專利名稱：中砧1號組織培養的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養領域，特別涉及中砧1號組織培養的方法。
背景技術：
蘋果是世界上列柑橘、香蕉、葡萄之后的第四大水果，也是我國栽培面積最大、產 量最多的水果。我國蘋果生產具有悠久的栽培歷史，有較豐富的管理經驗，已形成了種苗繁 育、生產栽培、采后加工儲藏和深加工的產業鏈。但從總體來講，目前我國的蘋果生產和發 達國家相比，樹種品種結構不合理，大多數還存在經營粗放、栽培管理水平不高、果品質量 較差、效益不高的現象。要轉變這種廣種薄收、高投入低產出的現狀，加強對現有低產園的 改造，提高單產和果品品質，矮化密植是主要的發展趨勢，選用矮化砧木是實現矮化密植栽 培的前提與途徑(朱樹華，郁松林，權俊萍，石河子大學學報(自然科學版)，2003 (4))。我國育成的蘋果矮化砧木，在正常條件下扦插壓條都不易發根，無性繁殖困難，只 能采用中間砧方式利用。而實生砧苗壓條繁殖雖容易生根，可進行營養繁殖，擴大繁殖系 數，但是基礎材料不足限制推廣速度。小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)是蘋果屬的四倍體(2n = 4x = 68)野生種質資源，作蘋果砧木利用，其綜合性狀優良，是很有希望的蘋果半矮化砧木(成 明昊，楊曉紅，曾繼光，1984，西南農學院學報，3 :38 43)。中砧1號是中國農業大學歷時 25年從中選出的耐缺鐵優良種質，具有耐鹽堿、耐熱、耐旱、耐澇、抗寒(_45°C )、抗白粉病、 固地性好等特性，對潛隱病毒也有較強的抗性，嫁接紅富士、紅星、金冠、國光、北斗、王林等 蘋果品種也表現嫁接親和性好。去雄套袋后花朵坐果率為86. 7%，具有無融合生殖特性，實 生苗整齊一致，也可用實生苗壓條擴大繁殖系數。但中砧1號果實出種率很低，平均每果飽 滿種子數僅0. 9粒，約需200斤果實出一斤種子，所以實生繁殖遠遠不能滿足生產要求。組織培養作為生物工程的一項重要技術，近年來已在生物科學領域獲得了長足發展， 尤其是園藝植物的應用上取得了豐碩成果。據不完全統計，目前通過組織培養繁殖的果樹包括多 個科的多個種，外植體類型從莖尖、葉片、花藥、胚乳、葉肉原生質體等均再生出植株，其中以莖尖 培養的研究較多、進展快，在一些果樹種類上已進入實用階段(張慶田，山東農業大學，2007)。木本植物組培苗生根普遍困難，關于這一問題的解釋已趨向一致除了基因型的 差別外，年齡時期起了主要作用。在排除了基因型和年齡時期對生根的影響外，外源生長素 對組培苗生根的誘導作用得到了廣泛的認可；而且在生長素完成了誘導作用后，它們在培 養基中的存在對新根的發生有抑制作用。中砧1號屬于木本植物，其在組織培養是發生褐變的問題很嚴重，隨著苗齡增大 褐變程度也有所增加，從而給這一類植物的組織培養快速繁殖帶來了很大的困難。目前尚未有對中砧1號建立高效組培快繁技術體系。
發明內容
本發明目的在于提供一種生產中砧1號再生苗的方法。
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本發明提供生產中砧1號再生苗的方法是將中砧1號種子經無菌預培養，得到無 菌苗，然后將所述無菌苗的莖尖進行初代培養，得到再生苗。上述無菌預培養是所述中砧1號種子接種到預培養的培養基中培養；所述預培養 的培養基是在水中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養基；所述凝膠劑是瓊脂或卡拉膠，優選是瓊脂，所述瓊脂在所述預培養的培養基中的 終濃度優選是7g/L ；所述碳源是蔗糖或麥芽糖，優選是蔗糖，所述蔗糖在所述預培養的培 養基中的終濃度優選是30g/L。上述初代培養是將所述無菌苗的莖尖接種到初代培養基上培養，所述初代培養基 是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；其中所述6-BA的 終濃度為0. 5-2. 0mg/L,NAA的終濃度為0. 01-0. 10mg/L ；所述6-BA的終濃度優選為1. Omg/ L ；NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。表1. MS基本培養液的溶質(mg/L)
CuS04-5H20L ‘ ■ 0.025有機物肌醇100鹽酸硫胺素VBl0.4鹽酸吡哆醇VB60.5煙酸0.5甘氨酸2鐵鹽乙二胺四乙酸鈉鐵421.1
