專利名稱：一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法
一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法技術領域
本發明屬于植物轉基因領域，具體涉及一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉 化體系及方法；該轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和 所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0. 05% (V/V)；該轉化方法的步驟為選取自交授 粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。
背景技術：
在玉米的轉基因方法研究中，已經報道了多種可行方法可以將外源基因導入玉米 中并得以穩定遺傳，這些方法包括基因槍法，PEG介導法，電激法，農桿菌介導法和花粉管通 道法。在這些轉化方法中大多依賴于玉米的組織培養技術，玉米的組織培養受基因型和受 體范圍的限制比較大，而花粉管通道轉化法不依賴于植物的組織培養技術，無需昂貴的儀 器設備，不受自交系品種和轉化基因類型的限制，以及可進行規模化轉化等優點，因此備受 人們的青睞。
花粉管通道轉化法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心 通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。周光宇(1979)認為 可以利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道(花粉管引導組織)，經珠心通道將外源DNA 攜帶進入胚囊，轉化受體為受精卵或其前后的生殖細胞(精子或卵子)，由于它們仍處于未 形成細胞壁的類似“原生質體”狀態，并且正進行活躍的DNA復制、分離和重組，所以很容易 將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達到遺傳轉化的目的(《遠緣雜交的分子基礎-DNA 片段雜交假說的一個論證》遺傳學報，1979，6 (4): 405-413)。但目前玉米花粉管通道法還 存在轉化效率較低的問題，轉化率為0. 36%-5.洲不等(關淑艷，張健華，柴曉杰，馬義勇，曲 同寶，孫波，王丕武；《花粉管通道法將淀粉分支酶基因反義表達載體轉入玉米自交系的研 究》；玉米科學，2005，13 (4) :13-15)、(王罡，張艷貞，魏松紅，胡應剛，吳穎，季靜；《花粉管 通道法將Bt毒蛋白基因導入優良玉米自交系》；吉林農業大學學報，2002, (4):40-44).
因此，在農業科研及生產中需要一種轉化效率高、操作簡便、能將含有目的DNA的 質粒DNA溶液直接轉入玉米的提花粉管通道轉化體系及其轉化方法。發明內容
本發明提供一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法，該轉化體系 中，含有質粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積 比為0. 01% 0. 05% (V/V)；該轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和 花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。本發明轉化效率高、操作簡便、適用的玉米范圍 廣泛。
本發明的目的是由以下技術方案實現的一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，所述的轉化體系中，含有質粒DNA 溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0.05% (V/V)。
所述的質粒DNA溶液中的質粒帶有植物除草劑篩選標記基因Bar。
所述的質粒為pBPC-Zmptil-bar、pBPC-P5CS-FU9A、PBI121-bar-TPSl、 PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。
本發明的目的是由以下另一技術方案實現的一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化方法，提高玉米轉基因效率的花粉管通道 轉化體系轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質 粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0. 05% (V/V);所述的轉化方法的步驟為選取自交授粉后 的玉米的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處；使外源DNA經花粉進 入時形成的通道進入幼胚，從而完成外源DNA導入過程。
所述的玉米為玉米自交系178、501、517，M017、C7-2、吉444、京對。
本發明與現有技術相比具有以下有益效果1、本發明在質粒DNA溶液中添加合適濃度的表面活性劑Silwet L-77，故可以改善含 質粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA溶液在玉米花絲或柱頭上的潤濕、粘附與滲透，增加 玉米花粉管對DNA的吸收率，從而提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率。
2、本發明中，因為是直接將含有目的DNA的質粒DNA溶液直接轉入玉米中，不依賴 于玉米的組培再生體系，所以操作簡便，無需昂貴儀器，生產成本低廉。
3、本發明不受玉米自交系品種和轉化基因種類的限制，適用范圍廣泛。
圖 1 質粒 pBPC-Zmptil-bar 圖譜；圖 2 質粒 pBPC-P5CS-F129A 圖譜；圖 3 質粒 PBI121-bar-TPSl 圖譜；圖 4 質粒 PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA 圖譜；圖5 實施例2中，噴施200mg/L除草劑后的玉米植株的照片；圖6 實施例2中，對除草劑抗性植株的PCR分子檢測結果；圖7 實施例2中，對PCR檢測呈陽性植株的免疫印跡驗證結果；圖8 實施例2中，Tl代轉基因植株噴施除草劑5天后的照片；圖9 實施例12中，中間載體pGreen0029-35s-bar-nos的構建流程圖；圖10 實施例12中，表達載體pBI121-TPS I的構建流程圖；圖11 實施例12中，質粒pBI121- TPSl-bar的構建流程圖。
具體實施例方式
實施例1 一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及其轉化方法，所述的轉化體系中， 含有質粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比 為 0. 01% 0. 05% (V/V)。
所述的質粒DNA溶液中的質粒帶有植物除草劑篩選標記基因Bar。
