專利名稱：一種從雞蛋清中分離溶菌酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種溶菌酶的制備方法，特別涉及一種雞蛋清中分離溶菌酶的方法。
背景技術：
溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶在臨床上是有效的消炎劑，在食品防腐和基因工程等方面也有廣泛的應用。溶菌酶來源很廣，在人、動物、植物和微生物中均有發現，其中雞蛋清中含量最高，因此，工業生產溶菌酶常以雞蛋為原料。
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從雞蛋中溶菌酶的提取方法報道很多，有直接結晶法、親和色譜法、離子交換法、沉淀法、雙水相萃取、超濾法等。各種方法優缺點不一，產品的質量和生產成本也有所不同。目前，沉淀法是一種工業上應用比較成熟的提取方法，其在技術要求和生產成本上都比較好。其中，生吉萍等中國食品學報，2003年增刊，10 14用等電點沉淀法，即先將獲取的蛋清液用NaCl溶液稀釋，再用lmol/L的NaOH溶液將蛋清pH值調到9.5 11.0，使其接近溶菌酶的等電點，并4°C下靜置，從而使溶菌酶沉淀下來。這種方法操作簡單，在工業生產中可以使產品的成本大大降低。但是其生產周期較長，產率相對偏低，純度不高，高純度產品獲取過程復雜，需要增加較多步驟。康旭、鄧川等采用鹽析沉淀法畜牧與飼料科學，2010，31 (5)，91 92，即用pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)將蛋清稀釋5倍，在攪拌和除去雜蛋白后，用硫酸銨對上清液分級沉淀，取40 % 80 %飽和度部分的沉淀，得溶菌酶。得到的溶菌酶純度達到電泳純，其中用80%左右飽和度硫酸銨時收率最好。此法得到的溶菌酶純度和產率都比較高，但是依舊存在沉淀速度慢及不完全的問題，因而使得溶菌酶的活性降低了很多。陳若飛用聚丙烯酸沉淀法從蛋殼中提取溶菌酶沈陽化工學院學報，2008年9月第22卷第3期222 225，在除去雜蛋白后，加入NaOH溶液調pH至6.0，加入聚丙烯酸，產生乳白色膠狀物。將聚合物用Na2COJf其溶解，并pH調至9.5，加入質量分數為5%的CaCl2液將溶菌酶聚丙烯酸解離，接著過濾得到澄清溶液。最后加入NaOH溶液調pH為10.5左右，使溶菌酶結晶析出。此法選擇性好，得到的溶菌酶純度很高，但是聚丙烯酸價格較貴，而且水溶液的黏性較大，不方便大規模生產。文章軍和錢生球在其專利一種分離溶菌酶的方法中描述，以蛋清為原料，加水稀釋后，攪拌均勻，用酸調pH至4.0 5.0，靜置，除去沉淀，再將溶液升溫至75 80°C，冷卻靜置，過濾得上清液，然后用堿調pH至7.5 8.0，加入乙醇至產生沉淀，靜置6 10小時后過濾，干燥沉淀溶菌酶。其工藝步驟簡單、生產周期短、除雜蛋白效果較好、收率也比較高，但是最后所得酶的活性不是特別高。國外，研究者用N-異聚丙烯酰胺與丙烯酸單體的共聚物從蛋清中，Journal ofBiotechnology, 87 (2001)，95 107，雖然得到的產品純度高、收率高、活性也比較好，但是生產的成本高，而且操作十分復雜。
溶菌酶為白色或微白色凍干粉，可溶于水，不溶于乙醚和丙酮。相對分子量在14000左右，pi在10.5 11.0，最適存在和反應的pH值為6.5。酸性介質中可穩定存在，堿性介質中易失活；96°C或pH值為3條件下，15min后活力保持87%。而蛋清中的其他蛋白的pi在4.0 5.0,在80°C以上的聞溫下易失活，所以，可以用等電點沉淀法除雜蛋白。由于溶菌酶的Pi太高，此時采用等電點沉淀產生一定量的失活，但溶菌酶在弱堿性條件下，會在乙醇作用下結晶，所以可以用乙醇使其結晶而分離。此外，木質素磺酸鈉可以溶解在堿性的水溶液中，而且在實驗研究中發現，木質素磺酸鈉可以在弱酸條件下與溶菌酶生成聚合物沉淀。所以本發明就是利用這種聚合沉淀的方法提取分離蛋清中溶菌酶。而聚丙烯酰胺作為水溶性高分子聚合物，具有良好的絮凝性，本身無毒副作用，且聚丙烯酰胺易與木質素磺酸鹽生產凝聚物。蔣成新在研究中，有利用聚丙烯酰胺和木質素磺酸鈉復合石油鉆采工藝，1988年專輯(22) 2，193 202，生成復合鉻凍膠堵水劑。而本發明則是利用聚丙烯酰胺水溶液與木質素磺酸鈉結合，生成沉淀，而使木質素磺酸鈉和溶菌酶的聚合沉淀解離，達到得到分離。
所以本發明使用的原材料價格低、工藝簡單、條件溫和、便于操作控制、生產周期短，比以往的沉淀法更經濟，更適合于工業化生產。
發明內容
本發明目的是提供一種從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，使用的原材料價格低、工藝簡單、條件溫和、便于操作控制、生產周期短，比以往的沉淀法更經濟，更適合于工業化生產。本發明采用的技術方案是:一種從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，所述方法按以下步驟進行:(I)將鮮雞蛋清用水稀釋后，攪拌均勻，調節pH值至4.0 5.0后立即加熱至80 85°C，保溫10 15min，水浴冷卻至20 35°C后靜置6 10h，過濾，獲得濾液a ；(2)將步驟(I)獲得的濾液a調pH值至4.5 6.5，攪拌下，緩慢加入木質素磺酸鈉至有沉淀生成,靜置3 9小時，過濾，取濾餅用Na2CO3水溶液溶解完全后，再緩慢加入聚丙烯酰胺水溶液至無沉淀產生，靜置4 8小時，過濾，獲得濾液b ；(3)向步驟(2)獲得的濾液b中緩慢加入無水乙醇至產生白色沉淀，靜置(15 40°C下靜置3 5h)，過濾，將濾餅冷凍干燥，獲得所述溶菌酶。