上述初代培養基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優選是瓊脂；所述凝膠劑 在所述初代培養基中的終濃度是7g/L ；上述初代培養基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖；所述碳源在所述 初代培養基中的終濃度是30g/L。本發明的另一目的在于提供一種生產中砧1號再生植株的方法。本發明提供的生產中砧1號再生植株的方法包括以下步驟1)根據任一上述的方法制備得到再生苗；2)將步驟1)中得到再生苗進行生根培養，得到完整的再生植株。步驟2)中，所述生根培養包括以下步驟將所述再生苗在生根培養基中培養；所 述生根培養基是在1/2MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基IBA、碳源和凝膠 劑；所述生根培養基中IBA的終濃度是0. 01-2. 00mg/L，優選是0. 50mg/L ；所述1/2MS基本 培養液的溶劑是水、溶質是將表1所示的溶質中的大量元素減半，微量元素、有機物和鐵鹽 濃度不變得到的溶質。上述生根培養基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優選是瓊脂；所述凝膠劑 在所述生根培養基中的終濃度是7g/L ；所述生根培養基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖；所述碳源在所述 生根培養基中的終濃度是30g/L。上述生根培養的步驟中，所述再生苗在進入生根培養基之前還經過預生根的步 驟；所述預生根是將所述再生苗置于預生根培養基中進行；所述預生根培養基是在MS基本 培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；所述預生根培養基，所述6-BA 的終濃度為0. 25mg/L, NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如 表1所示。進一步，上述方法還包括步驟1)和步驟2)之間的繼代培養，所述繼代培養是將步 驟1)得到的再生苗轉接到擴繁培養基中培養，得到增殖的再生苗；所述擴繁培養基是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體 培養基；其中6-BA的終濃度為0. 05-1. 00mg/L,NAA的終濃度為0. 05-1. OOmg/1 ；所述6-BA 的終濃度優選是0. 5mg/L, NAA的終濃度優選是0. 5mg/L ；所述MS基本培養液的溶劑是水、 溶質如表1所示。上述預生根培養基和擴繁培養基中，所述凝膠劑均是瓊脂、卡拉膠或Gelrited^ 優選是瓊脂；所述凝膠劑在預生根培養基和擴繁培養基中的終濃度均是7g/L ；上述預生根培養基和擴繁培養基的碳源均是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，均優選為蔗 糖；所述碳源在所述預生根培養基和擴繁培養基中的終濃度均是30g/L。實驗證明在生產中砧1號再生苗之前先經過預培養的話，預培養苗的莖尖分化 率達87. 77%，并且初代接種6-7天后，即啟動開始生長，特別是帶子葉的莖尖，啟動生長更 快(約5天)；而普通營養土培養小苗的莖尖的分化率僅為21. 07%，并且生長在營養土上 的中砧1號的莖尖，接種后，啟動很慢。將再生苗進行生根之前優選是先經過預生根培養， 經生根預培養后，分化新梢數減少，節間伸長，葉片伸展，葉色變深，葉面積明顯大于未經生 根預培養苗；其株高、莖粗度、生根率、平均單株數和單株長度皆顯著地大于未經生根預培 養苗(表5)。
本發明以種子為外植體材料，以無菌苗進行預培養的方式，保證了優良性狀的遺 傳穩定性；本發明還完善了殺菌處理方法；同時篩選出了適合防褐化物質和激素種類，及 各物質的濃度，解決了目前研究中存在的污染和褐化問題，成功建立了中砧1號的無菌培 養體系。
圖1為本發明實施例1中砧1號在擴繁培養基中的生長情況。圖2為本發明實施例1中砧1號的生根情況。圖3為本發明實施例1移栽的中砧1號再生植株。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中6-卞氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)均購自亞太恒信生物科技(北 京)有限公司。升汞購自上海開通化工有限公司。瓊脂、蔗糖、封口膜、75%乙醇、硝酸銨、硝酸鈣、硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸 鎂、鉬酸鈉、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、乙二胺四乙酸鈉鐵、甘氨酸、肌醇、Ph試紙、鹽酸 硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素均購自北京廣達恒益科技有限公司。實施例1、制備中砧1號再生植株及其觀察統計與分析1、外植體的獲得1)預培養得到預培養苗將中砧1號(該材料已經于2009年12月30.日由北京市林木品種審定委員會 審定為林木良種，良種編號為京S-SV-MX-015-2009，此信息可從2010年1月16日發布的 《2009年北京市林木品種審定公告》上查詢，公眾可從中國農業大學獲得)的種子進行層積 處理，待種子開始發芽至胚根長到2cm以上時，將其小心地插入預培養培養基中，放入光照 培養箱中，溫度控制在23°C，光照強度為2000-2500LX，光周期(光照/黑暗)16h/8h條件 下培養，待種皮脫掉后得到預培養苗。