專利名稱：建立可控突變率突變庫的方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及建立可控突變率突變庫的方法與應用。
背景技術：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)，也稱 δ -內毒素(delta-endotoxin) [Bravo. Α. , Gill S. S.，Soberon Μ. Bacillus thuringiensis Mechanisms and Use. Comprehensive Molecular Insect Science Elsevier, 2005,175 206.]，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關系[Schn印f. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775_806.]。從 1981 年，Schn印f 和 Whiteley 克隆了第一個編碼 S -內毒素的crylAal基因，截止2008年6月已發現和克隆了 412種ICPs基因。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、對人畜無害[DeMaagd R. A. ,Bravo A. ,Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world. Trends Genet, 2001,17 :193 199.]，不污染環境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應用。但隨著Bt制劑的大量使用及轉基因作物的大面積種植，靶標昆蟲逐漸產生抗性， 繼續從自然界中分離具有高毒力的新型Bt cry基因難度不斷增加，通過分子設計、蛋白質工程等新的技術對現有的Cry毒素進行改造成為了研究熱點。但目前尚沒有一個技術可以實現Cry蛋白的定向進化。定點突變和結構域互換，需要在已知殺蟲晶體蛋白蛋白結構與功能的關系的前提下進行設計；通過隨機突變和基因重組建立突變庫，突變率和重組率難于控制，導致突變體少，無有益突變，或者突變庫龐大，無法進行生物活性測定。因此，建立一個突變率可控的cry蛋白定向進化技術對于獲得高毒力的cry基因具有重要意義。2000年，本實驗室的宋福平等人從Bt菌株Bt c007中克隆了一種新類型的cryll 基因。crylle基因(專利號CN1401772)該基因編碼分子量為81kD的蛋白質，由719個氨基酸組成(Song et al.，2003)。作為國內發現的第一個Bt模式cry基因，crylle對玉米螟、小菜蛾等鱗翅目害蟲活性較高，與目前全球廣泛商業化應用的CrylA等蛋白無交互抗性，現在正在用于國內轉基因抗蟲玉米的研制，具有良好的應用前景。但CrylIe蛋白的毒力與實際應用仍有一定差距。因此，通過分子設計的方法提高CrylIe對鱗翅目害蟲活性具有重要的理論和實踐意義。
發明內容
針對上述領域中的不足，依據Taq DNA聚合酶在合成堿基時的固有誤差和突變特性，建立一種突變率可控的隨機突變文庫的方法。通過對蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白CrylIe的定向進化進行的研究，得到活性顯著提高的突變株，并且占整個突變體庫的 13. 16%。針對高毒力突變株突變位點人工合成的突變體，殺蟲活性是來突變CrylIe的 1000 倍。建立可控突變率突變庫的方法，步驟如下A、確定突變條件(1)確定替換率將起始模板進行梯度稀釋，實時熒光定量PCR擴增，最低濃度的指數擴增最大循環數下可以得到最多的突變體；挑取最低濃度下的若干克隆測序，得到每個克隆平均突變堿基數，按式(I)計算替換率，替換率=每個克隆平均突變堿基數/(突變目的片段堿基數X最大循環數)；(I)(2)確定預替換堿基數目所需的指數擴增循環數Cl、C2、C3......，按式(II)計
算循環數=預期替換堿基數目/(突變目的片段堿基數X替換率)(II)其中Cl、C2、C3分別代表預替換堿基數目為1、2、3時所需指數擴增循環數，(3)確定所需起始模板量實時熒光定量PCR擴增處于指數擴增的最大循環數與
步驟⑵中確定的循環數C1、C2、C3......相比較，最接近的該PCR擴增所用模板量確定為
所需起始模板量T1、T2、T3......其中Tl、Τ2、Τ3分別代表預替換堿基數目為1、2、3時PCT擴增所需起始模板量，B、可控突變率突變庫的建立按照確定的循環數Cl、C2、C3......和對應確定
的起始模板量Tl、Τ2、Τ3......，將起始模板PCR擴增得到可控突變率突變庫Li、L2、
L3......，所述L1、L2、L3分別代表平均替換堿基數為1、2、3的突變庫。所述起始模板為含有編碼CrylIe蛋白的核苷酸片段的載體。所述起始模板為含有編碼CrylIe蛋白的核苷酸片段的質粒。所述質粒為pAclIe，由pUC19克隆載體，crylAc啟動子，crylle基因全長組成。所述預期替換堿基數目為1、2、3，可控突變率突變庫為L1、L2、L3。上述方法得到的可控突變率突變庫Li、L2、L3.......