專利名稱：環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法
技術領域：
本發明涉及一種毒性測試方法，具體為環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方 法，屬于魚類急性毒性測試領域。
背景技術：
近三十年來，環境中的外源性化合物——環境雌激素(Environmental estrogens)能夠造成人類和野生動物發育和繁殖方面的健康損害，引起了人們高度重視， 目前已報道的環境雌激素危害包括男性精液減少、野生魚類性發育紊亂(包括雌雄同體、 雄魚雌化等)、兩棲動物(如短吻鱷、蟾蜍)種群減少等。環境雌激素是內分泌干擾物中重要 的一類，它們或者屬于天然雌激素(即由生物體內源雌激素排泄而進入環境)，或者屬于人 工合成雌激素以及具有雌激素活性的合成化學品，當其進入生物體后能模擬體內內源性雌 激素的功能和行為，引發類雌激素反應，從而對生物體的激素平衡、生殖、發育和行為等造 成負面影響。研究證實，目前環境中已經存在成百上千種具有不同雌激素活力的化合物。其 中，幾種常見的環境雌激素及其雌激素活力和來源如表1所示；
*EEq (17 β-E2 Equivalent)換算成17 β -雌二醇的雌激素活力當量。
雌激素活力當量越大，對生物體潛在的內分泌干擾效應就越強，因此，E2和EE2是 兩種最受關注的環境雌激素，它們的化學結構式和理化性質見表2。前者是天然雌激素中雌 激素活力最強的一種，通常被用作值為1的雌激素當量，以衡量其他化合物的雌激素活力。 E2由人或動物分泌而成，主要通過糞便和尿液進入自然環境。據報道，一頭奶牛每天排泄的 糞便中E2含量達17(Γ1230 μ g/kg，成年女性E2的排泄量可達82 695 μ g/天，而懷孕期 間婦女E2的排泄量可達平時的1000倍。后者是人工合成的雌激素，主要作為女性避孕藥 和治療絕經期綜合癥的雌激素替代療法用藥；
權利要求
環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，其特征在于具體步驟如下1)首先稱取1 mg的E2溶于500 ml標準稀釋水中，配制成2 mg/L的E2儲備液，將試劑瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，用同樣的方法配制2 mg/L的EE2儲備液并保存；2)試驗時，取出上述儲備液，待恢復到室溫并充分搖勻后，用標準稀釋水分別于玻璃培養皿內配制濃度為1、0.2、0.04 mg/L，8、1.6 μg/L和10、0.05 mg/L的E2和EE2的暴露溶液，并各移取20 ml放入培養皿中；空白對照為20 ml標準稀釋水，另取經脫脂棉過濾的長江水20 ml作為自然水體環境對照，以上暴露液和對照液均設置3組平行；3)隨機挑選處于囊胚期的活胚胎置于倒置顯微鏡下進行觀察試驗，在每個裝有暴露液和對照液的培養皿內放入10個胚胎，然后將胚胎置于恒溫培養箱內培養，在2 10℃條件下保持恒溫、無光照，試驗持續30天，每天用倒置顯微鏡觀察測試的終點，并記錄；4)使用SPSS 13.0 for Windows軟件，對大銀魚胚胎在暴露濃度下與空白下的存活、生長和發育進行顯著性分析。
2.根據權利要求1所述的環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，其特征在于 所述的標準稀釋水，采用分析純的化學品和全玻璃蒸餾水或去離子水，取氯化鈣溶液、硫酸 鎂溶液、碳酸氫鈉溶液和氯化鈉溶液4種溶液各25 ml加以混合，稀釋至1 L，稀釋用水需經 曝氣至氧飽和為止，然后儲存備用。
3.根據權利要求1所述的環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，其特征在于 所述的氯化鈣溶液是將11. 76 g CaCl2CH2O溶解于1 L水中，所述的硫酸鎂溶液是將4. 93 g MgSO4WH2O溶解于1 L水中，所述的碳酸氫鈉溶液是將2. 59 g NaHCO3溶解于1 L水中， 所述的氯化鈉溶液是將0. 23 g KCl溶解于1 L水中。
4.根據權利要求1所述的環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，其特征在于 步驟2)中各暴露濃度組的配制方法如下取12. 5 ml E2或EE2儲備液于等體積的標準稀 釋水中，配成1 mg/L的E2或EE2暴露液25 ml ；充分混勻后按5倍體積逐級稀釋成200、 40、8和1. 6 μ g/L的暴露液；然后再取125 μ L的1. 6 μ g/L暴露液于19. 875 ml標準稀 釋水中，配成10 mg/L的暴露液；取100 μ L的10 mg/L暴露液于19. 9 ml稀釋水中，配成 0. 05 ng/L的暴露液。
5.根據權利要求1所述的環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，其特征在于 步驟3)中，將胚胎置于恒溫培養箱內培養，在8°C條件下保持恒溫。
6.根據權利要求1所述的環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，其特征在于 步驟3)中，采用半靜態暴露方式，所有暴露液和對照液每2天更換一次；更換溶液時，用吸 管逐一地吸取胚胎轉移至新鮮溶液內，如有死亡胚胎或死亡的幼魚，采用吸管吸取將之移 除；測試的終點包括致死、致畸和孵化延遲。全文摘要
本發明公開了一種環境雌激素對大銀魚胚胎發育毒性測試方法，利用胚胎對環境污染物或者化學物質刺激的敏感性，將大銀魚胚胎暴露于含有受試物的一系列濃度的標準稀釋水溶液中，以半靜態條件進行試驗。試驗從將處于囊胚期的活胚胎暴露于含受試物的水溶液開始，至對照組和暴露組中所有的胚胎孵化完成結束，持續30天左右。毒性終點包括致死、致畸和孵化延遲。通過對暴露組毒性終點的觀察及與對照組的比較，確定該受試物對大銀魚胚胎發育的毒性。研究兩種天然雌激素E2和EE2對大銀魚胚胎-卵黃囊階段的影響，以確定它們對大銀魚胚胎發育毒性的劑量-效應關系，并且評價該魚種暴露在雌激素環境濃度水平下存在的潛在風險。
文檔編號A01K61/00GK101982072SQ201010502878
公開日2011年3月2日 申請日期2010年10月11日 優先權日2010年10月11日
發明者史江紅, 孟耀斌, 張洪渠, 朱江, 朱英, 沈根祥, 王振旗, 王曉丹, 胡雙慶, 趙慶節, 郭春霞, 錢曉雍, 顧海蓉 申請人:上海市環境科學研究院;北京師范大學