一種survivin及其突變體轉基因酵母系統及其應用的制作方法

專利名稱：一種survivin及其突變體轉基因酵母系統及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物分子功能研究、生物制藥與酶工程領域，更具體地講，本發明一方面開發了一種研究survivin及其突變體基因作用功能的酵母模型，同時還針對基因工程制藥與酶工程等領域用于外源蛋白與酶高效生產的酵母表達生產體系。
背景技術：
基因表達體系是分子生物學及生命科學研究領域的重要內容，也是基因工程藥物和疫苗研制等應用領域所必需的重要生物反應器。大腸桿菌(E.coli) —直被用作表達外源基因的宿主菌，并成功地表達了多種外源蛋白，但是，它不能表達結構復雜的蛋白質，且分泌型表達產量較低，而包涵體表達產物的完全復性尚存在諸多問題，在表達產物中還常伴有內毒素成分。哺乳動物細胞、昆蟲細胞表達體系雖然能夠表達結構復雜的蛋白質，但其操作復雜，培養成本較高，而其表達水平通常較低，特別是在培養過程中多采用加血清培養，不但增加了成本，而且還可能帶來動物源性病源微生物污染的風險(如瘋牛病朊粒等)， 目前我國在基因工程藥物產業化生產中，由于昂貴的造價和技術方面的原因，無血清、大規模懸浮培養動物細胞，尚難于普遍使用。而獲得穩定、高效表達生產外源蛋白的轉基因動、 植物，不僅操作難度較大，而且成功率又很低。由于歷史的原因及釀造工業的發展，人們對酵母的遺傳背景和生物學特性研究得較透徹，其表達的產物安全性易被接受。隨著生物技術的日新月異的發展，酵母作為真核生物蛋白的表達體系受到廣泛的研究和應用，并日趨成熟。酵母是單細胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培養、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發酵等特性，同時又具有真核生物的蛋白質后加工能力，有適于真核生物基因產物正確折疊的細胞內環境和糖鏈加工體系，還能分泌外源蛋白到培養液中，利于純化。因此，最近二十年來，酵母被認為是一個很有前途的真核表達體系，受到廣泛的研究和應用。釀酒酵母(S. cerevisiae)是首先被用來作為外源基因的表達宿主菌，然而， 人們在應用中逐步發現S.cerevisiae表達重組蛋白具有其局限性。甲醇營養型酵母 (Methylotrophic Yeast)表達體系，作為第二代酵母表達體系，它克服了傳統釀酒酵母表達體系的諸多缺點和不足，成為國內外廣泛而大量生產外源真核或者結構較為復雜的原核蛋白的一個較為理想的、最具有發展前途的表達體系，是實現基因工程疫苗、抗體、酶、激素和毒素等蛋白藥物產業化生產的一個重要技術平臺。然而，畢赤酵母表達系統在實際應用中也存在一些缺點，其中之一是畢赤酵母發酵表達外源蛋白所用的時間長，這個過程中由于可能有甲醇的毒性和生長條件和環境的因素，使其生長活力下降，這一過程伴隨有凋亡現象，而不利于外源蛋白的高效表達。為了解決這一問題，需要從酵母產生凋亡的機制為切入點，分析酵母凋亡機制和凋亡基因，期望通過選擇酵母抗凋亡蛋白BirIp的同源物Survivin對畢赤酵母進行分子重組與遺傳改良，實現降低酵母正常生長的死亡率和凋亡率來提高畢赤酵母的生長密度和速率，為開發生長活力強、生長周期短，耐凋亡的畢赤酵母奠定基礎，使該表達系統更好地應用于外源蛋白與酶高效生產。人Survivin基因定位于17q25，全長約151Λ，該基因有14796個氨基酸，由四個外顯子和三個內含子組成。Survivin有兩個主要的轉錄起始位點，位于在起始碼ATG前-72 和-57/-61處。RNA全長約1. 9Kb，其中開放讀碼框架區(ORF)含似9個堿基，可翻譯出一個142個氨基酸的蛋白。Survivn基因缺少TATAbox區，其啟動子區由一段約250個核苷酸的經典CpG島，3個細胞周期依賴元件(cell cycle d印endent elememts, CDEs), 1個細胞周期同源區(cell cyclehomology region, CHR)和數個SPl區組成。研究發現正常和腫瘤組織中，Survivin啟動子區中的CpG島多處于非甲基化狀態，因此甲基化在Survivin 表達調控中并不起主要作用。當突變掉-171及-151位的SPI序列時，Survivin的轉錄活性約下降63. 82%。⑶E，CHR區則與Survivin在G2/M期的周期性表達有關。利用含⑶E/ CHR區的Survivin promoter-luciferase重組質粒檢測發現，在G2/M期啟動子活性比自然生長細胞高5-10倍，而缺少CDE/CHR區則啟動子活性不表現周期性變化。