專利名稱：大麗輪枝菌分離的蛋白質多核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種能提高植物抗性和誘導植物防御反應來自于大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)分離的蛋白質及編碼該的蛋白質的核苷酸極其應用。
背景技術：
棉花黃萎病是一種危害性極大的維管束病害。每年給我國的棉花生產帶來極大危害，嚴重影響我國棉花生產的品質和產量。棉花黃萎病菌在分類地位上屬于半知菌亞門絲胞綱絲孢目淡色孢科輪枝菌屬，它分屬于黑白輪枝菌和大麗輪枝菌兩個種，在我國危害最大的是大麗輪枝菌種(Verticillium dahliae)。目前對植物病害的防治主要采取化學防治和選育品種。但是它們往往存在著無法摒除的弊端。上世紀隨著生物技術的發展，植物誘導抗性受到關注，激發子作為誘導植物抗性的主要因子，愈發受到關注。因此從該病原菌中尋找出具有新活性，新功能的有效物質已成為國內外科學家關注的熱點。作為我國棉病主要病害的大麗輪枝菌，其產生的蛋白質作為激發子是一種重要的效應分子。它通過識別并作用植物細胞表面或亞細胞組分的受體分子來傳遞病原菌的激發子信號，啟動植物的防衛系統，誘導植物的局部組織產生過敏性細胞壞死，并通過局部細胞信號物質的系統傳遞使植物最終產生系統獲得性抗性。目前國內外研究的大麗輪枝菌中的激發子，主要起到毒素作用。已經從大麗輪枝菌中分離出許多能夠引起植物抗病反應或致使植物發病的活性成分。如早在1982 年Buchner，V.等就在大麗輪枝菌的培養液中分離到一種脂多糖復合物PLPC(protein-lipopolysaccharidecomplex)，可以誘發與黃萎病菌類似的致病癥狀(Buchner，V.等， Physiol. Mol. PlantPath.，1989，35 :253-269)；同時 Kazakov，I 等用黃萎毒素處理棉苗， 顯微觀察顯示其維管系統產生了膠滯體與侵填體(Kazakov，I等，Uzbekiston Biologija Zurnali. 1989, (5) :8-10)。Davis, D. Α.等從大麗輪枝菌發酵液中分離到一個約65-kDa 的糖蛋白，該糖蛋白的蛋白成分能有效地積累植保素，是主要活性成分，糖基起著結構作用 (Davis, D. Α.等，Physiological and Molecular Plant Pathology，1998，52，259-273)。國內上海植物生理研究所儲昭慶等人分離了一個約沈-kDa的分泌型糖蛋白復合物，該糖蛋白能夠誘導海島棉培養細胞中棉酚等倍半萜的合成，棉酚的積累隨著糖蛋白濃度成正比，但當該糖蛋白濃度達到較高的水平時會引起植物細胞死亡(儲昭慶等， 植物學報1999，41 (9) :972 976)。上海植物生理研究所陳曉亞等從所制備的大麗輪枝菌EST序列中，獲得了一個233個氨基酸殘基組成的激發子蛋白。該蛋白能夠誘導活性氧的爆發和相關I3R基因的表達，在較低的濃度下誘導棉花懸浮細胞棉酚等倍半菇類植保素的合成(APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2004，70，4989-4995 ；專利號 ZL 200310108076. 8)。所有已公開發表的文獻表明，大麗輪枝菌確實可以分泌產生激發子，引起植物的防御反應提高植物的抗性。雖然該菌產生的激發子性質和種類各不相同，但是它們的蛋白
3質序列和基因序列報道的很少，所以尋找一種新的蛋白質激發子，明確它的序列信息為揭示功能和進一步提高植物的抗性是非常必要的。
發明內容
本發明的目的是提供一能夠提高植物抗性及防御性的大麗輪枝菌分離蛋白質及其編碼多核苷酸和該蛋白及其編碼多核苷酸的應用。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案一種分離的蛋白質，其中，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本發明的蛋白質在提高植物抗性和誘導植物防御反應中的應用。本發明的蛋白質在提高植物抗性和誘導植物防御反應中的應用，其中，植物為煙草。一種分離性的多核苷酸，其中，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(1)編碼如權利要求1蛋白質的多核苷酸；(2)與多核苷酸(1)互補的多核苷酸。一種編碼如本發明的多核苷酸，其中，其多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。一種載體，其中，它含有本發明的多核苷酸序列。一種遺傳工程的宿主細胞，其中，它含有本發明6的載體。一種本發明的蛋白質制備方法，其中，包含下列方法(1)在表達條件下，培養本發明7的宿主細胞；(2)從培養物中分離出本發明1的蛋白質。本發明的蛋白質，是指來自棉花黃萎病大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的培養液、培養液的上清液或菌體的蛋白質。本發明的優點為，該種蛋白質可以明顯的提高植物的抗性，濃度低起效快，為提高植物的抗病性提供了新的途徑，因而在農業生產上具有廣闊的應用前景。