上述預培養培養基是在水中添加蔗糖和瓊脂得到的固體培養基，瓊脂在培養基中 的終濃度為7g/L。蔗糖在培養基中的終濃度為30g/L。2)非預培養獲得外植體將中砧1號的種子進行層積處理，待種子開始發芽，將其播種于營養土中，出土生 長為小苗。2、外植體的預處理1)預培養苗的預處理將上述步驟1中步驟1)得到的預培養苗的莖尖(包括帶子葉的莖尖)切下，在超 凈工作臺上消毒，即用質量濃度為0. 的HgCl2滅菌5分鐘后，再用無菌水沖洗3遍。2)非預培養(營養土培養)的外植體的預處理切取上述步驟1中步驟2)得到的小苗的莖尖(可帶子葉)用蒸餾水沖去泥土，在超凈工作臺上分別用以下①_⑦的消毒方案進行消毒(設7個處理，每個處理16-37個莖 尖)，再用無菌水沖洗干凈。消毒方案為①先用2%新潔爾滅消毒2分鐘，再用1 1的過氧乙酸水溶液消毒5分鐘，無菌 水洗3遍；②先用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 1 %的HgCl2消毒5分鐘，無菌水洗3遍；③先用75%酒精消毒2分鐘，再用0. 的HgCl2消毒5分鐘，不用無菌水沖洗；④先用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 01 %的HgCl2消毒8分鐘，無菌水洗3遍；⑤先用2%新潔爾滅消毒10分鐘，再用漂白粉飽和液浸泡20分鐘，無菌水沖洗3 遍；⑥先用洗衣粉液浸泡5分鐘，再用75%酒精消毒1分鐘，然后用漂白粉飽和液浸泡 20分鐘，無菌水沖洗3遍；⑦先用洗衣粉液浸泡5分鐘，再用75%酒精消毒1分鐘，然后0. 的HgCl2消毒 5分鐘，無菌水洗3遍。3)實驗結果統計培養3、10、17天后，分別統計預培養苗的莖尖和營養土培養的小苗的莖尖的污染 情況，實驗重復3次，經步驟1)預培養苗的莖尖污染率為0%。經步驟2)非預培養(營養 土培養)小苗的污染率實驗結果如表2所示。表2、營養土培養苗的莖尖的芽污染情況(重復三次)
處理3天后污染率(％) 10天后污染率(％) 17天后污染率(％)
①5515
②1139.539.5
③51010
④055 181818
⑥696969
⑦033從上面結果看，處理③、④、⑦污染率較低，處理①、⑤其次，處理⑥污染率最高，說 明在本培養試材的消毒中，HgCl2殺菌效果最好，以下的實驗涉及營養土培養的小苗都是采 用第⑦種方法處理的。3、初代培養得到再生苗及觀察統計與分析1)獲得再生苗分別將上述步驟2中預處理過的預培養苗的莖尖和營養土培養的小苗的莖尖接 種于初代培養基上，在溫度為23士2°C，相對濕度為50-60%、光強為2000-2500LX，每天光 照為10小時的條件下，培養6-7天后，莖尖開始生長，培養至30天，得到再生苗。上述初代培養基是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體
8培養基；其中6-BA的終濃度為1. Omg/L, NAA的終濃度為0. 05mg/L，碳源為蔗糖，蔗糖的終 濃度為30g/L，凝膠劑是瓊脂，瓊脂的終濃度為7g/L ；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1 所示，培養基的PH為5. 8。2)觀察統計與分析I、觀察統計培養15天后，分別統計預培養苗的莖尖和營養土培養的小苗的莖尖的芽分化情 況，實驗重復3次，實驗結果如表3和表4所示預培養苗的莖尖分化率為87. 77%,營養土 培養小苗的莖尖的分化率為21. 07%。表3、預培養苗的莖尖的芽分化情況(重復三次) 表4、營養土培養小苗的莖尖的芽分化情況(J■復三次)
II、分析對上述步驟3的步驟1)中的試驗進行觀察分析①取自無菌苗預培養方式(即預培養苗)的莖尖，接種后未發生褐變問題，這類似 于快速增殖階段繼代培養時的材料，對機械傷害不發生褐變反應。取營養土培養小苗的莖尖，接種后會發生褐變，且隨著苗齡增大褐變程度有所增 加。②取自無菌苗預培養方式(即預培養苗)的莖尖，初代接種6-7天后，即啟動開始 生長，特別是帶子葉的莖尖，啟動生長更快(約5天)，這種特點類似于快速增殖階段的繼代 培養，接種后很快開始生長。生長在營養土上的中砧1號的莖尖，接種后，啟動很慢，以至于后面培養成功的再 生植株沒有一株是來自于這種方式的。③上述步驟3的步驟1)中預培養苗消毒后污染率為0%。營養土培養小苗的莖尖消毒后采用第7種方法污染率為3%。由此可以分析得知預培養方法使植物材料一定程度上適應了試管內的環境，從 而能夠繼續生長。4、繼代培養
