專利名稱：一種構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的方法及其專用誘發劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的方法及其專用誘發劑。
背景技術：
卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤，發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，但其死亡率卻占婦科腫瘤首位。近年來卵巢癌發病率出現逐漸增高的趨勢，嚴重影響女性健康。 卵巢癌病程隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，發現時多數患者已近晚期。常規的手術、化療 和放療雖然可以緩解癥狀，但難以提高患者的生存率。分子生物學和腫瘤免疫學研究為卵 巢癌的細胞生物治療提供了理論基礎和技術方法。但細胞治療用于臨床前須進行安全性及 有效性評價，卵巢癌動物模型尤為重要，特別是能夠反映卵巢癌病理發展過程及臨床特征 的人鼠嵌合模型。自1969年Rygaard等進行裸鼠異種移植入惡性腫瘤獲得成功以來，裸鼠 已成為人們研究惡性腫瘤生物學特性的工具。近年來，已有研究報道了裸鼠卵巢癌皮下移 植瘤模型(張長英，成文彩.人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立[J].武漢科技大學學報 (自然科學版).2001，24(1) :99;高國蘭，鄒春芳，等.人卵巢上皮性癌裸鼠皮下移植瘤模 型的建立及生物學性狀的鑒定.實用癌癥雜志，2004，19 (5) :454-457)。但皮下移植瘤模型 不能很好的反應卵巢癌的病理進展，所以進一步應用受到了很大的限制。張殊等人將高轉 移性人卵巢癌細胞(HO-8910PM)制成懸液注入裸鼠皮下，獲得皮下移植瘤，然后取瘤組織 塊進行卵巢原位移植，經過77天觀察移植物出現轉移(張殊，林其德，狄文，卵巢癌原位移 植-轉移動物模型的建立，中華婦產科雜志，2004,39(12) :835-837)。但建立該模型存在以 下的問題裸鼠卵巢較小，無論是接種還組織塊移植均很困難且周期較長，并且種植于“原 位”即卵巢上皮內，技術難度較大，限制了該模型的應用范圍。另有研究報道，將抽取臨床卵 巢癌患者的腹水直接注入裸鼠腹腔(陳愛平，王和，彭芝蘭等，人卵巢癌裸鼠移植瘤和腹水 瘤模型的建立及形態學觀察，腫瘤，2001，21 (2) 82-84)，屬于原代移植，成瘤潛伏期長，移 植物獲取存在一定的困難。綜上所述，構建既符合卵巢癌臨床特征，又便于實驗觀察和分析 的人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型已成為亟需解決的問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種用于構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的誘發劑。本發明所提供的用于構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的誘發劑，由Ho8910細胞和 1640培養基組成，每支誘發劑的體積為0. 2ml，每支誘發劑中Ho8910細胞的數目為2X106 個，每支誘發劑對應一只3-5周齡的鼠一次使用完畢。上述誘發劑中，每1升所述1640培養基是按照如下方法配制的將10. 4克1640 干粉培養基和2.0克NaHCO3溶于水中，調節pH值為7. 2，用水定容至1升，得到1升1640
