專利名稱：一種溶菌酶及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子微生物學領域，具體的說是一種溶菌酶(lysozyme)及其制備和 應用。
背景技術：
溶菌酶(EC 3. 2. 1. 17)，又名胞壁質酶(muramidase)，是一種糖苷水解酶，能降解 細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β -1，4糖苷鍵，從而破壞細胞壁， 使得細菌由于滲透溶解而死亡。溶菌酶廣泛存在于各種生物中，包括人類、動物、植物、鳥類 等。基于其抑菌效應，溶菌酶在多種生物中皆是重要的天然免疫因子，在抵抗細菌入侵過程 中發揮作用。與其它抗菌因子相比，溶菌酶具有活性穩定、可以冷凍或干燥處理、抗菌譜廣 等優點，因此，溶菌酶在醫學和食品工業中被用作抗感染物質和防腐劑。
發明內容
本發明目的在于提供一種溶菌酶及其制備和應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種溶菌酶溶菌酶為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。溶菌酶的制備1)質粒pLysG的構建以大菱鲆cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR產物純化后與載體 PBS-T于室溫連接2-8小時，連接混合液轉化大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒 pBLysG將上述質粒pBLysG和質粒pPIC9H分別用限制性內切酶EcoRV和SnaBI酶切，回 收0. 58kb和9. 2kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉 化子提取質粒，即為質粒PLysG ；2)溶菌酶的表達和制備將上述步驟1)的質粒pLysG轉化入酵母GS115內，在含有安卡青霉素的LB培養 基上培養，篩選轉化子即為GS115/pLysG ；將轉化子GS115/pLysG進行誘導表達后，收集上清，將上清用UltraCentrifugal Filter Devices濃縮20-25倍后，濃縮后的上清即為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列 所示的溶菌酶。所述步驟1)中 Fl 為 5，-GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3，；R 1 為 5，-GATATC AAACCCATTCCTTTTGTACCA-3’。溶菌酶的應用所述序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的溶菌酶可作為抑菌劑。所述溶菌酶可作為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌的抑菌劑。所述溶菌酶可作為哈氏 弧菌、海豚鏈球菌、創傷弧菌或副溶血弧菌的抑菌劑。本發明具有如下優點
1.穩定表達。本發明的酵母表達系統可以穩定高效地表達溶菌酶。2.廣譜、高效抑菌作用。本發明的溶菌酶可以有效裂解多種革蘭氏陽性和革蘭氏 陰性菌，因而可以用于防控細菌性疾病。
圖1為本發明實施例純化得到的溶菌酶田永圖譜(其中，純化得到的溶菌酶為泳 道2 ；泳道1 分子量marker ο )。圖2為本發明實施例溶菌酶的殺菌效應圖。(其中，圖A為本發明實施例溶菌酶產 生的抑菌圈；圖B為PBS陰性對照)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相應試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :MolecularCloning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；酵母轉化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按 M Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001。3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。實施例1本發明的溶菌酶為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No. 1 為:MGYANIKDVQTTGASWKTGQQDKLGYSGVEASHTMAETDSGRMSRYKSKIFNVGQKCGIDPALIAAIIS RESRAGNVLHDGWGDWNPHRNAYNAffGLMQVDVNPSGGGHTAEGAffDSEVHLCQATGILVGFIGRIRNKFPGffSGEQ HLKGGIAAYNMGDGNVHSYAEVDANTTG⑶YSNDVVARAQWYKRNGF(a)序列特征 長度193 類型氨基酸序列 鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)假設否(d)反義否(e)最初來源大菱鲆空間結構該蛋白預期含有4個主要α-螺旋結構，分別由氨基酸30-39,62-71， 118-122，以及146-151構成；另外，該蛋白的48-178氨基酸區域形成一個可溶解性轉糖酶(soluble lytictransglycosylase)結構域。實施例2溶菌酶的制備方法1)質粒pLysG的構建以大菱鲆cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為94°C 60s預變 性模板 DNA，然后 94°C 40s, 53°C 60s, 72°C 60s，5 個循環后改為 94°C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 25個循環后再在72°C延伸反應7-lOmin。PCR產物純化后與載體pBS_T (購于“天根生 化科技(北京)有限公司”)于室溫連接2-8小時，連接混合液轉化大腸桿菌后在含安卡青 霉素(100呢/1111)48￡11(401^/1111)、異丙基-0-0-硫代半乳糖苷(Mug/ml)的LB培養基上 培養18- 小時，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pBLysG。