一株中華隱孔菌及其固體培養方法與應用的制作方法

專利名稱：：一株中華隱孔菌及其固體培養方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一株中華隱孔菌及其固體培養方法與應用。
背景技術：
：隱孔菌又名松橄欖、樹疙瘩、荷色菌、木魚菌、香木蘭、一口耳，屬于擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，隱孔菌屬，是木腐菌，生長在松樹或其他樹種樹干或樹枝的背陰面，或倒木的向地面，入藥部位為新鮮或干燥的子實體。分布于我國的河北、四川、云南、江蘇、江西、湖北、廣西、福建、海南、吉林等省及朝鮮、日本、歐洲、北美。在我國分布的隱孑L菌有兩個種，隱孑L菌Cryptoporusvolvatus(Peck)Schear、中華隱孑L菌CryptoporussinensisShengH.ffu&M.Zang。2000年，吳聲華和臧穆的研究表明我國分布的隱孔菌主要為中華隱孔菌。隱孔菌子實體生態環境嚴格、子實體采收困難、野外蘊藏量少，且子實體的人工培養難度很大，所以隱孔菌子實體資源緊缺。
發明內容本發明的一個目的是提供一株中華隱孔菌。本發明所提供的中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523，其保藏編號為CGMCCNo.3575。該菌株Liuzh2009-7523已于2010年01月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.3575，分類命名為Cryptoporussinensis。本發明的另一個目的是提供一種培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的方法。本發明所提供的培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的方法，包括如下步驟用下述任一所述培養基培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575。上述培養過程中，所述培養的條件為溫度為25°C-30°C且避光。本發明的另一個目的是提供一種中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物。本發明所提供的中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物，是按照包括如下步驟的方法制備得到的按照上述任一所述方法培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575，培養30天，收集培養容器內的所有物質，將培養容器內的所有物質記作發酵物。本發明的另一個目的是提供一種中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物。本發明所提供的中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物，是按照包括如下步驟的方法制備得到的1)按照上述任一所述方法培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575，培養30天，收集培養容器內的所有物質，將培養容器內的所有物質記作發酵物；2)將步驟1)中發酵物與95%(體積百分含量)乙醇水溶液混合，100°C回流提取，取有機相，即為中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物；每次回流提取的時間為1小時；所述步驟1)中發酵物與所述95%(體積百分含量)乙醇水溶液的配比為(900-1000)g:5升。中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575和/在制備如下產品中的應用也屬于本發明的保護范圍1)具有抗組胺釋放功能的產品；2)具有預防和/或治療變態反應性疾病功能的產品；3)具有鎮痛功能的產品；4)具有抑制腫瘤細胞生長功能的產品；或5)具有預防和/或治療腫瘤功能的產品。上述任一所述中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物在制備如下產品中的應用也屬于本發明的保護范圍1)具有抗組胺釋放功能的產品；2)具有預防和/或治療變態反應性疾病功能的產品；3)具有鎮痛功能的產品；4)具有抑制腫瘤細胞生長功能的產品；或5)具有預防和/或治療腫瘤功能的產品。上述任一所述中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物在制備如下產品中的應用也屬于本發明的保護范圍1)具有抗組胺釋放功能的產品；2)具有預防和/或治療變態反應性疾病功能的產品；3)具有鎮痛功能的產品；4)具有抑制腫瘤細胞生長功能的產品；或5)具有預防和/或治療腫瘤功能的產品本發明的另一個目的是提供一種具有如下功能的產品抗組胺釋放功能、具有預防和/或治療變態反應性疾病功能、鎮痛功能、抑制腫瘤細胞生長功能、或預防和/或治療腫瘤功能，其活性成分為中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575、和/或上述任一所述中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575的發酵物、和/或上述任一所述中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物。