培養基。上述誘發劑中，所述鼠為BALB/C裸鼠。本發明的另一個目的是提供一種構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的方法。
本發明所提供的構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的方法，包括如下步驟將上述任 一所述誘發劑腹腔注射于3-5周齡的鼠，得到接種Ho8910細胞的鼠，將所述接種Ho8910細 胞的鼠飼養25-45天，至所述接種Ho8910細胞的鼠具備如下(1)和(2)性狀，得到人卵巢 癌裸鼠腹水瘤模型(1)[(接種Ho8910細胞的鼠腹圍-未接種Ho8910細胞的鼠腹圍)/未接種Ho8910 細胞的鼠腹圍]> 10% ； (2)接種Ho-8910細胞的鼠腹部觸及瘤體。上述方法中，所述飼養的條件為SPF級環境、溫度22°C、濕度55%和12小時晝/ 夜節律。 上述方法中，所述鼠為BALB/C裸鼠。本發明通過腹腔注射給裸鼠特定數量的卵巢癌細胞，構建了模型。實驗證明，裸 鼠接種后25-45天100%成瘤；腹部可觸摸到腫瘤結節，腹圍增加，腹水量為2-6ml，平均 為3. 5ml，涂片可見腫瘤細胞；接種后平均生存活時間為60. 4天。解剖成瘤鼠，腹腔可見實 體瘤組織，并有腫瘤組織附著于腸、肝、脾等器官；病理檢查見肝、脾等臟器存在腫瘤細胞浸 潤，腫瘤組織為人卵巢低分化漿性腺癌。本發明所構建的人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型具有成 瘤率高、成瘤潛伏期短、模型性狀顯著且穩定、平均生存時間較長特征。而且本發明小鼠模 型的發病情況極類似于人類的卵巢癌中晚期癥狀，說明本發明模型成功的模擬了于人類卵 巢癌的中晚期發展過程。該模型的建立為系統性研究卵巢癌生物學行為、進行細胞治療以 及篩選新藥及療效觀察等研究提供了強有力的工具。
圖1.成瘤后裸鼠圖片。圖2.腹水、成瘤鼠腹腔內腫瘤組織、肝、脾等病理學檢測結果(200X)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。人卵巢癌細胞(Ho8910細胞)購自中國科學院細胞庫，產品目錄號為TCHU24 ； 1640干粉培養基購自GIBCO公司；胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司；1 250胰 蛋白酶干粉購自Amresco公司；微量移液器購自法國Gilson公司，低速離心機購自Sigma 公司，50ml離心管購自Coring公司，78-1型磁力加熱攪拌器購自江蘇安普電子工程有限公 司，CO2培養箱購自ThermoForma公司。裸鼠(BALB/C背景，3_5周齡，雌性)購自南京大學 動物模式研究所(許可證號=SCXK (蘇)2005-0002)。實施例1、誘發劑的組成及制備一、組成每支誘發劑由Ho8910細胞和1640培養基組成；每支誘發劑的體積為0. 2ml，每支誘發劑中Ho8910細胞的數目為2X IO6個；每支誘發劑對應一只3_5周齡的受試小鼠，一次 注射完畢。二、制備(1)胎牛血清的滅活將無細菌、支原體及病毒污染的胎牛血清置于56°C恒溫水浴中30min，滅活補體，之后放于4°C冰箱保存，備用。(2) 1640完全培養基的配制取1640干粉培養基1袋(10. 4克)，加入到裝有950ml三蒸水的燒杯內，磁力攪拌器攪拌使其完全溶解，加入2. 0克NaHCO3,繼續攪拌至溶 解，用IM的HCl調節PH值7. 2，使用三蒸水定容至IOOOmL, 0. 22um無菌濾膜過濾除菌，4°C 保存。使用前加入10%體積的胎牛血清，即為1640完全培養基。