專利名稱：紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法
技術領域：
本發明公開了一種利用紋枯菌毒素開展水稻抗紋枯病育種的方法，屬于水稻抗病 育種技術領域。
背景技術：
紋枯病菌在人工培養和侵染過程中均會產生多種對寄主有毒的物質，人們將其統 稱為毒素。由于技術手段的局限性，長期以來，一直未有學者獲得紋枯菌毒素純品，因此，關 于紋枯菌毒素的成分是什么，至今未有定論。實際研究中采用的毒素均是粗毒素(以下統稱 為毒素)，為非純品，可能包含一些培養基成分和/或病原菌分泌的對寄主無毒的物質。少數研究結果預示，毒素可應用于品種的抗病選育。然而，關于具體應用方法，未 見報道。本專利主要介紹如何將紋枯病菌毒素應用于水稻抗紋枯病育種中，涉及的背景技 術有以下3個方面
1、毒素提取方法。不同毒素提取方法間的差異主要體現在2個方面，一是提取前的病 原菌培養液不同，常用培養液有改良Richard培養液、Czapek培養液和馬鈴薯蔗糖培養液。 徐敬友等(2004)研究表明，病菌在改良Richard培養液中產毒能力強于另2種培養液，且 發現在25-30°C條件下培養15天的毒素活性最高，培養過程中需要每隔12小時搖晃一次。 二是提取方法不同，常用方法有活性炭吸附法、酸度調節萃取法、活性炭吸附萃取法、乙醚 萃取法。不同方法間的差異致使獲得的毒素活性或量上存在較大差異，比較顯示，乙醚萃取 法獲得的毒素活性最強(孟令軍等，2009 )。總體而言，以上提取方法均是植物病理學專家欲分離純毒素或分析毒素成分而提 出的方法，提取過程中均包含一定的純化環節，即去除對寄主無毒的物質。然而，就水稻抗 病育種應用而言，在保持同樣產毒量或活性基礎上，這些方法可簡化，使其更方便快捷、經 濟實惠。2、水稻抗毒素測定方法。已報道的水稻抗毒素測定方法有3種，即胚根抑制法、幼 苗致萎法和針刺接種法。研究表明，采毒素處理破胸露白的水稻種子，可抑制種子胚根胚芽 生長，尤其對胚根生長抑制作用最明顯，處理3葉期水稻幼苗時，可致幼苗萎蔫死亡；通過 針刺法將毒素接種于水稻葉片、葉鞘上，可誘發相似于紋枯病的典型癥狀。通過胚根抑制法 和針刺接種法，少數研究還發現，一些抗病品種對毒素的忍耐性總體強于感病品種，抗感毒 素水平與其抗感紋枯病水平間存在一定正相關性。因此，一些學者推測認為，水稻對紋枯菌 毒素的忍耐水平可用作水稻抗病品種的一個篩選標準。然而，我們研究發現，毒素濃度過高過低均不能有效揭示抗感品種間的抗毒素差 異，濃度過高可導致所有測定品種的胚根生長受抑制、幼苗萎蔫致死，受害癥狀相同，抗感 差異無法顯示。同樣，濃度過低則不產生抑制或致萎效果，也無法顯示抗感差異。因此，在 水稻抗病育種中，一定要采用合適的毒素濃度才能選育到較抗品系(種)，但是至目前，還未 見到用于水稻抗紋枯病品種選育的合適的毒素濃度的確定方法。3、水稻紋枯病抗性鑒定方法。在水稻抗紋枯病遺傳和育種研究領域中，已報道的
3水稻紋枯病抗性鑒定方法主要有捆扎法、撒施法、嵌入法、注射法(潘學彪等，1997)和苗期 鑒定法。除了苗期鑒定法在溫室中進行以外，其他方法均在大田進行。田間鑒定的環境不 可控，耗時費力，效率低，通常一年只能鑒定一次，每次鑒定耗時也都在2個月以上。苗期溫 室接種方法雖然將鑒定周期縮短至1個月左右，且減少了環境影響因素，但是對苗齡大小 或植株高矮等要求較高，增加了試驗難度。總體而言，所有這些方法在大規模抗病育種中， 都顯得低效、耗時、費力，尤其在低世代分離群體中，缺乏可操作性。
發明內容
本發明為了解決現有技術的不足，提供了一種紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種 中的應用方法，該方法簡便快捷，尤其適合在低世代分離群體中應用。本發明所采用的技術方案是一種紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方 法，包括以下步驟
(1)用水稻葉片和純凈水的無菌混合物為培養基培養紋枯菌并提取分泌的毒素；