上述應用或上述產品中，所述鎮痛中的痛為神經性疼痛、外傷性疼痛或腫瘤引起的疼痛，具體是0.6%(體積百分含量)冰醋酸的水溶液對鼠引起的痛；所述腫瘤細胞為人肝癌細胞H印G2、人前列腺癌細胞PC3、人肺癌細胞A549、人直腸癌細胞HCT-15、人宮頸癌細胞Hela、人胃癌細胞SGC7901、小鼠乳腺癌細胞EMT6或小鼠前列腺癌RM-1細胞；所述腫瘤為肝癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌、胃癌或乳腺癌；所述變態反應性疾病為支氣管哮喘、過敏性鼻炎或過敏性皮炎。本發明的最后一個目的是提供一種用于培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的培養基。本發明用于培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的培養基，包括米、無機鹽和水；所述米為秈米、粳米和/或糯米；所述無機鹽為磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂和氯化鉀中的至少一種；所述磷酸鹽為K2HP04、K3P04、KH2P04、NaH2P04和Na2HPO4中的至少一種。本發明的用于培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的培養基中還可包括碳源和氮源；所述碳源為葡萄糖、果糖、半乳糖、淀粉、纖維素和蔗糖中的至少一種；所述氮源為蛋白胨、麥芽提取物和酵母提取物中的至少一種；所述米、碳源、氮源、無機鹽和水的配比為米(80-100)g碳源(0-12)g氮源(0_6)g:無機鹽(0.01_2)g:水(100-150)ml。本發明的用于培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的培養基具體如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述培養基由米、無機鹽和水組成；所述秈米、無機鹽和水的配比為IOOg秈米0.35g無機鹽130毫升水；2)所述培養基由秈米、硫酸鎂、K2HPO4和水組成；所述秈米、硫酸鎂、K2HPO4和水的配比為IOOg秈米0.15g硫酸鎂0.2gK2HPO4130毫升水；3)所述培養基由秈米、碳源、氮源、無機鹽和水組成；所述秈米、碳源、氮源、無機鹽和水的配比為(90-95)g秈米(4-6)g碳源(0.9-3.9)g氮源0.Ig無機鹽(130-150)毫升水；4)所述培養基由秈米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水組成；所述秈米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水的配比為90g秈米6g葡萄糖3.9g酵母提取物0.IgNaCl150毫升水；5)所述培養基由秈米、纖維素、麥芽提取物、硫酸鎂和水組成；所述秈米、纖維素、麥芽提取物、硫酸鎂和水的配比為95g秈米4g纖維素0.9g麥芽提取物0.Ig硫酸鎂130毫升水。上述培養基中，蛋白胨、麥芽提取物和酵母提取物可從商業途徑得到。蛋白胨購自OxoidLtd.，批號為806586；麥芽提取物購自OxoidLtd.，批號為1069878；酵母提取物購自OxoidLtd.，批號為1074139。上述產品具體可為藥物；所述藥物可為片劑、膠囊、口服液、乳劑、注射劑、混懸劑、酊劑、顆粒劑或氣霧劑。上述產品還可為保健品；所述保健品可為片劑、膠囊、口服液或顆粒劑。本發明所提供的新菌株具有多種功能，如抗組胺釋放、抑制多種腫瘤細胞生長、抑制各種過敏反應、治療疼痛和治療炎癥；本發明的培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)CGMCCNo.3575的方法，操作簡單、成本低廉、產量高，活性提取物收率可達1.5%(按照固體培養基干重量計算)。因此，本發明菌株發酵物及其發酵物的提取物具有廣闊的應用前旦ο圖1為實施例2中華隱孔菌固體培養菌發酵物高效液相圖譜。圖2為實施例3中華隱孔菌固體培養菌發酵物高效液相圖譜。圖3為實施例4中華隱孔菌固體培養菌發酵物高效液相圖譜。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、菌的分離和鑒定一、菌的分離中華隱孔菌菌種從采自福建省武夷山的隱孔菌新鮮子實體分離得到；將中華隱孔菌新鮮子實體和基物帶回實驗室，在無菌間內用無菌操作法，分別切取子實體菌肉部分和基物的木質部部分，置土豆葡萄糖瓊脂培養基的斜面上，2528攝氏度培養，獲得菌株的純培養物。