即每一升1640培養基是按照如下方法配制的將10. 4克1640干粉培養基和2.0 克NaHCO3溶于水中，調節pH值為7. 2，用水定容至1升，得到1升1640培養基；向1640培養基中加入胎牛血清，使1640培養基與胎牛血清的體積比為9 1，則 得到1640完全培養基。(3)0. 25%胰酶配制取2. 5克的胰蛋白酶干粉溶于IOOOml的IX PBS溶液中，攪 拌使其完全溶解，0. 22um無菌濾膜過濾除菌，4°C保存，備用。(4)Ho8910細胞培養與制備將Ho8910細胞接種于1640完全培養基，37°C，5% CO2 培養，待細胞處于對數生長期時，使用0. 25%胰酶消化、收集細胞，使用1640培養基洗滌細 胞兩次(800rpm，10min，25°C )，臺盼藍染色法計算細胞活率，結果細胞活率彡90% ；(5)活細胞計數后，使用1640培養基重懸細胞，使細胞懸液中細胞濃度 為1.0X107cells/ml，每支誘發劑為0. 2ml此細胞懸液，每支誘發劑中細胞濃度為 1. OX 107cells/ml，每支誘發劑中細胞個數為2X IO6個，備用。實施例2、鼠卵巢癌腹水瘤模型的建立及評價本實施例中所用的鼠為裸鼠(BALB/C背景，3-5周齡，雌性，SPF級)，每只鼠的體 重為 14-18g。所有實驗均符合《中國科學技術大學實驗動物管理條例》。一、構建方法(一)接種取裸鼠(BALB/C背景)20只，3-5周齡，雌性，SPF級，飼養溫度22°C， 濕度55%，12小時晝/夜節律。按體重隨機分為2組，每組10只。實驗組腹腔注射一次上 述誘發劑，注射劑量為1支誘發劑/鼠(即200 μ 1細胞懸液/鼠)；對照組每只小鼠腹腔 注射一次相同劑量的1640培養基(即200ul 1640培養基/鼠)。( 二)接種后喂養實驗組和對照組接種后裸鼠均給予正常飲食，繼續在如下條件 下培養SPF級環境、飼養溫度22°C，濕度55%，12小時晝/夜節律。觀察小鼠精神狀態、活 動情況及存活情況，測量小鼠體重及腹圍變化，觸及小鼠腹腔內是否腫瘤結節，判斷小鼠是 否成瘤及成瘤時間。(三)判斷接種后鼠是否成瘤當接種后裸鼠出現腹圍增加明顯(大于10%)且 腹部觸及瘤體即判斷為成瘤，成瘤鼠還具有活動減少、消瘦癥狀。腹圍增加明顯的鑒定方法(接種后鼠腹圍_接種前鼠腹圍)/接種前鼠腹圍> 10%，即認為接種后鼠腹圍增加明顯；(四)成瘤后鼠的病理學檢測1、腹水的檢測方法取成瘤小鼠，摘眼球放血，之后斷髓處死，使用眼科剪刀打開 小鼠腹腔，使用無菌注射器吸取腹腔內液體，將液體轉移至無菌離心管中，準確量取其體 積，即為腹水量，將腹水3000rpm，IOmin離心，棄去上清，沉淀涂片后進行HE染色，檢測是否 存在腫瘤細胞。
2、盆腹腔臟器(肝臟)的檢測方法將上述小鼠的腹水吸掉之后，分離肝臟，肉眼 觀察，肝臟表面可見腫瘤結節，使用眼科剪取部分肝組織放于10%福爾馬林溶液中，進行病 理學檢測腫瘤細胞浸潤情況。
3、盆腹腔臟器(脾臟)的檢測方法將上述小鼠的腹水吸掉之后，分離脾臟，肉眼 觀察，脾臟表面可見腫瘤結節，使用眼科剪取部分脾臟組織放于10%福爾馬林溶液中，進行 病理學檢測腫瘤細胞浸潤情況。4、盆腹腔腫瘤結節的檢測方法上述解剖后的小鼠分離肝臟和脾臟后，肉眼觀察 腹腔，可見多個腫瘤種植灶，即腫瘤結節(癌組織)，取腫瘤結節放于10%福爾馬林溶液中， 進行病理學檢測是否為腫瘤細胞構成。二、結果1.成瘤時間實驗組，接種后25-45天，100%裸鼠成瘤。對照組均未成瘤。如圖1 所示，左圖為對照組小鼠腹腔情況，右圖為實驗組小鼠腹腔情況。2.生存時間裸鼠成瘤后25-40天100%死亡，接種后平均生存時間為60. 4天。 對照組小鼠均未出現死亡。3.