將上述質粒pBLysG和質粒pPIC9H (質粒pPIC9H構建過程參見^iang M，Hu Y, Sun L. Identification and molecular analysis of a novel C-type lectinfrom Scophthalmus maximus. Fish Shellfish Immunol 2010 ;29 :82-8.)分別用限制性內切酶 EcoRV和SnaBI酶切后回收0. 58kb和9. 2kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液 轉化入大腸桿菌，在含安卡青霉素(lOOug/ml)的LB培養基上培養18- 小時，篩選轉化子 提取質粒，即為pLysG。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97. 5%蒸溜水。所述 Fl 為 5’ -GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3，；Rl 為 5’ -GATATCAAAC CCATTCCTTTTGTACCA-3，。2)溶菌酶的表達和制備將步驟1)的質粒pLysG轉化到酵母GSl 15內(購于美國^witrogen公司)，在含 有安卡青霉素(100ug/ml)的LB培養基上培養，篩選轉化子即為GS115/pLysG。將GS115/ pLysG按hvitrogen公司提供的標準方法(Catalog no. V175-20)進行誘導表達后，收集 上清。將上清用 UltraCentrifugal Filter Devices (購于美國 Millipore 公司)濃縮 20 倍，濃縮后的上清部分即為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示的溶菌酶。而后將其 用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。結果表明濃縮液中含有高純度的溶菌酶(參見 圖1)，其分子量與表SEQ ID No. 1中序列的分子量一致。將濃縮后所得的溶菌酶進行N-端 氨基酸測序，證實其序列與表SEQ ID No. 1中序列一致。實施例3溶菌酶的殺菌檢測1)細菌平板制備。在LB培養基中培養內分別培養哈氏弧菌(保存于CGMCC，編號 為CGMCC 1985)、海豚鏈球菌G^ (保存于CGMCC，編號為CGMCC 1984)、創傷弧菌(保存于 CGMCC，編號為CGMCC 1. 1758)、副溶血弧菌(保存于CGMCC，編號為CGMCC 1. 2164)分別培 養至0D600為0.5，將上述各菌種與含有0.8% (質量百分比)瓊脂的LB混合；將混合液倒 入培養皿，凝固后即為細菌平板。2)溶菌酶的殺菌效應。將高壓滅菌處理過的濾紙片(直徑5mm)置于細菌平板上。 將實施例2制備的溶菌酶在PBS中稀釋至lmg/ml，將IOul溶菌酶或PBS (陰性對照)加至 細菌平板的濾紙片上。將平板于保溫32-4 后觀察發現，在含有溶菌酶的濾紙片周圍 形成20-40mm直徑的抑菌圈(即無細菌生長)，而含有PBS的濾紙片周圍則無抑菌圈(參見圖2)。因此本發明的溶菌酶具有強性殺菌效應，可作為抑菌劑用于防治細菌性病害。
權利要求
1.一種溶菌酶，其特征在于溶菌酶為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。
2.—種權利要求1所述的溶菌酶的制備，其特征在于1)質粒pLysG的構建以大菱鲆cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR產物純化后與載體pBS_T 于室溫連接2-8小時，連接混合液轉化大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pBLysG將上述質粒PBLysG和質粒pPIC9H分別用限制性內切酶EcoRV和SnaBI酶切，回收 0. 58kb和9. 2kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化 子提取質粒，即為質粒PLysG;2)溶菌酶的表達和制備將上述步驟1)的質粒PLysG轉化入酵母GS115內，在含有安卡青霉素的LB培養基上 培養，篩選轉化子即為GS115/pLysG ；將轉化子GS115/pLysG進行誘導表達后，收集上清，將上清用UltraCentrifugal Filter Devices濃縮20-25倍后，濃縮后的上清即為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列 所示的溶菌酶。
3.按權利要求2所述的溶菌酶的制備，其特征在于所述步驟1)中Fl為5’-GATATCA TGGGTTATGCAAATATCAAGG-3’ ；Rl 為 5’ -GATATCAAACCCATTCCTTTTGTACCA-3，。
4.一種權利要求1所述的溶菌酶的應用，其特征在于所述序列表SEQ ID No. 1中的 氨基酸序列的溶菌酶可作為抑菌劑。
5.按權利要求4所述的溶菌酶的應用，其特征在于所述溶菌酶可作為革蘭氏陽性或 革蘭氏陰性菌的抑菌劑。
6.按權利要求5所述的溶菌酶的應用，其特征在于所述溶菌酶可作為哈氏弧菌、海豚 鏈球菌、創傷弧菌或副溶血弧菌的抑菌劑。
全文摘要
本發明涉及分子微生物學領域，具體的說是一種溶菌酶(lysozyme)及其制備和應用。溶菌酶為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制備方法以大菱鲆cDNA為模板PCR擴增溶菌酶基因，構建質粒pLysG；將pLysG轉化酵母GS115，對轉化子進行誘導表達后，收集上清，濃縮后即得溶菌酶。所述溶菌酶對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌具有高效殺菌作用。本發明的酵母表達系統可以穩定高效地表達溶菌酶。
文檔編號A01N47/44GK102061291SQ20101054490
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者孫黎, 趙璐 申請人:中國科學院海洋研究所