將其中的一株菌命名為Liuzh2009-7523。二、菌的鑒定1子實體的鑒定培養菌株Liuzh2009_7523，至獲得子實體，觀察菌體及子實體的形態。原始子實體的菌蓋有菌幕，子實體層被包裹在菌幕內。該特征在多孔菌科中是獨一無二的。微觀檢測中擔孢子的大小710X45μπι，該特征符合中華隱孔菌的范圍。鑒定依據是1998年出版的《中國真菌志第三卷多孔菌科》和Mycotaxon2000年LXXIV卷415-422頁Cryptoprussinensissp.nov.,AnewpolyporuefoundinChina。2菌株鑒定菌絲白色，絨毛狀，菌絲經棉藍染色在高倍顯微鏡下可見多個鎖狀聯合，鎖狀聯合是擔子菌的獨有結構。綜合上述鑒定結果，表明該菌株Liuzh2009-7523屬于中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)，該菌株已于2010年01月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia北京市朝陽北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.3575。實施例2、菌的培養、提取物的制備及應用一、菌株活化將菌種接種到土豆葡萄糖瓊脂的斜面上，進行預培養；預培養的條件為25攝氏度，避光，培養7天。PDA培養基組成土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉16g，純凈水定容至lL(pH自然)。二、種子培養預培養中，待菌絲長滿整個斜面后，在無菌條件下將菌絲體轉接到液體培養基中進行培養，得到種子培養液。培養的條件為25攝氏度，避光，培養7天。液體培養基葡萄糖4.Og/L,MaltExtract(麥芽提取物)10.0g/L,YeastExtract(酵母)4.0g/L,水定容至1L。三、發酵培養取10毫升步驟二得到的種子培養液分別接種到經過滅菌的裝有如下固體培養基的500毫升三角瓶中，接種10瓶，25°C，避光，培養30天，將三角瓶內所有的物質記作發酵物，發酵物由菌體、菌的代謝物、培養基及培養基被菌利用后產生的物質組成。固體培養基由90g秈米、6g葡萄糖、3.9gYeastExtract(酵母提取物)、0.IgNaCl和150毫升水組成。YeastExtract(酵母提取物)購自OxoidLtd.，批號為1074139。四、提取物的制備1、實驗組發酵物的提取物的制備將實驗三中培養得到的發酵物冷凍干燥，稱重，重量為900克。用5升95%(體積百分含量)乙醇水溶液回流提取3次，每次1小時，合并乙醇提取液，減壓濃縮干燥得到60克提取物，提取物記作CS-El。回流提取步驟如下將實驗三中培養得到的發酵物與5升95%(體積百分含量)乙醇水溶液混合，100°C回流提取1小時，取有機相和殘渣，將有機相記作乙醇提取液I，將殘渣記作殘渣I；將殘渣I與5升95%(體積百分含量)乙醇水溶液混合，IOO0C回流提取1小時，取有機相和殘渣，將有機相記作乙醇提取液II，將殘渣記作殘渣II；將殘渣II與5升95%(體積百分含量)乙醇水溶液混合，100°C回流提取1小時，取有機相和殘渣，將有機相記作乙醇提取液III，將殘渣記作殘渣III；合并乙醇提取液I、乙醇提取液II和乙醇提取液III，記作乙醇提取液。2、高效液相色譜檢測將提取物CS-El高效液相色譜檢測。高校液相化學指紋圖譜分析條件如下使用安杰倫Agilent1200高效液相色譜儀，四元梯度泵，DAD檢測器，Agilent色譜工作站。色譜柱YMCC8分析柱(4.6mmX150mm，5μm)，流動相為甲醇-0.04%(體積百分比)三氟乙酸水溶液進行梯度洗脫(洗脫程序如下)，流速l.OOmL/min。樣品用甲醇溶解，配成lOmg/mL的溶液。進樣量10μL，紫外檢測波長210nm。線性梯度洗脫步驟如下時間(min)甲醇O.04%(體積百分比)三氟乙酸水溶液O50%50%40100%0%60100%0%在如上色譜條件下，提取物CS-El的主要代謝產物色譜峰出現在保留時間25-40分鐘范圍內(圖1)。五、提取物的功能以下實驗所用動物均購自廣東省醫學實驗動物中心(許可證號SCXK(粵)2003-0002)(一)提取物CS-El的抗組胺釋放作用PCA(高氯酸，北京市興津化工廠，070523)，Compound48/80購自Alexis，產品目錄號為LSALX-420-008-M100。將8周齡SD大鼠斷頭放血處死后，將MCM(+)基質液(50ml100ml)注射入大鼠腹腔，按摩腹部120s左右，吸出全部腹腔液，4°C680rpm離心7min。棄上清液，用35mlMCM(+)基質液洗沉淀，4°C680rpm離心7min。再棄去上清液，同樣35mlMCM(+)基質液洗沉淀，4°C680rpm離心7min，收集沉淀。所得沉淀即肥大細胞。再加入MCM(-)基質液5ml，臺盼藍染色。染色液為MCM液和4%臺盼藍液的混合溶液，MCM液4%臺盼藍液=0.250.75(體積比)，使用前37°C恒溫振蕩3min。顯微鏡下細胞計數，調整肥大細胞懸液中細胞濃度為lX105Cell/mL。