Survivin的表達可以抑制由多種刺激如i^as，TNF, VPI6，Taxol等誘導的細胞凋亡。Grossman等利用轉基因技術對小鼠皮膚基底層細胞研究發現，Survivin的表達并不影響角化層細胞的分化及增殖，但可以抑制UVB照射引起的細胞凋亡。利用Survivin反義核苷酸阻斷Survivin的表達可抑制細胞增殖，使caspase活性增強并導致細胞自發性凋亡。 研究還發現Survivin的突變體如Cys84_Ala及Thr!M-Ala(SurvivinT34A)均可誘導腫瘤細胞發生自發性凋亡，目前對突變體在腫瘤治療的作用進行研究，而且己取得較好的實驗結果。SurvivinT34A的基因序列及其制備方法參見中國專利200510(^6847.8 (授權公告號CN 100424096C)。Survivin的抗凋亡特性在生物進化中是高度保守的，例如果蠅中的凋亡抑制因子Deterin就與Survivin高度同源。但與其它IAP家族成員相比，Survivin抗凋亡能力相對較弱。Survivin的抗凋亡機制目前尚不清楚。IAP家族成員的抗凋亡作用主要通過直接與caspase結合而使其失活。實驗表明Survivin可與caspase 9及DIABL0/SMAC結合，因此Survivin有可能通過IAP家族傳統的途徑抑制細胞凋亡。但Survivin是否能與 easpase-3直接結合目前尚有爭論。Siin等用E. coli表達Survivin重組蛋白，發現純化后的Survivin重組蛋白以同源二聚體形式存在并可與caspase-7及caspase-3直接結合。 Suzuki等則認為Survivin并不與caspase-3直接結合，當受到Fas刺激或細胞增殖時， Survivin可進入胞核并與cdk4結合，促使p21釋放，p21可與procaspase-3結合，進而抑制Fas介導的細胞凋亡。此外與其它IAP家族成員相比，Survivn的結構中缺乏位于B^序列上游能與caspase結合的“hook”區。因此Survivin即使能與caspase結合也必定是通過與其它IAP家族成員不同的方式進行。所以survivn的抗凋亡作用是通過IAP家族的途徑抑或是通過其他途徑進行還需進一步研究來證實。Survivin不僅具有抗凋亡能力，還參與了細胞分裂的調節。Li等研究發現 Survivin具有周期性表達特點，而且其在紡錘體形成中具有重要作用。利用Survivin反義核苷酸進行研究時也發現，阻斷Survivin的表達不僅會引起細胞發生自發性凋亡而且還會出現多極紡錘體，多核及胞質分裂失敗現象。基因敲除實驗則證實了 Survivin在有絲分裂中所起的重要作用。在胚胎期3. 5天時同源敲除Survivin基因會導致微管組裝缺陷，紡錘體缺失，形成多核細胞，至4. 5天時胚胎死亡。對C. elegans及酵母中的與Survivin同源的IAPs分子研究發現，它們在染色體分離，晚期有絲分裂及胞質分裂等方面與Survivin 作用相類似，但無抗凋亡功能。而研究還發現使用針對Survivin的胞內抗體并不影響胞質分裂，但會影響姐妹染色體分離，微管組裝失敗，紡錘體有絲分裂失調。這表明Survivin不僅參與胞質分裂，而且有可能作用于有絲分裂的多個方面并在微管功能中起重要作用。多細胞生物主要是通過兩個途徑發生凋亡，一是“外源性”途徑，主要由TNFa/ TNFRl，FaS/FaSL等介導，通過細胞膜的死亡受體而觸發，如腫瘤壞死因子受體(TNF- Rl) 和FAS。另一個是“內源性”途徑，即“線粒體”途徑，通過線粒體釋放細胞色素c和Smac/ DIABLO進行調控，由細胞內外凋亡刺激信號發動引起線粒體滲透性增加，釋放細胞色素C 和SMAC/DIABL0。這兩個凋亡路徑通過信號轉導，最后觸發了細胞凋亡的中心環節caspase 的激活，形成級聯反應，使細胞發生凋亡。這一途徑主要被Bcl-2家族的蛋白所控制，包括分別影響線粒體動態平衡和細胞色素c釋放的抗凋亡分子和前凋亡分子。而且，凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的其他蛋白質，包括ML-IAP，XIAP，cIAPl，cIAP2，NIAP，apollon和 Survivin,能夠通過抑制終末效應物caspase_3和caspase_7來阻斷線粒體細胞色素c釋放過程中處于下游的一個共有步驟，干擾caspase-9的活化和后續過程的進行。凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、 caspase家族、癌基因如C_myC、抑癌基因P53等，隨著分子生物學技術的發展對多種細胞凋亡的過程有了相當的認識，但是迄今為止凋亡過程確切機制尚不完全清楚。活性氧(ROS)是常用的凋亡誘導劑。應用低劑量H2A處理培養的哺乳動物細胞， 可誘發凋亡級聯反應。此外去除神經生長因子或鉀離子，可使神經細胞產生的ROS作為凋亡通路的晚期信號，激活下流的Bax和caspases。將S. Ceresiviase用低劑量H2A處理，或耗盡其谷胱甘肽以引起氧化應激，可誘導凋亡。敲除酵母細胞的YCAl基因，增強細胞對H2O2的抵抗能力。進一步的研究發現，即使在無細胞外氧化應激存在的情況下，當酵母細胞發生凋亡時，細胞內ROS生成同樣增加。 表達Bax和cdcS565G的酵母突變體，用dihydrorhodaminel23染色時顯示強陽性，說明細胞內有ROS的積聚。由于氧自由基是酵母細胞凋亡所必需的，所以ROS在酵母凋亡時起重要的作用。當阻斷囊泡融合形成時，酵母細胞對H2O2更加敏感，更易誘導凋亡。因此，⑶C48突變體可能通過促進自由基的產生和阻斷囊泡融合這兩種截然不同的、可相互協同的途徑啟動凋亡。而Abudugupur發現自噬細胞的死亡可能也與酵母凋亡有關，但可能是通過⑶C48 突變體相反的方式引起的。因為他發現通過誘變ADP-核糖化樣蛋白1(能引起囊泡形成障礙，破壞膜轉運)可阻斷Bax誘導的細胞死亡，而不是促進其凋亡。研究酵母凋亡具有主要的生理學意義。ROS在調節凋亡中的重要作用可能顯示了酵母細胞自殺死亡的生理意義。ROS是需氧生物在呼吸過程中產生的。由于ROS能與蛋白、 脂質、核酸發生作用，因此ROS誘導的細胞損害很常見。細胞在進化中，也形成了一套清除 ROS毒性損傷的機制，但這只能減輕損害的發生，不能完全阻止致死性的細胞損害。大多數受損傷的細胞即使已不再有繁殖能力，也能持續存活一段時間。如果這些細胞發生主動、快速的死亡將有助于為鄰近細胞節省代謝能量，既使是在具有相同基因的、同一菌落的單細胞生物中。因此單細胞生物的自殺死亡可能有助于其基因組的進化。酵母細胞復制的周期是有限的，S. Cerevisiae在最適條件時的復制周期是25-35次，或大約3天，隨著復制周期的增加，細胞內ROS積聚，細胞死亡，并可見典型的凋亡表現。HerKer也發現老化的酵母
5細胞死亡時細胞出現凋亡標記、氧自由基積聚、Caspase活化等。老化誘導的細胞凋亡可被 YAPl (在氧應激時出現的一個關鍵的轉錄活化因子)的表達所延滯。被YCAl (相當于哺乳動物細胞的caspase)的表達所破壞。然而凋亡機制的紊亂可減弱再生能力，在長時間的直接競爭性的實驗中，野生型細胞比YCAl破壞細胞活的時間更長，提示凋亡通過清除不適應細胞，對整個種群具有“清潔”效應。有趣的是，增加肌動球蛋白動力的突變能延長酵母的生命，而降低肌動球蛋白動力增強Caspase的活性，改變線粒體功能，導致細胞死亡。人survivin中含有一個BIR結構域，而在酵母Birlp中含有2個BIR結構域。 而酵母Birlp基因相對較長，克隆和表達相對survivin略有難度，survivin相對較短，研究深入。二者均對真核細胞的凋亡有密切的關系。將人survivin及其突變體構建入酵母， 整合在其基因組上，對于研究survivin又是一個很合適的簡便的模型。

發明內容
本發明的目的在于提供一種耐凋亡轉基因酵母系統。本發明的第二個目的是提供一種促凋亡轉基因酵母系統。本發明的第三個目的是提供所述轉基因酵母系統的構建方法。本發明的第四個目的是提供所述轉基因酵母系統在研究survivin及其突變體作用與功能中的應用。本發明的第四個目的是提供所述轉基因酵母系統在外源蛋白與酶高效生產中的應用。為實現以上目的，本發明公開以下技術方案一種耐凋亡轉基因酵母系統，其特征在于，所轉基因為survivin基因，所用載體為組成型質粒pGAPZA或者誘導型質粒pPICZA。一種促凋亡轉基因酵母系統，其特征在于，所轉基因為survivin第34位突變體基因，所用載體為誘導型質粒PPICZA或者組成型質粒pGAPZA。轉基因酵母系統的構建方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)構建重組質粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin(T;34A)、pGAPZA_survivin 或者 pGAPZA-survivin(T34A)，分別對原始質粒 pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin 進行雙酶切處理，所用內切酶為EcoRI和BioI，然后利用TAKARA公司生產的"Γ4 DNA Ligase 試劑盒將基因片段和載體片段進行連接，獲得重組質粒，所述載體為誘導型質粒PPICZA或者組成型質粒PGAPZA ；