將步驟2中步驟1)得到的再生苗轉接到擴繁培養基上，在溫度為23士2°C，相對濕 度為50-60%、光強為2000-2500LX，每天光照為10小時的條件下培養，每25天繼代一次， 得到數量增殖的再生苗(如圖1所示)。上述繼代培養的次數可根據所需再生苗的數量決定。上述擴繁培養基是在是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的 固體培養基；其中，碳源為蔗糖，蔗糖的終濃度為30g/L，凝膠劑是瓊脂，瓊脂的終濃度為 7g/L，6-BA的終濃度為0. 5mg/L,NAA的終濃度為0. 5mg/L，MS基本培養液的溶劑是水、溶質 如表1所示，培養基的PH為5. 8。5、生根培養及統計觀察1)預生根培養將上述步驟4中得到的再生苗接種到預生根培養基中培養，培養條件溫度為 23士2°C，相對濕度為50-60%、光強為2000-2500LX，每天光照為10小時。所述預生根培養 基是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；所述預生根培養 基，所述6-BA的終濃度為0. 25mg/L, NAA的終濃度為0. 05mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，瓊 脂的終濃度為7g/L ；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。2)生根培養獲得再生植株將上述步驟4得到的再生苗以及步驟5的1)預培養得到的苗接種到生根培養基 中，在溫度為23士2°C，相對濕度為50-60%，光強為2000-2500LX，每天光照為10小時條件 下，培養30天，得到中砧1號再生植株(如圖2所示)。上述生根培養基是在1/2MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基IBA、 碳源和凝膠劑；其中IBA的終濃度是0. 50mg/L，碳源為蔗糖，蔗糖的終濃度為30g/L，凝膠劑 是瓊脂，瓊脂的終濃度為7g/L ；所述1/2MS基本培養液的溶劑是水、溶質是將表1所示的溶 質中的大量元素減半以后得到的溶質。培養基的PH為5. 8。統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述經過步驟1)預生根后的步驟2)中生根培養的生根 情況，并以未進行上述步驟1)預生根直接進行步驟2)的生根培養為對照。實驗結果見下 表5。表5生根預培養與否對不定根發生的影響 注**表示在0.01水平下差異極顯著。觀察中砧1號試管苗在快速增值階段，分化新梢數增多，新梢生長緩苗。這種試 管苗經生根預培養后，分化新梢數減少，節間伸長，葉片伸展，葉色變深，葉面積明顯大于未 經生根預培養苗；其株高、莖粗度、生根率、平均單株數和單株長度皆顯著地大于未經生根 預培養苗。由此可以看出，培育優質健壯的試管苗可以顯著提高生根率。木本植物組培苗生根普遍困難，關于這一問題的解釋已趨向一致除了基因型的 差別外，年齡時期起了主要作用，處于成年期狀態的組培苗生根困難，而處于幼年期狀態的 和經過多代培養從成年期狀態回轉到童年期狀態的組培苗，生根要容易得多。在排除了基 因型和年齡時期對生根的影響外，外源生長素對組培苗生根的誘導作用得到了廣泛的認 可；而且在生長素完成了誘導作用后，它們在培養基中的存在對新根的發生有抑制作用。含 低濃度生長素的培養基中生根，效果明顯優于含有高濃度生長素的培養基。6、煉苗移栽將步驟5中得到的生根良好的再生植株進行煉苗，移栽到添加蛭石加草炭土(蛭 石與草炭土的比例為1 1)的基質中(如圖3所示)，成活率最高，可達93.3%，并且移栽 后組培養緩苗時間短，地上部開始生長早，根系發育良好。
權利要求
一種生產中砧1號再生苗的方法，是將中砧1號種子經無菌預培養，得到無菌苗，然后將所述無菌苗的莖尖進行初代培養，得到再生苗。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述無菌預培養是所述中砧1號種子接種 到預培養的培養基中培養；所述預培養的培養基是在水中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養基；所述凝膠劑是瓊脂或卡拉膠，優選是瓊脂，所述瓊脂在所述預培養的培養基中的終濃 度優選是7g/L ；所述碳源是蔗糖或麥芽糖，優選是蔗糖，所述蔗糖在所述預培養的培養基 中的終濃度優選是30g/L。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述初代培養是將所述無菌苗的莖 尖接種到初代培養基上培養，所述初代培養基是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源 和凝膠劑得到的固體培養基；其中所述6-BA的終濃度為0. 5-2. Omg/L, NAA的終濃度為 0. 01-0. 1 Omg/L ；所述6-BA的終濃度優選為1. Omg/L ；NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所述MS基 本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述初代培養基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠 或Gelrite，優選是瓊脂；所述凝膠劑在所述初代培養基中的終濃度是7g/L ；所述初代培養基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖；所述碳源在所述初代 培養基中的終濃度是30g/L。