將細胞分為自然釋放組胺組，Compound48/80刺激釋放組胺組和樣品組三部分。自然釋放組胺組設三個平行管，每管加入肥大細胞懸液500μL；加入20μL60%PCA，室溫放置20min，_4°C保存；刺激釋放組胺組設三個平行管，每管加入肥大細胞懸液500μL，37°C振蕩孵育5min后加入4μL250mMCaCl25min,加入生理鹽水5μLlOmin,再加入5μL0.05mg/mLCompound48/8010min后冰浴冷卻，4°C6000rpm離心2.5min后取上清液400μL加入20μL60%PCA,室溫放置20min。樣品組設提取物CS-El高(1000μg/mL)、低(500μg/mL)兩個劑量，每個劑量各設三個平行管。每管加入肥大細胞懸液500μL，37°C振蕩孵育5min后加入4μL250mMCaCl25min，加入提取物CS-E15yLIOmin后再加入0.05mg/mLCompound48/8010min后冰浴冷卻，4°C6000rpm離心2.5min,然后取上清液400μL加入20μL60%PCA,室溫放置20mino上述三組在室溫放置20min后，均加入400yL生理鹽水，4°C13000rpm離心2.5min。上清液用0.2μm微孔濾膜過濾，儲存在_20°C，用于HPLC分析，檢測各組釋放的組胺的量，按下式計算樣品組胺釋放抑制率(％)。樣品組胺釋放抑制率=(1-樣品組胺釋放率)X100%。樣品組一自然釋放組胺組樣品組胺釋放率％二-χηηο/刺激釋放組胺組一自然釋放組胺組χ100%實驗結果見表1，隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在試驗劑量下顯示了很好的抗組胺釋放的作用。表1隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)抗組胺釋放作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Compound48/805.16±0.84-CS-El(50(^g/mL)2.36±0.1856.1CS-El(lOOOpg/mL)1.41±0.1475.1MCM(-)基質液配制精密稱取NaCl8.766g，KCl0.2758g，Na2HPO4L07g，KH2PO4O.48g,D-Glucoselg,BSAlg,明膠(Gelatin)lg，加水定容至1000ml，搖勻，以NaOH水溶液調PH至6.8，即得MCM(-)溶液，_4°C保存，備用。MCM(+)基質液配制向MCM(_)基質液添加肝素，肝素在MCM(-)溶液中的濃度為10U/mL。MCM基質液配制MCM(_)溶液與MCM(+)溶液的混合溶液，MCM(-)溶液MCM(+)溶液=291(VV)。(二)抗二硝基氟苯(DNFB)誘發的變應性接觸性皮炎地塞米松(DEX)購自天津藥業集團新鄭股份有限公司。二硝基氟苯(CAS編號70-34-8)購自上海如吉生物科技發展有限公司。實驗動物KM雄性小鼠，隨機分為模型對照組(給等量的蒸餾水)、中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)500mg/kg、中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)1000mg/kg及地塞米松lmg/kg組，共4組，每組10只。受試動物于致敏前1天到DNFB攻擊當天連續7天灌胃給藥。實驗第一天用15mg/mL的DNFB乙醇溶液(即DNFB與乙醇的混合溶液，DNFB15mg,乙醇ImL)50μL作為抗原在小鼠背部皮下注射致敏。5d后致敏成立，第6d在小鼠右耳上涂lOmg/mLDNFB(丙酮橄欖油41)溶液(即DNFB、丙酮和橄欖油的混合物，混合物中DNFB為10mg，丙酮0.8mL和橄欖油0.2mL)25μL作為抗原攻擊，致炎24h，使小鼠產生耳接觸性皮炎。用8mm直徑打孔器分別在左右兩耳相同部位打下圓耳片，測定左右耳組織塊重量差，計算給藥組耳腫脹抑制率(％)，結果如表2所示。隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在試驗劑量下顯示了很好的抗DNFB誘發變應性皮炎的作用。表2中，耳片重量差為右耳耳片重量與左耳耳片重量的差；耳腫脹抑制率=[1-(給藥組重量差/模型組重量差)]X100%。表2中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)抗DNFB誘發變應性皮炎作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(三)抗異種被動皮膚過敏反應百白破疫苗成都生物制品研究所提供，批號20020403。卵白蛋白中國醫藥集團上海化學試劑公司生產，批號F20010702。將7周齡1822g雄性清潔級昆明種小鼠隨機分成5組，每組10只；7周齡180220g雄性SD大鼠隨機分成5組，每組10只；分別設空白對照組、陽性對照組(酮替芬5mg/kg,sigmachemicalCo.)