(2)將步驟(1)獲得的重組質粒分別利用電穿孔方式轉化進入畢赤酵母，經過同源重組整合到畢赤酵母基因組中，獲得目標轉基因酵母系統。所述轉基因酵母系統在研究survivin及其突變體作用與功能中的應用。所述轉基因酵母系統在外源蛋白與酶高效生產中的應用。本發明的優點在于本發明提供的轉基因酵母具有與原來不同的生長特性與用途，這既顯示了 survivin及其突變體在酵母中的作用，可以此作為研究其作用與功能的一個模型，同時又獲得了可以通過對畢赤酵母的分子重組與遺傳改良，實現降低酵母正常生長的死亡率和凋亡率來提高畢赤酵母的生長密度和速率，從而開發出具有生長活力強、生長周期短、耐凋亡的畢赤酵母表達系統，使其更好地應用于外源蛋白與酶高效生產。


圖1為pPICZA-surViVin(T34A)質粒的構建流程示意圖。圖 2 為 pPICZA-survivin(T34A)質粒的菌落 PCR 鑒定圖，其中 1 :2000bp 的 marker ； 2 :PCR 產物。圖 3 為 pPICZA_survivin(T34A)質粒的 XhoI 和 EcoRI 雙酶切鑒定圖。圖4為pPICZA-survivin質粒的構建流程示意圖。圖5為pPICZA-survivin質粒的菌落PCR鑒定圖。圖6為pPICZA-survivin質粒的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定圖。圖7為pGAPZA-survivin (T34A)質粒的構建流程示意圖。圖 8 為 pGAPZA-survivin (ΤΙΜΑ)質粒的酶切示意圖，其中，1 :pGAPZA 用 EcoRI 和 XhoI 雙酶切圖；2 :pREST-survivin(T34A)用 EcoRI 和 XhoI 雙酶切圖；3:2000 的 marker 圖 9 為pGAPZA-survivin (ΤΙΜΑ)質粒的菌落 PCR 鑒定圖，其中，1 :2000 的 marker; 2、3、4、5 :PCR鑒定產物。圖10為pGAPZA-survivin(T34A)質粒的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定圖，其中，1:用 EcoRI 和 XhoI 的雙酶切圖；2: 2000 的 marker 圖11為pGAPZA-survivin質粒的構建流程示意圖。圖12為pGAPZA-survivin質粒的酶切示意圖，其中，l:pGAPZA用EcoRI和XhoI的雙酶切圖；2 :pGEM-T-survivin 用 EcoRI 和 XhoI 的雙酶切圖；3 :2000bp 的 marker。圖13為pGAPZA-survivin質粒的菌落PCR鑒定圖，其中，1、2、3、4 :PCR產生的片段；5 :2000bp 的 marker。圖14為pGAPZA-survivin質粒的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定圖，其中，1:連接產物用 EcoRI 和 XhoI 雙酶切圖；2 :2000bp 的 marker 圖15為誘導型轉基因酵母PCR鑒定圖。圖16為誘導型轉基因酵母生長曲線圖。圖17為MTT法測定誘導型轉基因酵母凋亡抑制率，其中，正值為抑制率，而負值為促生長率。圖18為誘導型轉基因酵母流式細胞儀雙參數點圖。圖19為組成型轉基因酵母PCR鑒定圖。圖20為組成型轉基因酵母生長曲線圖。圖21為MTT法測定組成型轉基因酵母凋亡抑制率，其中，正值為抑制率，而負值為促生長率。圖22為組成型轉基因酵母流式細胞儀雙參數點圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發明。實施例一誘導型重組質粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin (T34A)的構建。為了證實survivin基因的一些性質與功能，驗證survivin對酵母細胞的凋亡的影響，將該基因和該基因的突變體通過雙酶切以及連接反應克隆至誘導型表達載體PPICZA 中，獲得重組質粒pPICZA-survivin和pPICZA-survivin (T34A)。其中兩個載體分別攜帶目的基因survivin和其34位點的突變形式survivin (T34A)。