5.一種生產中砧1號再生植株的方法，包括以下步驟1)根據權利要求1-4中任一所述的方法制備得到再生苗；2)將步驟1)中得到再生苗進行生根培養，得到完整的再生植株。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述生根培養包括以下步驟將 所述再生苗在生根培養基中培養；所述生根培養基是在1/2MS基本培養液中添加如下物質 得到的固體培養基IBA、碳源和凝膠劑；所述生根培養基中IBA的終濃度是0. 01-2. OOmg/ L，優選是0. 50mg/L ；所述V2MS基本培養液的溶劑是水、溶質是將表1所示的溶質中的大 量元素減半，微量元素、有機物和鐵鹽濃度不變得到的溶質。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述生根培養基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠 或Gelrite，優選是瓊脂；所述凝膠劑在所述生根培養基中的終濃度是7g/L ；所述生根培養基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖；所述碳源在所述生根 培養基中的終濃度是30g/L。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述生根培養的步驟中，所述再生苗在 進入生根培養基之前還經過預生根的步驟；所述預生根是將所述再生苗置于預生根培養基 中進行；所述預生根培養基是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體 培養基；所述預生根培養基，所述6-BA的終濃度為0. 25mg/L,NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所 述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。
9.根據權利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟1)和步驟 2)之間的繼代培養，所述繼代培養是將步驟1)得到的再生苗轉接到擴繁培養基中培養，得 到增殖的再生苗；所述擴繁培養基是在MS基本培養液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體培養 基；其中6-BA的終濃度為0. 05-1. 00mg/L,NAA的終濃度為0. 05-1. 00mg/l ；所述6-BA的終濃度優選是0. 5mg/L, NAA的終濃度優選是0. 5mg/L ；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質 如表1所示。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述預生根培養基和擴繁培養基中， 所述凝膠劑均是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，均優選是瓊脂；所述凝膠劑在預生根培養基和擴 繁培養基中的終濃度均是7g/L ；所述預生根培養基和擴繁培養基的碳源均是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，均優選為蔗糖；所 述碳源在所述預生根培養基和擴繁培養基中的終濃度均是30g/L。
全文摘要
本發明公開了一種中砧1號組織培養的方法。該方法是將中砧1號種子經無菌預培養，得到無菌苗，然后將所述無菌苗的莖尖進行初代培養，得到再生苗。實驗證明在生產中砧1號再生苗之前先經過預培養的話，預培養苗的莖尖分化率達87.77％；而普通營養土培養小苗的莖尖的分化率僅為21.07％。本發明以種子為外植體材料，以無菌苗進行預培養的方式，保證了優良性狀的遺傳穩定性；本發明還完善了殺菌處理方法；同時篩選出了適合防褐化物質和激素種類，及各物質的濃度，解決了目前研究中存在的污染和褐化問題，成功建立了中砧1號的無菌培養體系。
文檔編號A01H4/00GK101926287SQ20101027379
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月6日 優先權日2010年9月6日
發明者孫揚吾, 張新忠, 沈雋, 王憶, 許雪峰, 韓振海 申請人:中國農業大學