及中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-E1)500、1000mg/kg劑量組，連續7天小鼠口服給藥。參照Tada等人方法利用卵白蛋白及百白破疫苗制備大鼠抗卵白蛋白血清(anti-OVA)(具體方法為健康大鼠，體重100_200g，用卵白蛋白生理鹽水溶液(Ig卵白蛋白加入到100ml生理鹽水中)按照10mg/kg肌肉注射于后腿兩側，同時腹腔注射百白破疫苗2XIOltlU/只。12-14天后(IgE高峰時間)，處死動物采血，血液低速離心，分離血清，置于冰箱中保存。)。異種被動皮膚過敏反應是將10μ1大鼠抗卵白蛋白血清注射到小鼠右耳皮內，左耳皮內注射等量生理鹽水。致敏48h后按0.lml/10g體重劑量向小鼠尾靜脈內注射卵白蛋白伊文斯蘭生理鹽水溶液進行攻擊。30min后脫頸處死，用8mm直徑打孔器分別在左右兩耳同一部位打下圓耳片，測定左右耳組織塊重量差，計算給藥組耳腫脹抑制率(％)，結果如表3所示。隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在試驗劑量下顯示了很好的抗異種被動皮膚過敏反應的作用。卵白蛋白伊文斯蘭生理鹽水溶液組成lg伊文思藍，生理鹽水100ml，內含卵白蛋白Igo表3中，耳片重量差為右耳耳片重量與左耳耳片重量的差；抑制率=[1-(給藥組重量差/模型組重量差)]X100%。表3隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)抗異種被動皮膚過敏反應的作用|0115]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(四)抗SRBC誘發遲發型過敏反應SRBC(綿羊紅細胞)的制備采健康綿羊的頸靜脈血，立即注入無菌有玻璃珠的三角瓶內，經充分搖動1520min，以去除纖維蛋白，獲得抗凝綿羊全血。將全血和Alsever液(北京東勝創新生物科技有限公司，02-045-1B)以12混合。全血與Alsever液充分混合后，置4°C保存可使用3周左右。使用前取適量抗凝血于離心管中，用無菌生理鹽水洗細胞23次(每次2000rpm，IOmin)。最后，用無菌生理鹽水稀釋后使用。將7周齡1822g雄性清潔級昆明種小鼠(廣東省醫學實驗動物中心(許可證號SCXK(粵)2003-0002))隨機分成4組，每組10只，分別設空白對照組、中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)500、1000mg/kg劑量組，陽性藥酮替芬5mg/kg。實驗第Id在小鼠背部皮下注射IXIO8個SRBC作為抗原致敏。5d后將小鼠左側下肢拉直，自足跖皮內中下部向上注入等量SRBC進行攻擊，右足跖皮內中下部向上注射等量生理鹽水。酮替芬和隱孔菌菌絲體提取物于致敏前Id開始到足跖皮SRBC攻擊當天連續6d給藥。致敏24h后，用Digimatic卡尺(分辨率為0.01mm)測量左右足跖厚度，計算浮腫抑制率(％)，結果如表4所示。表4中，足跖腫脹差為左側足跖厚度與右側足跖厚度的差。隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在試驗劑量下顯示了很好的抗SRBC誘發遲發型過敏反應的作用。浮腫抑制率(％)計算公式如下浮腫抑制率=[1_(給藥組腫脹差/模型組腫脹差)]X100%。表4隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)抗SRBC誘發遲發型過敏反應的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(五)對變應性鼻炎的治療作用將50只7周齡1822g雄性清潔級昆明種小鼠，隨機分為5組(1)空白對照組(A組)；(2)模型對照組(B組)；(3)實驗藥物小劑量組(C組)；(4)實驗藥物大劑量組(D組)；(5)陽性對照組(鼻炎康組E組)，每組10只。將實驗動物A組予生理鹽水注射，B、C、D、E組均以卵白蛋白0.3mg(sigmachemicalCo.,gradeV)輔以氫氧化鋁30mg作佐劑、加生理鹽水Iml形成混懸液，行腹腔注射，隔日1次，共7次，為基礎致敏。再用0.5%卵白蛋白的生理鹽水攻擊雙鼻腔，每側0.05ml，每日1次，共7次。每次攻擊后均觀察30min，內容包括噴嚏、搔抓，構建大鼠變應性鼻炎模型。A、B組灌生理鹽水，C、D、E組分別按體重灌治療藥物中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)O.5克/公斤，1.0克/公斤及陽性對照藥物鼻炎康1.8g/kg。動物服藥7d，灌藥4h后，用0.Iml/只卵白蛋白生理鹽水攻擊雙鼻腔，每側0.05ml,0.5h后觀察鼻部癥狀。20-30min后測量皮丘直徑均超過1cm，并剪下鼻粘膜組織浸泡于4%甲醛溶液中備用，任選10個高倍視野，觀察鼻粘膜組織中的嗜酸性細胞、嗜中性細胞和淋巴漿細胞的數目，結果如表6所示。中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在試驗劑量下顯示了很好對變應性鼻炎的治療作用，與陽性藥物相當。