生存質量實驗組接種后0-14天小鼠無明顯異常，25-45天內全部小鼠成瘤，表現為腹部膨隆，腹部 觸及瘤體。小鼠成瘤后7天，解剖小鼠，可見腹腔內存在腹水，腹水量為2_6ml，平均為3. 5ml, 腹水中可見腫瘤細胞(圖2腹水)；檢測盆腹腔臟器(肝臟)，表面可見腫瘤結節，病理檢測 結果如圖2肝臟所示，存在腫瘤細胞浸潤；檢測盆腹腔臟器(脾臟)，表面可見腫瘤結節，病 理檢測結果如圖2脾臟所示，脾臟內存在腫瘤細胞浸潤；腹腔中存在彌散性的腫瘤轉移灶， 病理切片顯示其內部為腫瘤聚集，如圖2癌組織所示。對照組接種后0-14天小鼠均正常，25-45天內也均正常，后續時間內均正常，無 成瘤者。選擇與實驗組相同的時期進行解剖及病理實驗。結果均未有腹水產生，肝臟、脾臟 中均未有腫瘤出現。上述標本經HE染色(蘇木精和伊紅染色)，結果顯示浸潤的腫瘤細胞為人低分化 漿液性卵巢腺癌細胞，與注射入小鼠體內的Ho8910細胞病理分型一致。上述病理檢測結果顯示，本發明小鼠模型的發病情況極類似于人類的卵巢癌中晚 期癥狀，說明本發明模型成功的模擬了于人類卵巢癌的中晚期發展過程，且性狀穩定。
權利要求
一種用于構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的誘發劑，由Ho8910細胞和1640培養基組成，每支誘發劑的體積為0.2ml，每支誘發劑中Ho8910細胞的數目為2×106個，每支誘發劑對應一只3-5周齡的鼠一次使用完畢。
2.根據權利要求1所述的誘發劑，其特征在于每1升所述1640培養基是按照如下方 法配制的將10. 4克1640干粉培養基和2. 0克NaHCO3溶于水中，調節pH值為7. 2，用水定 容至1升，得到1升1640培養基。
3.根據權利要求1或2所述的誘發劑，其特征在于所述鼠為BALB/C裸鼠。
4.一種構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的方法，包括如下步驟將權利要求1或2所述 誘發劑腹腔注射于3-5周齡的鼠，得到接種Ho8910細胞的鼠，將所述接種Ho8910細胞的鼠 飼養25-45天，至所述接種Ho8910細胞的鼠具備如下(1)和(2)性狀，得到人卵巢癌裸鼠 腹水瘤模型(1)[(接種Ho8910細胞的鼠腹圍-未接種Ho8910細胞的鼠腹圍)/未接種Ho8910細 胞的鼠腹圍]> 10% ； (2)接種Ho-8910細胞的鼠腹部觸及瘤體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述飼養的條件為SPF級環境、溫度 22°C、濕度55%和12小時晝/夜節律。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述鼠為BALB/C裸鼠。
全文摘要
本發明公開了一種構建人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的方法及其專用誘發劑。該用于構建鼠卵巢癌腹水瘤模型的誘發劑，由Ho8910細胞和1640培養基組成，每支誘發劑的體積為0.2ml，每支誘發劑中Ho8910細胞的數目為2×106個，每支誘發劑對3-5周齡的鼠一次使用完畢。本發明小鼠模型的發病情況極類似于人類的卵巢癌中晚期癥狀，說明本發明模型成功的模擬了于人類卵巢癌的中晚期發展過程。該模型的建立為系統性研究卵巢癌生物學行為、進行細胞治療以及篩選新藥及療效觀察等研究提供了強有力的工具。
文檔編號A01K67/02GK101810151SQ20101013497
公開日2010年8月25日 申請日期2010年3月26日 優先權日2010年3月26日
發明者凌斌, 田志剛, 程民, 趙衛東, 馬娟, 魏海明 申請人:中國科學技術大學