專利名稱：microRNA 302在早期胚胎發育中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及畜牧學(動物繁殖)，尤其涉及一種microRNA 302在早期胚胎發育中的應用。
背景技術：
在哺乳動物胚胎發育過程約有30% 70%的胚胎夭折，絕大部分在胚胎發育的早期。特別是在體外培養時，早期胚胎凋亡指數更高。近年來，由于早期胚胎作為細胞形態發生和分化模型的重要性有所增加，以及發育生物學技術的日新月異，早期胚胎階段日益受到重視，研究早期胚胎基因表達及調控，具有重要的理論和實踐意義。microRNA是一類內生的、長度約20- 個核苷酸的小RNA，miRNA基因通常是在核內由RNA聚合酶II (polll)轉錄的，最初產物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre_miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA。RAN-GTP和exportin 5將pre-miRNA輸送到細胞質中。隨后，另一個核酸酶Dicer將其剪切產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA* 雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入沉默復合體(RISC)復合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA 保留在這一復合體中。成熟的miRNA結合到與其互補的mRNA的位點通過堿基配對調控基因表達。而miRNA是近年來才發現的一類小分子RNA，它們構成了多細胞生物中一類更為豐富的基因調控分子，影響許多編碼蛋白的基因的表達，與細胞的生長和分化，胚胎的發育，腫瘤的形成和抑制都有密切的關系。
發明內容
本發明的一個目的是提供物質在制備具有抑制胚胎發育功能的產品中的應用。本發明提供了如下1)-3)中任一所述物質在制備具有抑制胚胎發育功能的產品中的應用DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA 302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 302的編碼基因的重組病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。所述抑制胚胎發育為滯后早期胚胎發育，所述早期胚胎發育為從受精卵發育開始至囊胚形成。所述胚胎為小鼠胚胎；所述產品為藥物。所述含有microRNA 302的編碼基因的重組載體為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體得到表達microRNA 302的重組載體，具體為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體的BglII和HindIII酶切位點間得到的含有microRNA 302的編碼基因的重組載體。本發明的另一個目的是提供一種重組載體。本發明提供的重組載體，為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體的 BglII和HindIII酶切位點間得到的載體。所述的重組載體在制備用于篩選促進胚胎發育功能藥物的模型中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的另一個目的是提供一種抑制胚胎發育功能的產品。本發明提供的產品，其活性成分為如下1)-3)中任一一種DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA 302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 302的編碼基因的重組病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。所述抑制胚胎發育為滯后早期胚胎發育；所述早期胚胎發育為從受精卵發育開始至囊胚形成。所述產品為藥物。所述胚胎為小鼠胚胎。本發明的實驗證明，本發明初步闡明早期胚胎發育的生理機制，在原核期胚胎中顯微注射microRNA 302超表達載體片段，可以觀察到microRNA 302使早期胚胎發育滯后。 本發明的優點為新穎、準確。
圖1為microRNA 302對胚胎發育的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、microRNA 302抑制早期胚胎發育1、microRNA 302超表達載體的構建DmicroRNA 302的獲得提取野生型小鼠(FVB/N小鼠，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心)鼠尾基因組DNA作為模板，以miRNA302F和miRNA302R進行PCR 擴增。引物如下miRNA302F AGCCATAGGGATCCGGTCACTTTACTTTCCTGTGGGmiRNA302R GGCTTCGCAAGCTTGCGAGGAGGTTATACCATTGAG得到719bp的PCR產物，經過測序，結果為序列表中的序列2，其中自5’末端第 251-273位microRNA 302的編碼基因，microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1。