表6鼻粘膜組織細胞觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>呷<0.01.“_”未見所要觀察的細胞；”+”少數散落的細胞；“++”可見較多的細胞；“+++”占全部上皮的2/3以上(六)致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞的變化卵白蛋白由中國醫藥集團上海化學試劑公司生產，批號F20010702。7周齡1822g雄性清潔級昆明種小鼠50只，隨機分為5組(1)空白對照組(生理鹽水0.5ml/kg)；(2)模型對照組(B組)；(3)實驗藥物小劑量組(中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)O.5g/kg)；(4)實驗藥物大劑量組(中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)1.Og/kg)；(5)陽性對照組(DEXlmg/kg)。小鼠乙醚麻醉，0.卵白蛋白氫氧化鋁凝膠(0.卵白蛋白氫氧化鋁凝膠0.Ig卵白蛋白加入到含有IOg氫氧化鋁的IOOmL生理鹽水中)于兩后足掌、兩腹股溝、兩腋下、頸部以及背部共八點皮下注射0.4mL，致敏第10天腹腔注射0.卵白蛋白氫氧化鋁凝膠(0.卵白蛋白氫氧化鋁凝膠0.Ig卵白蛋白加入到含有IOg氫氧化鋁的IOOmL生理鹽水中)0.2mL再次致敏1次，第2次致敏11天后，用1%的卵白蛋白(Ig卵白蛋白加入到IOOmL生理鹽水)霧化吸入進行攻擊，每次30分鐘，連續攻擊6天。每次攻擊前1小時根據分組給藥，末次攻擊后24小時后取出小鼠支氣管進行肺泡灌洗。脫白處死小鼠，縱行剪開頸部皮膚，分離暴露氣管，行氣管插管，用灌洗液(Thornwell-Mcdowell溶液=NaCl6.6g,KCl0.46g,CaCl2O.05g,NaHC032.52g,MgCl2O.09g,Na2HP040.lg,加水至IOOOmL)灌洗，每次0.5mL，共3次，收集支氣管肺泡灌洗液，搖勻后取出50微升，用白細胞稀釋液(恒大百盛生物北京科技發展有限公司)稀釋4倍，取少量滴于細胞計數板上，在顯微鏡下計數白細胞總數。將支氣管肺泡灌洗液低溫IOOOrpm離心IOmin后，棄去上清液，用移液器打勻后涂片。涂片室溫干燥，染色6-8min，復染1分鐘。用自來水將染料沖洗干凈，在光學顯微鏡40倍鏡下進行白細胞分類計數。計數200個細胞，計算淋巴單核細胞以及嗜酸性粒細胞的百分比。結果如表7，表明隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)對小鼠哮喘模型支氣管肺泡的炎癥細胞聚集有明顯的抑制作用。表7中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)鼠哮喘模型支氣管肺泡炎癥細胞的作陽<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(七)隱孔菌固體培養菌絲體提取物鎮痛作用將7周齡1822g雄性清潔級昆明種小鼠，隨機分為模型對照組、中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)500，1000mg/kg及阿司匹林200mg/kg組，共4組，每組10只。灌胃給藥1小時后，每只小鼠腹腔注射0.6%(體積百分含量)冰醋酸的水溶液0.2ml致痛。記錄注射致痛后30min內各小鼠扭體的次數，結果如表8所示。隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在試驗劑量下顯示了很好的鎮痛作用。鎮痛率％的計算公式=(1-給藥組扭體次數/模型組扭體次數)*100%表8中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)鎮痛作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(八)抑制腫瘤細胞生長作用人肝癌細胞H印G2(ATCCHB-8065)、人前列腺癌細胞PC3(ATCCCRL-1435)、人肺癌細胞A549(ATCCCCL-185)、人結直腸癌細胞HCT-15(ATCCCCL-225)、人宮頸癌細胞Hela(ATCCCCL-2)、人胃癌細胞SGC-7901(ATCCSGC-7901)、小鼠乳腺癌細胞EMT6(ATCCCRL-2755)、小鼠前列腺癌RM-I細胞(ATCCRM-1)均購自中山醫科大學動物實驗室。人肝癌!fepG2細胞，人前列腺癌PC3細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，人肺癌A549細胞、人直腸癌細胞HCT-15、人宮頸癌Hela細胞、人胃癌SGC-7901細胞、小鼠乳腺癌EMT6細胞、小鼠前列腺癌RM-I細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37°C、5%CO2培養箱中常規培養，隔天傳代。