重組質粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin (T34A)的構建采用限制性內切酶EcoRI和BioI，分別對本實驗室保存的原始質粒pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin進行雙酶切處理，然后利用TAKARA公司生產的T4 DNA Ligase試劑盒將基因片段和載體片段進行連接，獲得重組質粒。原始質粒pREST-survivin (T34A)和pGEM-T-survivin的制備參見中國專利 200510026847. 8 (授權公告號CN 100424096C)。pPICZA-survivin(T34A)質粒的構建流程示意圖見圖1。利用XhoI和XhoI雙酶切pREST-survivin (T34A)，回收目標片段，用同樣酶切的載體進行連接，轉化大腸桿菌Dffia后，涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5mlLLB培養基中過夜培養，抽提質粒，進行菌落PCR鑒定和B10I和 EcoRI雙酶切鑒定。菌落PCR鑒定選取陽性克隆于5ml LLB培養基中過夜培養，第二天菌液在100° C煮3-5min，然后進行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結果如圖 2所示，由圖2可知，PCR結果與目的片段大小基本一致，表明構建質粒中已經存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質粒，然后進行雙酶切，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結果如圖3所示。由圖3可知，雙酶切鑒定結果的目的片段的大小與預期一致，這已經基本確定質粒構建成功。pPICZA-survivin質粒的構建流程示意圖見圖4。利用BioI和BioI雙酶切pGEM-T-survivin，回收目標片段，用同樣酶切的載體 PPICZA連接，轉化大腸桿菌Dffia后，涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5mlLLB培養基中過夜培養，抽提質粒，進行菌落PCR鑒定和B10I和 EcoRI雙酶切鑒定。在雙酶切過程中，由于pGEM-T載體有兩個BioI酶切位點，那么會產生 EcoRI-XhoI (1) ,EcoRI-XhoI (2)和XhoI-XhoI (3)三個片段，在此采用尋找目的片段，連接后通過測序比對完全確定目的片段是否完全連接上。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆于5ml LLB培養基中過夜培養，第二天菌液在100° C 煮3-5min，進行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結果如圖5所示。由圖5 可知，PCR結果與目的片段大小基本一致，表明構建質粒中已經存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質粒，進行雙酶切，然后通過 1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結果如圖6可知，雙酶切鑒定結果的目的片段的大小與預期一致， 這已經基本確定質粒構建成功。測序結果比對，將上述挑取培養的2個陽性克隆送樣至公司測序。得測序結果，利用信息學比對軟件，進行比對，序列完全一致。實施例二組成型重組質粒pGAPZA-survivin 和 pGAPZA-survivin(T;34A)的構建。為了驗證survivin對酵母細胞的凋亡的影響，將該基因和其突變體通過雙酶切以及連接反應克隆至組成型表達載體PGAPZA中，獲得重組質粒pGAPZA-survivin和 pGAPZA-survivin (T34A)。其中兩個載體分別攜帶目的基因survivin和其34位點的突變形式 survivin (T34A)。重組質粒 pGAPZA-survivin、pGAPZA-survivin (TiMA)的構建采用限制性內切酶EcoRI和)(hoI，分別對本實驗室保存的原始質粒pREST-SurViVin(T34A)和 pGEM-T-survivin進行雙酶切處理，然后利用TAKARA公司生產的T4 DNA Ligase試劑盒將基因片段和載體片段進行連接，獲得重組質粒。pGAPZA-SUrvivin(T34A)質粒的構建流程示意圖見圖7。