圖1是接種TMV后葉片的照片圖2氨基酸序列對比圖
具體實施例方式下面通過具體實例進一步說明本發明特點。實施例1大麗輪枝菌的培養及發酵液制備將大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)菌株劃線菌塊接種于PDA取去皮馬鈴薯 200克，切成塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，121°C滅菌30分鐘平板，25°C培養2周，挑去菌落邊緣處接種于200mL盛有Czapek-Dox加水解絡氨酸(Sigma)硝酸鈉3. 0g，無水磷酸氫二鉀1. Og,七水硫酸鎂0. 5g，氯化鉀KCl 0. 5g，七水硫酸亞鐵0. Olg,蔗糖30. Og (北京化工廠，分析純)，PH 5. 6，加去離子水至1L液體培養基的500ml三角瓶中，25°C、150r/min培養14天，得到大麗輪枝菌的發酵液。
實施例2粗蛋白質激發子的制備和監測取實施例1中所得的發酵液，在4 °C、5000rpm條件下離心Ih (或13000rpm， 30min)，收集上清液，用0.45mm的濾膜(Whatman)抽濾兩次，直至沒有菌體。加入硫酸銨粉末，使上清液中硫酸銨終濃度為80%來沉淀目標蛋白質，4°C透析48h，最后將獲得的胞外總蛋白質溶解到Tris-HCl緩沖液(20mM,pH 8.0)中，蛋白質終濃度為100yg/mL。蛋白質含量用 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)經 GF-M2000 型酶標儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)在波長590nm處測定。生物活性的監測以生長2個月，具有5-7片真葉的煙草為材料，Tris-HCl緩沖液和粗蛋白相同濃度的BSA溶液為對照。粗蛋白溶液濃度稀釋到50yg/mL，利用ImL不帶針頭的注射器，將50 μ L溶液從葉子背面分別注射進葉片中去。經過24h觀察是否有壞死斑形成。結果注射粗蛋白質激發子的葉片，注射部位4h后出現水漬斑，他后注射處葉片變得透明較薄一些，1 后可以呈現典型的過敏反應，有壞死斑形成。對照并無任何反應，和正常葉片一樣。實施例3蛋白質激發子的分離純化及生物活性測定使用AKTAexplore 10 (GE Healthcare)蛋白質純化儀對所得的總蛋白質進行進一步純化，樣品首先通過HP Q HiTrap 陰離子交換柱(GE Healthcare)，用NaCl進行線性洗脫(0%-100%，30min)，獲得到6個蛋白質洗脫峰，應用的蛋白濃度為50 μ g/mL，結果表明， 第3個蛋白質峰，可以強烈的引起煙草的過敏反應；該蛋白質峰再通過pheny HP疏水層析柱(GEHealthcare)和電洗脫的進一步純化，得到有活性的單一蛋白質。以上純化過程中蛋白質激發子活性的監測是按實施例2的方法進行。該單一蛋白質峰經15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一帶，說明蛋白質純度高。該蛋白質表觀分子量為17kD(pI=4.34)Jf 此蛋白質蛋白質激發子命名為 PevDl(￡rotein Elicitor of Verticillium dahliae 1)。 用實例2同樣方法測試，設置不同濃度的PevDl (22 μ M，11 μ M，5 μ M，1 μ M，500ηΜ, IOOnM, IOnM)，1 μ M能夠引起典型過敏性反應，最低能引起過敏反應的蛋白濃度為ΙΟΟηΜ。結果分離純化的PevDl可以使煙草形成過敏反應的壞死斑。(1)氧爆發和H2A沉積取約0. lg/mL的煙草懸浮細胞，離心收集重懸于緩沖液(175mM甘露醇，0. 5mM氯化鈣，0. 5mM硫酸鉀(北京化工，分析純)，IOmM羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma) pH 5. 75) 中，孵育Ih在，150rpm。然后去250 μ L懸浮細胞加入HEPES緩沖液(和上邊緩沖液一樣配方同時添加0. 