用MTT方法，取對數生長期的各種腫瘤細胞，用胰酶消化，制成每毫升含ιχIO5個細胞的單細胞懸液，接種于96孔板內(每孔200μL)，每組設3個平行孔。24小時后加入不同濃度的中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)培養48小時，同時設空白對照組和陽性對照組(順鉬)，進行MTT測定腫瘤細胞數目，計算抑制率(％)。結果表明中華隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)在12.5-100微克/毫升范圍內具有很好的抑制腫瘤細胞生長的活性。抑制率(％)的計算公式(1-給藥組OD值/空白對照組OD值)X100%。表9隱孔菌固體培養發酵物(CS-El)對腫瘤細胞生長的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例3、菌的培養、提取物的分析一、菌株活化和種子培養同實施例2。二、發酵培養液體培養基培養10天后，取10毫升步驟一得到的種子培養液分別接種到經過滅菌的裝有如下固體培養基的500毫升三角瓶中，接種10瓶，30°C，避光，培養30天，得到發酵物。固體培養基由95g秈米、4g纖維素、0.9g麥芽提取物、0.Ig硫酸鎂和130毫升水組成。麥芽提取物購自OxoidLtd.，批號為1069878。三、提取物的制備1、發酵物的提取物的制備將發酵物冷凍干燥，稱重，重量為950克。按照實施例2中所述方法進行回流提取，合并乙醇提取液，減壓濃縮干燥得到65克提取物，提取物記作CS-E2。2、高效液相色譜檢測將實施例3中制備得到的提取物CS-E2進行高效液相色譜檢測。分析條件同實施例2。結果如圖2所示，提取物CS-E2的主要代謝產物色譜峰出現在保留時間25-40分鐘范圍內，與CS-El相似。四、功能驗證將CS-E2進行實施例2實驗五中所述各項功能驗證，結果與CS-El無顯著差異。實施例4、菌的培養、提取物的制備一、菌株活化和種子培養同實施例2。二、發酵培養液體培養基培養10天后，取10毫升步驟一得到的種子培養液分別接種到經過滅菌的裝有如下固體培養基的500毫升三角瓶中，接種10瓶，28°C，避光，培養30天，得到發酵物。固體培養基由IOOg秈米、0.15g硫酸鎂、0.2gK2HPO4和130毫升水組成。蛋白胨購自OxoidLtd.，批號為806586。三、提取物的制備1、發酵物的提取物的制備將發酵物冷凍干燥，稱重，重量為1000克。用5升95%乙醇回流提取3次，每次1小時，合并乙醇提取液，減壓濃縮干燥得到63克提取物，提取物記作CS-E3。2、高效液相色譜檢測將實施例4中制備得到的提取物CS-E3進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例2。結果如圖3所示，提取物CS-E3的主要代謝產物色譜峰出現在保留時間25-40分鐘范圍內，與CS-El相似。四、功能驗證將CS-E3進行實施例2實驗五中所述各項功能驗證，結果與CS-El無顯著差異。權利要求中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523，其保藏編號為CGMCCNo.3575。2.培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的方法，包括如下步驟用權利要求8、9或10所述培養基培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述培養的條件為溫度為25°C-30°C且避光。4.中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物或中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物，為如下1)所示的發酵物和如下2)所示的提取物1)中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物是按照包括如下步驟的方法制備得到的按照權利要求2或3所述方法培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575，培養30天，收集培養容器內的所有物質，將培養容器內的所有物質記作發酵物；2)中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物是按照包括如下步驟的方法制備得到的a)、按照權利要求2或3所述方法培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575，培養30天，收集培養容器內的所有物質，將培養容器內的所有物質記作發酵物；b)用95%(體積百分含量)乙醇水溶液對步驟a)中發酵物進行回流提取，取有機相，即為中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的發酵物的提取物；每次回流提取的時間為1小時，溫度為100°C；；所述步驟a)中發酵物與所述95%(體積百分含量)乙醇水溶液的配比為(900-1000)g5升。