進一步，步驟(2 )中將步驟(I)獲得的濾液a用質量濃度5%的NaOH水溶液調pH值，優選調PH值至5.5 5.8。進一步，步驟(2)中木質素磺酸鈉相對分子量為4000 10000。進一步，步驟(2)中木質素磺酸鈉以質量濃度10% 20%的木質素磺酸鈉水溶液的形式加入，所述木質素磺酸鈉水溶液與濾液a的體積比為0.4 1.2:1，優選0.8:1。進一步，步驟(2)中Na2CO3水溶液的質量濃度為3 10%，優選5%。進一步，步驟(2)中聚丙烯酰胺水溶液的質量濃度為5% 25%，優選10 15%。進一步，步驟(2)加入木質素磺酸鈉的溫度為15 40°C，優選25°C ;所述加入聚丙烯酰胺水溶液的溫度為15 40°C，優選25°C。
進一步，步驟(2)中聚丙烯酰胺的相對分子量300萬 800萬。進一步，步驟(3)所述加入無水乙醇的溫度為15 40°C，優選25°C。本發明用造紙行業的廢物木質素磺酸鈉作為沉淀劑，從雞蛋清中分離溶菌酶。首先，用水將雞蛋清溶解，調節pH至4.0 5.0并加熱至80°C左右，使雜蛋白沉淀、過濾除去，獲得濾液；再在弱酸性條件下，用木質素磺酸鈉與濾液中的溶菌酶進行聚合、沉淀；然后，將沉淀物在堿性條件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解離，并與木質素磺酸鹽生成沉淀，過濾得濾液；最后，向濾液中加入無水乙醇使其結晶，過濾、干燥即得溶菌酶。接下來進行稱量和酶活力的測定，其中，酶活力的測定采用分光光度計法(即F.1.P法)。其原理是溶菌酶破壞細菌的細胞壁，從而降低細胞懸浮液的濁度，可用分光光度計法來測定這種反應。一個F.1.P溶菌酶單位相當于在規定條件下于450nm處每分鐘將吸光度降低0.001所需的酶量。用以下公式(I)計算酶的活性:
權利要求
1.一種從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于所述方法按以下步驟進行: (1)將鮮雞蛋清用水稀釋后，攪拌均勻，調節PH值至4.0 5.0后立即加熱至80 85°C，保溫10 15min，水浴冷卻至20 35°C后靜置6 10h，過濾，獲得濾液a ； (2)將步驟(I)獲得的濾液a調pH值至4.5 6.5，攪拌下，緩慢加入木質素磺酸鈉至有沉淀生成,靜置3 9小時，過濾，取濾餅用Na2CO3水溶液溶解完全后，再緩慢加入聚丙烯酰胺水溶液至無沉淀產生，靜置4 8小時，過濾，獲得濾液b ； (3)向步驟(2)獲得的濾液b中緩慢加入無水乙醇至產生白色沉淀，靜置，過濾，將濾餅冷凍干燥，獲得所述溶菌酶。
2.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于步驟(I)用質量濃度5%的鹽酸來調節pH值。
3.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于步驟(2)中將步驟(I)獲得的濾液a用質量濃度5%的NaOH水溶液調pH值。
4.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于:步驟(2)中木質素磺酸鈉相對分子量為4000 10000。
5.如權利要求1或4所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于:步驟(2)中木質素磺酸鈉以質量濃度10% 2 0%的木質素磺酸鈉水溶液的形式加入，所述木質素磺酸鈉水溶液與濾液a的體積比為0.4 1.2:1。
6.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于:步驟(2)中Na2CO3水溶液的質量濃度為3 10%。
7.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于:步驟(2)中聚丙烯酰胺水溶液的質量濃度為5% 25%。
8.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于步驟(2)加入木質素磺酸鈉的溫度為15 40°C，所述加入聚丙烯酰胺水溶液的溫度為15 40°C。
9.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于步驟(2)中聚丙烯酰胺的相對分子量300萬 800萬。
10.如權利要求1所述的從雞蛋清中分離溶菌酶的方法，其特征在于步驟(3)所述加入無水乙醇的溫度為15 40°C。
全文摘要
本發明公開了一種從雞蛋清中分離溶菌酶的方法用水將雞蛋清溶解，調節pH至4.0～5.0并加熱至80℃左右，使雜蛋白沉淀、過濾除去，獲得濾液；再在弱酸性條件下，用木質素磺酸鈉與濾液中的溶菌酶進行聚合、沉淀；然后，將沉淀物在堿性條件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解離，過濾得濾液；最后，向濾液中加入無水乙醇使其結晶，過濾、干燥即得溶菌酶；本發明使用的原材料價格低、工藝簡單、條件溫和、便于操作控制、生產周期短，比以往的沉淀法更經濟，更適合于工業化生產。
文檔編號C12N9/36GK103114082SQ20131006909
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者張健, 金志敏, 夏春年, 姚小武, 張巖 申請人:浙江工業大學