利用BioI和BioI雙酶切pREST-survivin (T34A)，回收目標片段，用同樣酶切的載體pGAPZA進行連接，轉化大腸桿菌Dffia后，涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5ml LLB培養基中過夜培養，抽提質粒，進行菌落PCR鑒定和 XhoI和EcoRI雙酶切鑒定。酶切示意圖如圖8所示。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆于5ml LLB培養基中過夜培養，第二天菌液在100°C 煮3-5min，進行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結果如圖9所示。由圖9 可知，PCR結果與目的片段大小基本一致，表明構建質粒中已經存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質粒，雙酶切鑒定體系進行雙酶切，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結果如圖10可知，雙酶切鑒定結果的目的片段的大小與預期一致，這已確定質粒構建成功。pGAPZA-survivin質粒的構建流程示意圖見圖11。利用BioI和BioI雙酶切 pGEM-T-survivin,回收目標片段，用同樣酶切的載體pGAPZA連接，轉化大腸桿菌Dffia后， 涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5mlLLB培養基中過夜培養，抽提質粒，進行菌落PCR鑒定(圖)和BioI和EcoRI雙酶切鑒定。在雙酶切過程中，由于pGEM-T載體有兩個)(ho I酶切位點，那么會產生EcoRI-XhoI (1)、EcoRI-Xho I (2)和 XhoI-XhoI (3)三個片段，在此采用尋找目的片段，連接后通過測序比對完全確定目的片段是否完全連接上。酶切示意圖如圖12所示。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆于5ml LLB培養基中過夜培養，第二天菌液在100° C 煮3-5min，進行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結果如圖13所示。由圖 13可知，PCR結果與目的片段大小基本一致，表明構建質粒中已經存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質粒，然后進行雙酶切鑒定， 然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結果如圖14所示。由圖14可知，雙酶切鑒定結果的目的片段的大小與預期一致，這已經初步部確定質粒構建成功。經過測序比對，將上述挑取培養的陽性克隆送樣至公司測序。得測序結果，利用信息學比對軟件，進行比對，序列完全一致。實施例三誘導型survivin與survivin (T34A)轉基因酵母及其特性。采用試劑將質粒轉化入酵母，采用篩選培養基YPD中的^ocin抗性濃度的使用進行篩選。按照操作步驟將涂布的平板置于30° C條件下培養4-5天，挑取長出的陽性克隆。kocin的濃度開始使用100微克/毫升，后來經幾次的濃度的梯度篩選，按照25微克 /毫升進行篩選將取得最佳效果。抗性濃度太高適合篩選高通量的克隆，抗性濃度太低菌落會因為太多實驗無法繼續進行。酵母基因組的提取及PCR鑒定。因為酵母具有較厚的細胞壁，一般處理細菌的破壁方法，無法將酵母基因組釋放出，而試劑盒成本較高，此步驟作為一個驗證過程，需要簡化步驟又要切實可行。經參考文獻，總結出一套粗提取酵母基因組，用于PCR鑒定的模板。 首先離心取得適量菌體，加入PBS，煮沸10分鐘，離心，取得上清，然后加入PBS相同體積的
9異丙醇，放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉上清，空氣中放置5分鐘，至殘留異丙醇完全揮發，加入20微升TE buffer備用。按照上述PCR鑒定體系，進行PCR。得到結果圖如圖15所示，將PCR產物回收，送至公司測序，然后通過生物信息學比對軟件進行比對，序