所述的質粒為pBPC-Zmptil-bar、pBPC-P5CS-FU9A、PBI121-bar-TPSl、PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。
一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化方法，提高玉米轉基因效率的花粉管 通道轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Mlwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA 溶液的體積比為0.01% 0.05% (V/V);所述的轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米 的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。
所述的玉米為玉米自交系178、501、517，M017、C7-2、吉444、京對。
本實施例采用的Silwet L-77，是一種有機硅表面活性劑；在質粒DNA溶液中添加 合適濃度的表面活性劑Silwet L-77，故可以改善含質粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA 溶液在玉米花絲或柱頭上的潤濕、粘附與滲透，增加玉米花粉管對DNA的吸收率，從而提高 外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率。
本實施例中，因為是直接將含有目的DNA的質粒DNA溶液直接轉入玉米中，不依賴 于玉米的組培再生體系，所以操作簡便，無需昂貴儀器，生產成本低廉。
本實施例的轉化方法不受玉米自交系品種和轉化基因種類的限制，適用范圍廣 泛。
實施例2 本實施例是在實施例1基礎上的優選方案，應用于質粒pBPC-Zmptil-bar。
所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 02% (V/V)。
所述的轉化體系的制備方法包括以下步驟A、菌體活化先挑一個含有質粒pBPC-Zmptil-bar的單菌落到7ml含50mg/L氨芐 青霉素的LB (胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉 (NaCl) 10g/L)液體培養基中，在37°C、250 rpm條件振蕩培養過夜(12 16 h)，得到菌液 A；B、擴大培養然后將所述的菌液A稀釋到經37°C溫育過350 ml LB (含50mg/L氨芐 青霉素)液體培養基中，200 rpm振蕩培養約10 h，得到菌液B;C、質粒DNA的提取和純化將所述的菌液B在室溫下8000rpm離心10 min,收集菌體 后利用高純度質粒大提試劑盒(NEW INDUSTRY，北京通寶達公司代理)按照說明書進行質粒 DNA的提取和純化，最后用無菌水溶解，得到溶液A ；D、質粒DNA溶液的制備再將所述的溶液A倍比稀釋后在0.8 %的瓊脂糖膠上電泳， 分析其純度和濃度；最后將溶液中的DNA濃度調整為500 μ g/ml，得到所述的質粒DNA溶 液；F、轉化體系的配制在所述的質粒DNA溶液添加Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和 所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 01% (V/V)0
所述的轉化方法包括以下步驟選擇玉米受體材料，在開花期從受體自交系群體中選擇發育較好的植株進行套袋授粉 自交。選取自交授粉后18 20h的玉米的果穗，先將雌穗上的紙袋摘下，用剪刀剪去距離 穗軸頂端1 2厘米的花絲和苞葉，保持花絲切面平齊，加以修剪并使苞葉內的花絲略低于 苞葉；然后用移液槍在切口處滴注200-300ul所述的反應體系，之后立即重新套上紙袋，記 載導入時間及質粒名稱，待其吸收后(約1小時)重復滴注1次，每種處理做3-5個果穗。 待玉米果穗成熟時，將其分別曬干脫粒，備用。
所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實施例中，質粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法記載于《ZmPtil基因正義和RNAi 表達載體的構建及其轉化玉米的研究》(張森燕，吳忠義，張秀海，劉占磊，王永勤，黃叢林。 華北農學報，2008，23 (5):1-5)。
本實施例的檢測方法結果如下本實施例中Silwet L-77購自GE公司，其他試劑均為常規試劑，可以在市場上購買得到。
一、除草劑篩選檢測在北京地區4月下旬到5月上旬將玉米種子播種在普通溫室土壤中，適當澆水保持土 壤達到一定的濕度，待種子萌發后長到3-4葉期，統計發芽率，此時噴施除草劑草銨膦(商 品名百速頓，浙江永農公司生產)200mg/L (百速頓原液稀釋1000倍)，5天后統計存活的綠 苗數，此時存活苗統計為除草劑抗性苗。如圖5所示，圖中為噴施200mg/L除草劑后的照片， 綠苗為除草劑的抗性苗。
二、PCR分子檢測參照張森燕等(2008)方法進行，該方法記載于《ZmPtil基因正義和RNAi表達載體的 構建及其轉化玉米的研究》(張森燕，吳忠義，張秀海，劉占磊，王永勤，黃叢林；華北農學報， 2008,23 (5) 1-5)如圖6所示，圖中為對除草劑抗性植株的PCR分子檢測結果。1 水，2 非轉基因植株； 3-7 除草劑抗性轉基因植株。
三、免疫印跡檢測參照田路明(2006)方法進行，該方法記載于《Overexpression AtNHXl confers salt-tolerance of transgenic tall fescue〉〉(Tian Luming, Huang Conglin, Yu Rong, Liang Ruifang, Li Zhiliang, Zhang Lusheng, Wang Yongqin, Zhang Xiuhai and Wu Zhongyi*. African Journal of Biotechnology, 2006,5(11): 1041—1044)如圖7所示，圖中為對PCR檢測呈陽性植株進行免疫印跡驗證結果。WT 非轉基因植 株；1-6為轉基因植株，可以看到轉基因植株中有不同程度的蛋白的表達。
四、轉基因植株性狀檢測如圖8所示，圖中為Tl代轉基因植株噴施除草劑5天后的照片，中間發黃的植株沒有 除草劑抗性，說明該方法轉化的轉基因株系能夠穩定遺傳到下一代。
本實施例中，轉化后得到的玉米籽粒數、出苗數、除草劑抗性苗數、 PCR檢測呈 陽性數、轉化率(按檢測陽性數與出苗數計算)的統計詳見表1。
實施例3 本實施例是在實施例1基礎上的優選方案，應用于質粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實施例中，所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 01% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實施例中，質粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實施例2 ；本實施例的所述的轉化體系的制備方法、轉化方法、檢測方法詳見實施例2 ；轉化后得 到的玉米籽粒數、出苗數、除草劑抗性苗數、PCR檢測呈陽性數、轉化率(按檢測陽性數與出 苗數計算)的統計詳見表1。