(2)以紋枯病抗病品種YSBRl、感病品種Lemont為標準品種，將上述(1)中的毒素配成 不同濃度梯度對標準品種種子進行胚根抑制法處理，取標準抗病品種YSBRl的胚根抑制率 在45-60%之間同時標準感病品種Lemont的胚根抑制率在85%以上時的毒素濃度為最佳毒 素濃度；
(3)采用最佳濃度的毒素通過胚根抑制法進行育種篩選，淘汰胚根生長明顯受抑制的 品種或個體。上述步驟(1)中的培養基優選每IOOml純凈水中3_4g水稻葉片的無菌混合物。上述步驟(1)分泌的毒素通過以下方法提取過濾培養液，-20°C冷凍過夜；4°C解 凍；冷凍離心機4°C，4，OOOg離心lOmin，取上清液；50°C真空旋轉蒸發上清液為原體積的 1/10，即為毒素粗提液。在胚根抑制法中，由于毒素存在，水稻種子的胚根生長會受到抑制，即生長很慢或 不生長；而在無毒素存在下，種子胚根生長正常，即在開始生長后的72小時內，正常種子的 胚根生長長度均在2. 5-4. 5cm范圍內；當用合適濃度的毒素處理種子72小時后，感病品種 種子的胚根生長長度小于0. 5cm,即胚根生長受到了明顯抑制。本發明具有以下優點
(1)與傳統水稻抗紋枯病接種鑒定方法相比，本專利公開的方法具有鑒定效率高、影響因 素少等優點，尤其是在播種前即可淘汰多數感病個體，大大減輕后續抗病性鑒定的工作量。(2)與改良的Richand紋枯病菌培養液相比，本專利公開的方法中采用的培養液 配制方法簡單、經濟實惠，在毒素產量或活性上相差不明顯。(3)與已報道的一些毒素提取方法相比，本專利公開的方法中涉及到的毒素提取 方法更簡便快捷，在毒素產量或活性上與乙醚萃取方法相近。(4)本專利公開的方法中涉及到用于抗病育種的適宜毒素濃度的確定方法，在抗 紋枯病育種中，此前未見具有同等性質的研究報道。
圖1是YSBRl品種在不同濃度毒素處理后72小時的種子胚根胚芽伸長情況；其中，91SP是YSBRl品種實驗室中的簡稱；左至右依次為5倍和3倍毒素處理及清水對照。圖2是Lemont品種在不同濃度毒素處理后72小時的種子胚根胚芽伸長情況；左 至右依次為5倍和3倍毒素處理及清水對照。圖3是特青品種在不同濃度毒素處理后72小時的種子胚根胚芽伸長情況；左至右 依次為5倍和3倍毒素處理及清水對照。圖4是2個標準品種在不同濃度梯度毒素處理后的胚根抑制率曲線圖(垂直線為 標準誤)。
具體實施例方式對于本領域技術人員可以理解，本發明中所說的紋枯病菌是指引起水稻紋枯病 (英文名rice sheath blight)的病原真菌，其學名為立枯絲核菌(英文學名為脅辦 如/？化 solani Kuhn ；下述實施例中所使用的具體菌株是強致病菌株RH-9，由江蘇省農業科學院植 物保護研究所陳志誼研究員于1996年采集。實施例中具體菌株僅用于對本發明方法的詳 細說明，不構成對本發明保護范圍的限制。本實施例中所涉及的水稻品種是已公開的品種，公眾可從公開渠道獲得。如 YSBRl (左示敏等，作物學報，2009)來源于申請人，目前已向國內相關育種單位公開，
承諾自申請日起向公眾提供20年。Tetep 為印度傳統的高桿地方水稻品種。Lemont 為美國路易斯安那州商業化水稻品種。Jasmine85 為美國商業化水稻品種。明恢63，特青，揚稻4號，窄葉青8號，中花11號和武育梗3號均是國內商業化品 種。1)確定用于抗病育種中大規模鑒定的抗毒素測定方法
對已有的3種抗毒素測定方法進行試驗比較，在鑒定效率、重復性以及簡便性等方面 進行比較，確定適用于抗病育種的抗毒素測定方法。采用公開的Richand培養液和乙醚萃取法提取獲得紋枯菌粗毒素，將粗提液稀釋 1/10的毒素濃度定義為Ix (1倍)，分別采用胚根抑制法、幼苗致萎法和針刺接種法3種抗 毒素測定方法和9種濃度的毒素(l/2x, lx, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 8x, IOx)測定高抗、中抗和高 感紋枯病水稻品種(系)YSBR1、特青和Lemont的抗毒素表型，分析不同方法識別抗感差異的 能力及在鑒定效率、精度和便利性上的差異，以此確定最適用于抗病育種的抗毒素測定方 法。