列完全一致。將轉化好的重組酵母按照，條件進行培養，設置對照組，對照組為未進行任何突變或者轉化的野生型畢赤酵母X33。按照常規方法進行取樣，使用紫外-可見分光光度計測定600 nm處的吸收值。標準生長曲線以600 nm處的吸收值為縱坐標(y)，時間為橫坐標(X)，繪制標準曲線，如圖16所示。注意，該標準曲線測定測定過程中，可見分光光度計最高測量值為3. 000，當OD值超過3. 000時，需要使用原始的培養基進行10X，20X，30X的稀釋，最后OD值需乘以相應倍數進行計算。按照MTT法的步驟測定酵母細胞的死活比率，計算在選定時間M小時、48小時、72 小時的抑制率。測定酵母凋亡抑制率過程中，注意OD的稀釋問題，測定前需將酵母細胞濃度稀釋至OD值為1，測定490nm時的結果。圖17為MTT法測定酵母凋亡抑制率結果。在菌體培養過程中，菌液通過用培養基稀釋至OD值為1，然后用MTT法測樣，利用計算抑制率的公式抑制率=(突變組-對照組)/對照組，在M小時，48小時，72小時，突變組的抑制率分別為8. 815%、12. 948%、16. 859%。而未突變組的負抑制率，即促生長率為5. 466%,7. 289%、 11. 395%。流式細胞儀分析結果，將構建的畢赤酵母菌按照誘導條件培養，在90小時的時候取樣，按照Armexin V vs PI的雙染色法進行染色，然后用流式細胞儀上樣，結果如圖18所
7J\ ο由圖18可以看出，001為對照組，004和005分別為含有基因survivin和 survivin (T34A)的酵母，圖004中的死亡細胞的象限和凋亡細胞的象限的點均比對照組要少，而005中死亡細胞的象限區域明顯比對照組要多出很多點。由此可以看出，含有基因 survivin (T34A)的酵母明顯發生的促凋亡現象，導致在相同條件和情況下，酵母細胞死亡數相對較多，而含有基因survivin的酵母也能看出其死細胞的數目略有減少的現象，即證明其促生長作用。將酵母的抗凋亡蛋白Birlp的同源類似物Survivin和其突變體Survivin (T34A) 構建至原核生物和真核生物穿梭質粒PPICZA中，并將構建的重組質粒轉化到畢赤酵母中， 使其同源重組，將基因片段整合到畢赤酵母X33的基因組上。畢赤酵母會以誘導形式的表達Survivin蛋白和Survivin(T34A)蛋白。按照培養畢赤酵母的最佳條件0. 5%的甲醇誘導，28° C進行培養，并測定其生長曲線，含有促生長的survivin基因的重組畢赤酵母X33 的生長率和最終穩定期菌液OD值均比含有具有促細胞凋亡的survivin(T34A)基因的重組畢赤酵母X33的OD值要高，而對照組的檢測值處于二者之間。在M小時、48小時、72小時取樣利用MTT法測定酵母凋亡的抑制率，突變組的抑制率分別為8. 815%、12. 948%、16. 859%。 而未突變組的負抑制率，即促生長率為5. 466%、7. 289%U1. 395%。實施例四組成型survivin與survivin(T34A)轉基因酵母及其特性。重組質粒轉化酵母及鑒定。酵母的轉化采用的杰美公司的小量酵母轉化試劑盒， 進行酵母轉化質粒，在最后篩選培養基YPD中的^ocin抗性濃度的使用進行選擇。按照操作步驟將涂布的平板置于30°C條件下培養4-5天，挑取長出的陽性克隆。kocin的濃度開始使用100微克/毫升，后來經幾次的濃度的梯度篩選，按照25微克/毫升進行篩選將取得最佳效果。抗性濃度太高適合篩選高通量的克隆，抗性濃度太低菌落會因為太多實驗無法繼續進行。酵母基因組的提取及PCR鑒定。提取酵母基因組，用于PCR鑒定的模板。首先離心取得適量菌體，加入PBS，煮沸10分鐘，離心，取得上清，然后加入PBS相同體積的異丙醇， 放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉上清，空氣中放置5分鐘，至殘留異丙醇完全揮發，加入20微升TE buffer，備用。按照上述提及的PCR鑒定體系，進行PCR。得到結果如圖19所示。將PCR產物回收，送至公司測序，然后通過生物信息學比對軟件進行比對，序列完全一致。將轉化好的重組酵母按照，條件進行培養，設置對照組，對照組為未進行任何突變或者轉化的野生型畢赤酵母X33。按照常規方法進行取樣，使用紫外-可見分光光度計測定600 nm處的吸收值。標準生長曲線以600 nm處的吸收值為縱坐標(y)，時間為橫坐標(X)，繪制標準曲線，見圖20。注意，該標準曲線測定測定過程中，可見分光光度計最高測量值為3. 000，當OD值超過3. 000時，需要使用原始的培養基進行10X，20X，30X的稀釋，最后OD值需乘以相應倍數進行計算。菌液生長過程中，按照時間M小時、48小時、72小時取樣進行測定。在菌體培養過程中，菌液通過用培養基稀釋至OD值為1，然后用MTT法測樣，利用計算抑制率的公式，在 24小時，48小時，72小時，突變組的抑制率分別為5. 577%、10. 401%、14. 239%。而未突變組的負抑制率，即促生長率為4. 