上述突變庫中的突變體，所述突變體的核苷酸序列為SEQ ID N01，其氨基酸序列為 SEQ ID N012 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN02，多1；氨基酸t序列為 SEQ ID N013 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN03，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N014 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN04，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N015 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN05，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N016 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN06，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N017 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN07，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N018 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN08，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N019 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN09，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N020 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN010,其氨基—f 序列為 SEQ ID N021
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDNOl 1，其氨基—f 序列為 SEQ ID N022。 一個人工突變體，其氨基酸序列為將上述任一兩個以上突變體中的氨基酸的替換位疊加后得到。所述人工突變體的其氨基酸序列為SEQ ID N024 ；其核苷酸序列為SEQ ID N023, 或者其氨基酸序列為SEQ ID N026，核苷酸序列為SEQ ID N025 ；其氨基酸序列為SEQ ID N028，核苷酸序列為SEQ ID N027。上述突變體在殺害鞘翅目害蟲中的應用。本發明依據Taq DNA聚合酶在合成堿基時的固有誤差和突變特性，針對預期替換不同堿基數目，建立了一種突變率可控的突變文庫。采用本發明方法建立的文庫Li、L2、 L3……是按堿基突變數目的不同來區分的，因此可以根據客戶的需求來定制不同堿基突變數目的文庫，使突變文庫的適應性和目的性增強。根據文獻報道，對于Cry蛋白，獲得活性提高的突變體，關鍵點在于如何選擇合適的突變頻率，一般有益突變的頻率很低，絕大多數突變是有害的。突變頻率過高，會導致無義突變；突變頻率偏低，則野生型將占據突變群體的優勢，很難篩選到理想的突變體。根據本發明建立可控突變文庫的方法，計劃建立3個低的、不同堿基替換率的隨機突變庫，分別是文庫I含1個堿基的替換；文庫II含2個堿基的替換；文庫III含3個堿基的替換；隨機挑選100個單克隆測序，總計得到，文庫I中的平均突變堿基為0. 86個，文庫II中的平均突變堿基個數為2. 1個，文庫III中平均突變堿基個數為2. 79個，3個文庫中平均突變堿基個數符合預期設計，表明本發明建立可控突變率突變文庫的方法是可行的。本發明的實施例中雖然采用的是CrylIe蛋白來說明本發明建立突變文庫的方法，但從上面敘述的原理來看，它采用的是Taq DNA聚合酶在合成堿基時的固有誤差和突變特性來實現的，因此對于其它核苷酸片段來說，同樣是可以適用的。本發明的實施例得到的突變文庫中，活性顯著提高的突變株(其核苷酸序列如 SEQ ID而1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)，高毒力突變株占整個突變庫的11.96%，其中文庫 III高毒力突變株的比例達到13. 16%，表明該隨機突變文庫的方法篩選到活力顯著提高的突變株的幾率很高；針對高毒力突變株突變位點人工合成的突變體(其核苷酸序列如 SEQ ID N023)，殺蟲活性是未突變CrylIe蛋白的1000倍。
圖1實時熒光定量PCR擴增/循環2隨機突變文庫建立流程3文庫I、II、III中的平均突變率圖4突變文庫蛋白表達分析其中1.未突變的CrylIe ；2. pUC19載體；B. BSA ；3-7為突變文庫中的單克隆蛋白圖5合成序列蛋白表達分析B. BSA ；1. pUC19 載體；2. MSll 蛋白；3. M157&667 蛋白；4. M157&311 蛋白
具體實施例方式1確定突變條件1. 1突變率的測定取1 μ 1質粒pAclIe (pUC19克隆載體，cry IAc啟動子，cry lie基因)經微量分光光度計NaroDrop定量，濃度為290ng/μ 1。進行梯度稀釋，分別取1 μ 1，進行熒光定量PCR，反應體系2 X Taq DNA polymerase Mix10 μ 1上游引物(10μ Μ)1μ 1下游引物(10μ Μ)1μ 120 X SYBRGreenI1 μ 1模板1 μ 1ddH20to 20 μ 1反應條件94°C5min
權利要求