5.中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575和/或權利要4所述發酵物和/或權利要4所述提取物在制備如下產品中的應用1)具有抗組胺釋放功能的產品，2)具有預防和/或治療變態反應性疾病功能的產品，3)具有鎮痛功能的產品，4)具有抑制腫瘤細胞生長功能的產品，或5)具有預防和/或治療腫瘤功能的產品。6.一種具有抗組胺釋放功能的產品、一種具有預防和/或治療變態反應性疾病功能的產品、一種具有鎮痛功能的產品、一種具有抑制腫瘤細胞生長功能的產品或一種具有預防和/或治療腫瘤功能的產品，其活性成分為中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575、和/或權利要求4中所述發酵物、和/或權利要求4中所述提取物。7.根據權利要求5所述應用或根據權利要求6所述產品，其特征在于所述鎮痛中的痛為神經性疼痛、外傷性疼痛或腫瘤引起的疼痛，具體是0.6%(體積百分含量)冰醋酸的水溶液對鼠引起的痛；所述腫瘤細胞為人肝癌細胞H印G2、人前列腺癌細胞PC3、人肺癌細胞A549、人直腸癌細胞HCT-15、人宮頸癌細胞Hela、人胃癌細胞SGC7901、小鼠乳腺癌細胞EMT6或小鼠前列腺癌RM-1細胞；所述腫瘤為肝癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌、胃癌或乳腺癌；所述變態反應性疾病為支氣管哮喘、過敏性鼻炎或過敏性皮炎；所述過敏性皮炎為二硝基氟苯對鼠誘發的變應性接觸性皮炎、大鼠抗卵白蛋白血清對小鼠誘發的異種被動皮膚過敏反應、或綿羊紅細胞對鼠誘發的遲發型過敏反應；所述二硝基氟苯對鼠誘發的變應性接觸性皮炎為二硝基氟苯對鼠誘發的耳腫脹，所述大鼠抗卵白蛋白血清對小鼠誘發的異種被動皮膚過敏反應為大鼠抗卵白蛋白血清對小鼠誘發的耳腫脹，所述綿羊紅細胞對鼠誘發的遲發型過敏反應為綿羊紅細胞對鼠誘發的足跖腫脹。8.一種用于培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009_7523CGMCCNo.3575的培養基，包括米、無機鹽和水；所述米為秈米、粳米和/或糯米；所述無機鹽為磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂和氯化鉀中的至少一種；所述磷酸鹽為K2HP04、K3P04、KH2P04、NaH2P04和Na2HP04中的至少一種。9.根據權利要求8述的培養基，其特征在于所述培養基包括碳源和氮源；所述碳源為葡萄糖、果糖、半乳糖、淀粉、纖維素和蔗糖中的至少一種；所述氮源為蛋白胨、麥芽提取物和酵母提取物中的至少一種；所述米、碳源、氮源、無機鹽和水的配比為米(80-100)g碳源(0-12)g氮源(0-6)g無機鹽(0.01-2)g水(100-150)ml。10.根據權利要求8或9所述的培養基，其特征在于所述培養基為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述培養基由秈米、無機鹽和水組成；所述秈米、無機鹽和水的配比為100g米0.35g無機鹽130毫升水；2)所述培養基由秈米、硫酸鎂、1(2朋04和水組成；所述秈米、硫酸鎂、K2HP04和水的配比為100g秈米0.15g硫酸鎂0.2gK2HP04130毫升水；3)所述培養基由秈米、碳源、氮源、無機鹽和水組成；所述秈米、碳源、氮源、無機鹽和水的配比為(90-95)g秈米(4-6)g碳源(0.9-3.9化氮源0.18無機鹽:(130-150)毫升水；4)所述培養基由秈米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水組成；所述秈米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水的配比為90g秈米6g葡萄糖3.9g酵母提取物0.lgNaCl150毫升水；5)所述培養基由秈米、纖維素、麥芽提取物、硫酸鎂和水組成；所述秈米、纖維素、麥芽提取物、硫酸鎂和水的配比為95g秈米4g纖維素0.9g麥芽提取物0.lg硫酸鎂130毫升水。全文摘要本發明公開了一株中華隱孔菌及其應用。該菌株為中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575。本發明所提供的新菌株具有多種功能，如抗組胺釋放、抑制多種腫瘤細胞生長、抑制各種過敏反應、治療疼痛和治療炎癥；在抗組胺釋放、抑制腫瘤生長方面，本發明菌株或其發酵物的提取物的效果要好于陽性對照組。另外，本發明的培養中華隱孔菌(Cryptoporussinensis)CGMCCNo.3575的方法，操作簡單、成本低廉、產量高，活性提取物收率可達1.5％(按照固體培養基干重量計算)。因此，本發明菌株、菌株發酵物及發酵物的提取物具有廣闊的應用前景。文檔編號A01G1/04GK101803531SQ201010135110公開日2010年8月18日申請日期2010年3月26日優先權日2010年3月26日發明者劉宏偉,寶麗,張小青申請人:中國科學院微生物研究所