615%,6. 721%,9. 255%，圖21為MTT法測定酵母凋亡抑制率結果。將構建的畢赤酵母菌按照誘導條件培養，在90小時的時候取樣，按照Armexin V vs PI的雙染色法進行染色，然后用流式細胞儀上樣，得到的流式細胞儀分析結果如圖22所示。由圖22可以看出，001為對照組，002和003分別為含有基因survivin和 survivin (34)的酵母，圖002中的死亡細胞的象限和凋亡細胞的象限的點均比對照組要少，而003中死亡細胞的象限區域明顯比對照組要多出很多點。由此可以看出，含有基因 survivin (T34A)的酵母明顯發生的促凋亡現象，導致在相同條件和情況下，酵母細胞死亡數相對較多，而含有基因survivin的酵母也能看出其死細胞的數目略有減少的現象，即證明其促生長作用。將酵母的抗凋亡蛋白Birlp同源類似物Survivin和其突變體Survivin (T34A) 構建至原核生物和真核生物穿梭質粒PGAPZA中，并將構建的重組質粒轉化到畢赤酵母中， 使其同源重組，將基因片段整合到畢赤酵母X33的基因組上。畢赤酵母會組成型的表達 Survivin蛋白和Survivin(T34A)蛋白。按照培養畢赤酵母的最佳條件進行培養，并測定其生長曲線，含有促生長的survivin基因的重組畢赤酵母X33的生長率和最終穩定期菌液 OD值均比含有具有促細胞凋亡的survivin (T34A)基因的重組畢赤酵母X33的OD值要高， 而對照組的檢測值處于二者之間。在M小時、48小時、72小時取樣利用MTT法測定酵母凋亡的抑制率，突變組的抑制率分別為5. 577%、10. 401%、14. 239%。而未突變組的負抑制率， 即促生長率為 4. 615%,6. 721%,9. 255%。流式細胞儀分析結果證明兩種重組畢赤酵母在生長率、死亡率和抑制率具有明顯的差異。實施例三中的誘導型表達的結果與實施例四中組成型表達的結果相比較，誘導型的結果顯示比組成型的結果要明顯，相同時間和條件下的培養菌液OD值誘導型的較高，抑制率和促生長率誘導型的較高。 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種耐凋亡轉基因酵母系統，其特征在于，所轉基因為survivin基因，所用載體為組成型質粒PGAPZA或者誘導型質粒pPICZA。
2.一種促凋亡轉基因酵母系統，其特征在于，所轉基因為survivin第34位突變體基因，所用載體為誘導型質粒PPICZA或者組成型質粒pGAPZA。
3.權利要求1或2所述轉基因酵母系統的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)構建重組質粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin(T34A)、pGAPZA_survivin 或者 pGAPZA-survivin(T34A)，分別對原始質粒 pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin 進行雙酶切處理，所用內切酶為EcoRI和BioI，然后利用TAKARA公司生產的T4 DNA Ligase 試劑盒將基因片段和載體片段進行連接，獲得重組質粒，所述載體為誘導型質粒PPICZA或者組成型質粒PGAPZA ；(2)將步驟(1)獲得的重組質粒分別利用電穿孔方式轉化進入畢赤酵母，經過同源重組整合到畢赤酵母基因組中，獲得目標轉基因酵母系統。
4.權利要求1或2所述轉基因酵母系統在研究survivin及其突變體作用與功能中的應用。
5.權利要求1所述轉基因酵母系統在外源蛋白與酶高效生產中的應用。
全文摘要
本發明公開一種耐凋亡或促凋亡轉基因酵母系統，所轉基因為survivin基因或survivin第34位突變體，所用載體為組成型質粒pGAPZA或者誘導型質粒pPICZA。本發明提供的轉基因酵母具有與原來不同的生長特性與用途，這既顯示了survivin及其突變體在酵母中的作用，可以此作為研究其作用與功能的一個模型，同時又獲得了可以通過對畢赤酵母的分子重組與遺傳改良，實現降低酵母正常生長的死亡率和凋亡率來提高畢赤酵母的生長密度和速率，從而開發出具有生長活力強、生長周期短、耐凋亡的畢赤酵母表達系統，使其更好地應用于外源蛋白與酶高效生產。
文檔編號C12P21/00GK102367422SQ201110008959
公開日2012年3月7日 申請日期2011年1月17日 優先權日2011年1月17日
發明者劉琨, 姚碧, 李林鳳, 鄭文云, 馬興元 申請人:華東理工大學