨品種‘紅茄梨’為母本、‘晚秀梨’為父本配置雜交組合，2015年獲得80株結果的f1代雜交群體。
(2)在果實成熟期，調查f1代群體果實橫徑和果心橫徑，計算果心橫徑與果實橫徑的比值，根據比值的大小把果心大小劃分為大果心、中等果心、小果心三個表型級別，比值大于等于0.5為大果心，比值大于0.4小于0.5為中等果心，比值小于等于0.4為小果心。
測定上述80株f1代單株的果心大小，結果如實施例一中的表1所示，2015年結果的80株f1代單株中小果心有21株，中等果心有33株，大果心有24株，2株數據缺失。
(3)利用分子標記marker37152檢測上述80株f1代單株的梨果心大小，方法的具體步驟如下：以80株f1代單株的基因組dna為模板，利用分子標記marker37152的引物對為引物進行pcr擴增，得到長度557bp大小的dna序列；將上述dna序列與分子標記marker37152的堿基序列進行比對，若上述dna序列內含有seqidno:3所示的序列信息，則該梨果心為大果心表型；若上述dna序列內同時含有seqidno:4和seqidno:5所示的序列信息，則該梨果心為小果心表型。
上述分子標記marker37152的引物對如下：
正向引物seqidno.1為：5'tgcaccttggttgacgtgcaagttg3'；
反向引物seqidno.2為：5'aggattttatttactaaatgagtgc3'。
pcr擴增體系為(20μl)：10×buffer(mg2+plus)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10mmol/l正向引物0.6μl，10mmol/l反向引物0.6μl，taqdna聚合酶0.5u，dna模板50ng，雙蒸水補加至總體積為20μl；
pcr擴增的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共32個循環；72℃延伸10min。
(4)結果表明，21株小果心單株中同時含有序列seqidno.4和seqidno.5所示的序列信息的單株為15株，占小果心單株總數的71.4％；24株大果心單株中含有seqidno.3所示的序列信息的單株為16株，占大果心單株總數的66.7％。由此看出，利用分子標記marker37152檢測梨果心大小的正確率較高，具有良好的應用價值，可加快對梨果心大小性狀的改良。
以上所述之實施例，只是本發明的較佳實施例而已，僅僅用以解釋本發明，并非限制本發明實施范圍，對于本技術領域的技術人員來說，當然可根據本說明書中所公開的技術內容，通過置換或改變的方式輕易做出其它的實施方式，故凡在本發明的原理及工藝條件所做的變化和改進等，均應包括于本發明申請專利范圍內。
sequencelisting
<110>中國農業科學院鄭州果樹研究所
<120>梨果心大小主效qtl位點的分子標記marker37152及其引物對和應用
<130>2017
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