胚根抑制法操作流程用10%(v/v)84消毒液對水稻種子表面消毒一分半鐘，后用 無菌水在30°C下浸種催芽48小時；然后將毒素處理的種子放置鋪有兩層濾紙含10 ml紋 枯菌粗毒素液的培養皿中，每皿20-30粒種子，30°C下黑暗培養60小時；重復三次，以空白 培養液為對照，測量胚根長度。幼苗致萎法操作流程3葉期稻苗，洗凈根部，以無菌水處理后移入盛有立枯絲核 菌粗毒素液的試管中，以空白培養液為對照；置于28-30°C自然光照下，觀察幼苗發生萎蔫 的時間。針刺接種法操作流程取5葉期水稻植株，針刺葉片造成傷口，然后將浸有立枯絲
5核菌粗毒素的脫脂棉覆蓋在傷口上，置于28-30°C下，12小時后觀察葉片的病變情況。按照以上技術方案，發現采用胚根抑制法可在播種前完成抗毒素鑒定試驗，鑒定 周期為7天，鑒定過程中的環境可控，結果重演性高，效率高，鑒定后的種子可繼續播種；幼 苗致萎法在幼苗期進行試驗，從播種至鑒定結束所需時間15-20天；針刺接種法通常針對5 葉期植株接種，鑒定周期在20-25天。胚根抑制法是通過測定胚根生長受抑制率來顯示品種間的抗感毒素差異，表型值 可直接用直尺測量，結果精確；而另外兩種方法的表型值測定中均是通過肉眼進行的，以主 觀標準評定抗感差異，準確性低于胚根抑制法；在抗感差異的識別能力上，胚根抑制法高于 另兩種方法，需要的毒素量也少于另兩種方法。水稻抗病育種中需要鑒定的種質規模通常較大，因此，在綜合考慮鑒定效率、鑒定 精確度和毒素需要量等方面后，認為胚根抑制法最適用于抗病育種。2)紋枯菌培養液的配方改進
以不同克數的(1、2、3、4、5克)剪碎的感病水稻葉片和IOOml純凈水的無菌混合物為紋 枯病菌培養液，同時設置改良Richand培養液、未接菌混合液以及清水對照，各培養液接菌 后分別在28°C暗培養條件下培養10、15、20天，后續比較不同方法間及試驗設置間的毒素 活性差異，探討簡單的葉片_純凈水混合培養液培養紋枯菌并提取到較高活性的毒素的可 行性。通過以上技術方案的試驗對比，發現以IOOml純凈水和3至4g水稻葉片的無菌混 合物最適宜紋枯病菌培養和產毒，所得毒素的量和活性高于IOOml純凈水中帶有1至2克 和5克以上的水稻葉片的培養液。改良Richand培養液的紋枯菌產毒量或產毒活性僅略高于IOOml純凈水和3至4g 的無菌培養液的產毒量，但前者在培養液的配制和耗費上分別復雜和高于后者。3)簡化毒素提取方法
簡化毒素提取方法，如去除一些有機物的抽提步驟，分析簡便方法提取的毒素量或活 性與對照乙醚萃取法間的差異，確定簡便方法的可行性。乙醚萃取法的操作流程為過濾培養液，60度真空旋轉蒸發為原體積的1/5得到 濃縮液；加等體積甲醇離心，取上清液；40度旋轉蒸發去甲醇，取水相；加等體積乙醚萃取， 保存有機相，取水相再加等體積乙醚萃取，分別得到有機相和水相；保存有機相，取水相再 加等體積乙醚萃取，再次保存有機相；將三次保存的不同的有機相混合，旋轉蒸發至水相呈 焦油狀，加無菌水定量(以每50ml培養液Iml水為標準)，即得毒素粗提液(以下簡稱毒素)。簡便毒素提取法的操作流程過濾培養液，-20°C冷凍過夜；4°C解凍；冷凍離心機 44, OOOg離心lOmin，取上清液；50°C真空旋轉蒸發上清液為原體積的1/10，即為毒素粗 提液。利用簡化的毒素提取方法和乙醚萃取法分別提取相同培養液的培養產物，利用提 取的毒素測定標準品種的抗毒素能力，結果顯示，在利用簡化得到毒素提取方法時使用于 抗病育種的最佳毒素濃度為4x，而在乙醚萃取法中則為3x，這表明簡化的毒素提取方法獲 得產毒活性僅略低于乙醚萃取法，但是，簡化的毒素提取方法操作簡單、快捷。因此，比較而 言，簡化的毒素提取方法在抗病育種中更為適用。4)抗紋枯病育種中適宜毒素濃度的確定方法用于測定毒素相對濃度的標準品種的確定。選用水稻種質資源中最抗和最感紋枯病的 代表性水稻品種(系)作為測定毒素濃度(活性)的標準品種，采用其他品種的抗病性覆蓋度 一般不夠。通過大批種質資源的抗病性測定，本方法確定YSBRl可作為最抗水稻紋枯病的 代表性品種(系)，Lemont為最感水稻紋枯病的代表性品種，故將這2個品種設定為測定毒 素相對濃度的標準品種。