實施例4 本實施例是在實施例1基礎上的優選方案，應用于質粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實施例中，所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 03% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實施例中，質粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實施例2 ；本實施例的所述的轉化體系的制備方法、轉化方法、檢測方法詳見實施例2 ；轉化后得 到的玉米籽粒數、出苗數、除草劑抗性苗數、PCR檢測呈陽性數、轉化率(按檢測陽性數與出 苗數計算)的統計詳見表1。
實施例5 本實施例是在實施例1基礎上的優選方案，應用于質粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實施例中，所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 04% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實施例中，質粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實施例2 ；本實施例的所述的轉化體系的制備方法、轉化方法、檢測方法詳見實施例2 ；轉化后得 到的玉米籽粒數、出苗數、除草劑抗性苗數、PCR檢測呈陽性數、轉化率(按檢測陽性數與出 苗數計算)的統計詳見表1。
實施例6:本實施例是在實施例1基礎上的優選方案，應用于質粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實施例中，所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 05% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實施例中，質粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實施例2 ；本實施例的所述的轉化體系的制備方法、轉化方法、檢測方法詳見實施例2 ；轉化后得 到的玉米籽粒數、出苗數、除草劑抗性苗數、PCR檢測呈陽性數、轉化率(按檢測陽性數與出 苗數計算)的統計詳見表1。
由表1中可知，與未添加有Silwet L-77的反應體系相比，添加有Silwet L-77的 轉化體系能夠顯著提高質粒pBPC-Zmptil-bar轉化玉米的效率；但是，如果Silwet L-77的 濃度過高0. 1%)會影響玉米的結實率。
表1: Silwet L-77對質粒pBPC-Zmptil-bar轉化玉米的效率的影響
權利要求
1.一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特征在于所述的轉化體系 中，含有質粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積 比為 0. 01% 0. 05%。
2.根據權利要求1所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 01%。
3.根據權利要求1所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 02%。
4.根據權利要求1所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 03%。
5.根據權利要求1所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 04%。
6.根據權利要求1所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 05%。
7.根據權利要求1至6中任一項的所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體 系，其特征在于所述的質粒DNA溶液中的質粒帶有植物除草劑篩選標記基因Bar。
8.根據權利要求7所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，其特 征在于所述的質粒為 pBPC-Zmptil-kir、pBPC-P5CS-FU9A、PBI121-bar-TPSl、 PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。
9.一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化方法，其特征在于提高玉米轉基因效 率的花粉管通道轉化體系轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0. 05% ；所述的轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的 轉化體系滴在切口凹陷處。
10.根據權利要求9所述的提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化方法，其特征在于 所述的玉米為玉米自交系178、501、517，] 017、07-2、吉444、京24。
全文摘要
一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法，該轉化體系中，含有質粒DNA溶液和SilwetL-77；所述的SilwetL-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0.01%～0.05%；該轉化方法為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。本發明在質粒DNA溶液中添加表面活性劑SilwetL-77，改善含質粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA溶液在玉米花絲或柱頭上的潤濕、粘附與滲透，增加玉米花粉管對DNA的吸收率，從而提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率；本發明因為是直接將含有目的DNA的質粒DNA溶液直接轉入玉米中，不依賴于玉米的組培再生體系，所以操作簡便，無需昂貴儀器，生產成本低廉；本發明不受玉米自交系品種和轉化基因種類的限制，適用范圍廣泛。
文檔編號A01H5/00GK102031273SQ20101026356
公開日2011年4月27日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者吳忠義, 張秀海, 李春華, 梁宏霞, 程曦, 羅昌, 黃叢林 申請人:北京農業生物技術研究中心