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2)將步驟1)得到的PCR產物連接到TOPO載體上(pcDNA 3. l/V5_His TOPO TAExpression Vector, hvitrogen，貨號45-0005)，得到重組載體T0P0-micro302，經過測序，該重組載體為將序列表中的序列2插入載體上TOPO載體中得到的載體。3)將步驟2)得到的重組載體T0P0-micro302經BamHI和HindIII酶切，回收酶切片段，與經過同樣酶切得到的pmR-mCherry載體(Clontech，貨號632M2)連接，得到的連接產物轉化大腸桿菌，得到轉化子，菌落PCR鑒定陽性克隆，PCR引物為forward :5’ CAC CAT CGT GGA ACA GTA CG 3，；Reverse :5，GGG AGG TGT GGG AGGTTT T 3，，得到 867bp 的產物為陽性克隆，提取該陽性克隆的質粒，送去測序，結果為該質粒為將序列表中的序列2 插入載體上pmR-mCherry的BglII (與BamHI為同尾酶)和HindIII酶切位點間得到的載體，命名為 pmR-mCherry-micro302o2、顯微注射導入攜帶microRNA 302的載體片段將pmR-mCherry-micro302被TfiI酶切(在載體上有多個酶切位點)，純化回收 3954bp的片段(帶有mCherry紅色熒光和microRNA 302片段序列2、，經過測序，為序列 3。通過顯微注射將3%4bp的片段目的片段注射入離體的昆明白小鼠(購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心昆明白小鼠)的原核期胚胎中，在50ul的KSOM培養小滴中(Millipore，貨號MR_121_D)中，37°C，5% CO2環境中培養，每兩天換一次液，得到mir-302注射組胚胎。以pmR-mCherry空載體(其核苷酸序列為序列4)為對照，用Tf i I酶切，回收 3270bp的線性片段(序列4的自5，末端第1-3238和4698-47 位核苷酸，質粒為環，因此是47 位和1位是連接的。)，采用通過顯微注射將3270bp的線性片段注射入昆明白小鼠的原核期胚胎中，同上培養條件，得到空載體注射組胚胎。3、胚胎發育情況監測將上述mir-302注射組胚胎和空載體注射組胚胎從注射后開始培養算起，每M 小時觀察一次胚胎發育情況(有熒光表達為microRNA 302表達胚胎)，包括卵裂率，胚胎的形態(如2細胞，4細胞等)以及熒光表達情況。結果如圖1所示(第72小時的圖)，空載體注射組有熒光表達的胚胎已發育到4細胞階段(分裂出4個卵裂球)，但 mir-302注射組有熒光表達的胚胎只發育到2細胞階段(分裂出2個卵裂球)。將熒光場的不同時間的細胞進行計數卵裂率(卵裂球數/總培養胚胎數(總培養胚胎數為注射后挑出要培養的存活胚胎數))統計，實驗重復三次，結果取平均值，如表1所示，表1為不同階段陽性胚胎發育狀況統計
權利要求
1.如下1)-3)中任一所述物質在制備具有抑制胚胎發育功能的產品中的應用 DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA302的編碼基因的重組病毒。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于 所述抑制胚胎發育為滯后早期胚胎發育，所述早期胚胎發育為從受精卵發育開始至囊胚形成。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于 所述胚胎為小鼠胚胎；所述產品為藥物。
5.根據權利要求1-4中任一所述的應用，其特征在于所述含有microRNA302的編碼基因的重組載體為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體得到表達microRNA 302的重組載體。
6.一種重組載體，為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體的多克隆位點得到的載體。
7.權利要求6所述的重組載體在制備用于篩選促進胚胎發育功能藥物的模型中的應用。
8.一種抑制胚胎發育功能的產品，其活性成分為如下1)-3)中任一一種 DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA302的編碼基因的重組病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。
9.根據權利要求8所述的產品，其特征在于 所述抑制胚胎發育為滯后早期胚胎發育；所述早期胚胎發育為從受精卵發育開始至囊胚形成。 所述產品為藥物。
10.根據權利要求8或9所述的產品，其特征在于 所述胚胎為小鼠胚胎。
全文摘要
本發明公開了一種microRNA 302在早期胚胎發育中的應用，本發明提供了如下1)-3)中任一所述物質在制備具有抑制胚胎發育功能的產品中的應用1)microRNA 302；2)含有microRNA 302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 302的編碼基因的重組病毒。本發明的實驗證明，本發明初步闡明早期胚胎發育的生理機制，在原核期胚胎中顯微注射microRNA 302超表達載體片段，可以觀察到microRNA 302使早期胚胎發育滯后。本發明的優點為新穎、準確。
文檔編號A01K67/027GK102266571SQ20111019414
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月12日 優先權日2011年7月12日
發明者劉笑然, 孫婧, 李冬冬, 李向東, 高建明 申請人:中國農業大學