利用標準品種確定最佳毒素濃度的方法。毒素濃度過高過低均不能有效識別品種 間的抗感差異(圖1-3)。將毒素粗提液稀釋1/10的毒素濃度定義為lx(l倍)，設計l/3x、 l/2x、lx、2x、3x、4x、5x、7x和IOx等9個濃度梯度處理標準品種(圖1_3)，將最抗和最感品 種間的抑制率值差異最大時的毒素濃度確定為最佳濃度。采用最佳濃度的毒素測定9個已 知抗感紋枯病水平的水稻品種，以及2個標準品種間的雜交種F1的自交種子(F2)的抗性水 平，驗證最佳濃度毒素在抗感差異上的鑒別能力和在抗病育種中的應用潛力。確定標準品種對合計418份水稻種質進行大田人工接種鑒定，這些材料來源于 中國農科院水稻核心種質庫、國內外代表性抗感品種和國內近年主推的水稻品種。結果 顯示，YSBRl和Tetep為最抗水稻紋枯病的2個品種，前者為本專利申請者選育的具改良 株型的抗性品系，后者為印度早期傳統高桿品種(>160cm)，育種利用難度大，因此，我們將 YSBRl確定代表抗病品種的標準品種；高感紋枯病水稻品種較多，我們將其中在國內水稻 抗紋枯病研究中普遍采用的品種Lemont確定為標準品種。兩個標準品種間的抗感差異極 顯者ο利用標準品種確定最佳毒素濃度的方法通過上述不同濃度梯度的毒素處理2個 標準品種，結果顯示標準抗感品種間胚根抑制率差異最大可達40% (表1-2，圖4)，因此，本 方法確定對標準抗病品種YSBRl的胚根抑制率在45-60%之間同時標準感病品種Lemont的 胚根抑制率在85%以上時的毒素濃度為最佳毒素濃度。
權利要求
一種紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法，包括以下步驟(1)用水稻葉片和純凈水的無菌混合物為培養基培養紋枯菌并提取分泌毒素；(2)以紋枯病抗病品種YSBR1、感病品種Lemont為標準品種，將上述(1)中的毒素配成不同濃度梯度對標準品種種子進行胚根抑制法處理，取標準抗病品種YSBR1的胚根抑制率在45 60%之間同時標準感病品種Lemont的胚根抑制率在85%以上時的毒素濃度為最佳毒素濃度；(3)采用最佳濃度的毒素通過胚根抑制法進行育種篩選，淘汰胚根生長明顯受抑制的品種或個體。
2.根據權利要求1所述紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法，其特征在 于，步驟(1)中的培養基是每IOOml純凈水中3-4g水稻葉片的無菌混合物。
3.根據權利要求1所述紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法，其特征在 于，步驟(1)分泌的毒素通過以下方法提取過濾培養液，_20°C冷凍過夜；4°C解凍；冷凍離 心機4°C，4，OOOg離心lOmin，取上清液；50°C真空旋轉蒸發上清液為原體積的1/10，即為毒 素粗提液。
全文摘要
本發明涉及紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用，該應用包括以下步驟(1)用水稻葉片和純凈水的無菌混合物為培養基培養紋枯菌并提取分泌毒素；(2)以紋枯病抗病品種YSBR1、感病品種Lemont為標準品種，將提取的毒素配成不同濃度梯度對標準品種種子進行胚根抑制法處理，取標準抗病品種YSBR1的胚根抑制率在45-60%之間同時標準感病品種Lemont的胚根抑制率在85%以上時的毒素濃度為最佳毒素濃度；(3)采用最佳濃度的毒素通過胚根抑制法進行育種篩選，淘汰胚根生長明顯受抑制的品種或個體。本發明鑒定效率高，操作簡單易行，成本低，能快速提升水稻品種的紋枯病抗性水平，降低環境污染，實現農民增收。
文檔編號A01G16/00GK101953281SQ20101029479
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者左示敏, 張亞芳, 徐敬友, 潘學彪, 陳夕軍, 陳宗祥, 顧世梁, 顧芳 申請人:揚州大學