1.建立可控突變率突變庫的方法，步驟如下A、確定突變條件(1)確定替換率將起始模板進行梯度稀釋，實時熒光定量PCR擴增，最低濃度的指數擴增最大循環數下可以得到最多的突變體；挑取最低濃度下的若干克隆測序，得到每個克隆平均突變堿基數，按式(I)計算替換率，替換率=每個克隆平均突變堿基數/(突變目的片段堿基數X最大循環數)；(I)(2)確定預替換堿基數目所需的指數擴增循環數Cl、C2、C3......，按式(II)計算循環數=預期替換堿基數目/(突變目的片段堿基數X替換率)(II)其中C1、C2、C3分別代表預替換堿基數目為1、2、3時所需指數擴增循環數，(3)確定所需起始模板量實時熒光定量PCR擴增處于指數擴增的最大循環數與步驟⑵中確定的循環數C1、C2、C3......相比較，最接近的該PCR擴增所用模板量確定為所需起始模板量T1、T2、T3......其中Tl、Τ2、Τ3分別代表預替換堿基數目為1、2、3時PCT擴增所需起始模板量，B、可控突變率突變庫的建立按照確定的循環數Cl、C2、C3......和對應確定的起始模板量Τ1、Τ2、Τ3......，將起始模板PCR擴增得到可控突變率突變庫L1、L2、L3......，所述Li、L2、L3分別代表平均替換堿基數為1、2、3的突變庫。
2.根據權利要求1所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述起始模板為含有編碼 CrylIe蛋白的核苷酸片段的載體。
3.根據權利要求2所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述起始模板為含有編碼 CrylIe蛋白的核苷酸片段的質粒。
4.根據權利要求3所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述質粒為pAclIe，由pUC19 克隆載體，crylAc啟動子，crylle基因全長組成。
5.根據權利要求4所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述預期替換堿基數目為1、 2、3，可控突變率突變庫為L1、L2、L3。
6.根據權利要求1-5任一所述方法得到的突變庫Li、L2、L3.......
7.權利要求6所述的突變庫中的突變體，所述突變體的核苷酸序列為SEQID N01，其氨基酸序列為SEQ IDN012 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN02，多1；氨基酸？序列為SEQIDN013 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN03，多1；氨基酸i序列為SEQIDN014 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN04，多1；氨基酸i序列為SEQIDN015 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN05，多1；氨基酸i序列為SEQIDN016 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN06，多1；氨基酸i序列為SEQIDN017 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN07，多1；氨基酸i序列為SEQIDN018 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN08，多1；氨基酸i序列為SEQIDN019 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN09，多1；氨基酸？序列為SEQIDN020 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN010,其氨基—f 序列為 SEQ ID N021或突變體的核苷酉I序列為SEQIDNOl 1，其氨基—f 序列為 SEQ ID N022。
8. —個人工突變體，其氨基酸序列為將權利要求7的突變體中的任一兩個以上氨基酸的替換位疊加后得到。
9.根據權利要求8所述的人工突變體，其氨基酸序列為SEQID N024;其核苷酸序列為 SEQ ID N023，或者其氨基酸序列為SEQ ID N026，核苷酸序列為SEQ ID N025 ；其氨基酸序列為SEQ ID N028，核苷酸序列為SEQ ID N027。
10.權利要求7、8、9任一突變庫中的突變體或是人工突變體在殺害鞘翅目害蟲中的應用。
全文摘要
本發明涉及“建立可控突變率突變庫的方法與應用”，屬于生物技術領域。本發明依據TaqDNA聚合酶在合成堿基時的固有誤差和突變特性，針對預期替換不同堿基數目，確認其循環數和起始模板量，建立了一種突變率可控的突變文庫。因此可以根據客戶的需求來定制不同堿基突變數目的文庫，使突變文庫的適應性和目的性增強。本發明采用CrylIe蛋白建立的突變文庫中，活性顯著提高的突變株占整個突變庫的11.96％，其中文庫III高毒力突變株的比例達到13.16％，表明該隨機突變文庫的方法篩選到活力顯著提高的突變株的幾率很高；針對高毒力突變株突變位點人工合成的突變體，殺蟲活性是未突變CrylIe蛋白的1000倍。
文檔編號A01P7/04GK102345172SQ20101024255
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者劉明, 宋福平, 張 杰, 束長龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請人:中國農業科學院植物保護研究所