3mM發光氨(Luminol))中，同時加入PevDl使其終濃度為luM，開始用化學發光檢測儀(Promega)，檢測細胞所生成的活性氧。葉片處理方法如實例2，PevDl濃度為1 μ Μ,時間為Mh。取處理的葉片用蒸餾水洗凈后將其置于 2mL 管中，取適量 DAB (3，3’ -Diaminbenzidine) (Sigma)染液(lmg.mL-1， pH3. 8)，用NaOH調pH值至5. 8，分別加入預處理的植物組織，室溫避光保存8小時。隨后去除各管中染液，加入95 %乙醇，沸水浴數分鐘，去除各管液體，再加入無水乙醇并沸水浴直至葉片綠色完全脫去為止，再次吸出各管液體，將去浸泡在70%甘油中，趕出細胞間氣泡顯微鏡觀察。結果PevDl處理約30min后，煙草懸浮細胞出現氧爆發現象；在PevDl處理的葉片部位有明顯的褐色沉積物質出現，并且處理部位的氣孔上的保衛細胞也出現紅褐色沉淀。(2)細胞培養基的堿化取約0. lg/mL的煙草懸浮細胞，重新轉接到新的煙草懸浮細胞培養基中，25 °C， 150r/min培養3天后，加入蛋白質激發子PevDl處理，使其終濃度為ΙμΜ，繼續搖培。此后每過IOmin用ρΗ劑測定培養基的ρΗ，直到處理后lOOmin。結果蛋白質激發子PevDl能夠引起細胞培養基的堿化，在處理后50min培養基的 PH達到最高。(3)胼胝質的沉積酚類物質和木質素的積累取實施例2中方法，經IuM的PevDl處理24h后的葉片，將葉片放入緩沖液(1 %戊二醛，5mM檸檬酸，90mM磷酸氫二鈉(北京化工，分析純)pH 7.4)過夜。然后放入無水乙醇中煮lOmin，在放入50%乙醇中，接著轉入緩沖液(67mM磷酸氫二鉀(北京化工，分析純)， PH 12)。在染色液(0. 苯胺藍(Sigma)，67mM磷酸氫二鉀(北京化工，分析純)，ρΗ 12) 染色lh，放入70%甘油固定觀察。取0. 5g煙草細胞，加入PevDl使其終濃度為luM，處理108h后，用6mol/L的2. 5% w/v間苯三酚(Sigma)處理，立即觀察。取300 μ L煙草懸浮細胞，加入PevDl使其終濃度為1 μ Μ，處理10 后，在紫外熒光顯微鏡下觀察酚類物質的積累。結果在PevDl處理的葉子，細胞壁出現胼胝質星狀的積累；處理過的煙草懸浮細胞有木質素的積累；可以觀察到酚類物質在細胞上的沉積。實施例4蛋白質激發子PevDl肽段序列的獲得純化的PevDl蛋白質經雙向電泳檢測，切取蛋白質單點分別經IOng/ μ 1測序級修飾胰蛋白質酶 Gequencing Grade Modified Trypsin，Promega) 30°C、ρΗ7· 5 酶解 30min lh，ESI-MS/MS為英國Micromass公司的Q-T0F2正交加速電噴霧串聯質譜儀。配備納升噴霧源。所有測定均在正離子方式下進行。質譜儀用Glu-fib的串聯質譜碎片校正，質量準確度小于0. IDa。霧化氣為氮氣，碰撞氣體為氬氣。源溫80°C，錐孔電壓50V。TOF加速電壓9. lkV。MCP檢測器電壓為2150V。毛細管電壓800V。獲得該蛋白質的多個肽段序列，這些序列和NCBI中GenBank NO. XP 003008076所編碼的氨基酸序列相匹配。如圖2所示，用黑體(下劃線)表示的為測序獲得的肽段序列。實施例5蛋白質激發子PevDl編碼基因的克隆根據質譜測序結果和密碼子的簡并性設計4對引物，經篩選驗證試驗最終選定引物 PevDl-正向 5，-ATGCAGTTCACCCTYGCCG-3，和 PevDl-反向 5，-TTAAGCCTSGGCGGGAGC-3，， 并以大麗輪枝菌株抽提的mRNA為模板，選用HiFi反轉錄聚合酶進行PT-PCR(94°C 3min ； 94°C 30s, 67°C 30s, 72°C lmin, 35cycles ；72°C IOmin)，擴增出 468bp 的 DNA 片段， 其中包括468bp的完整開放閱讀框，將其命名為pevDl基因，該基因的順序如SEQ ID NO=I 所示。實施例6 pevDl基因的原核表達和純化(1)表達載體的構建設計蛋白質激發子基因pevDl的特異性引物，引入帶有酶切保護堿基的酶切位
6點，正向引物5，-CCGGAATTCATGCAGTTCACCCTCGCCG-3，,(下劃線為Eco RI的酶切序列)，反向引物5，-CCCAAGCTTTTAAGCCTCGGCGGGAGC-3’,(下劃線為HindIII的酶切序列)，擴增全長 pevDl 基因(94°C 3min ；94°C 30s, 67°C 30s, 72°C lmin, 35cycles ；72°C IOmin ；)。 先將pevDl基因目的片段克隆到pMD18-T simple載體，經Eco RI和HindIII酶切后，將 pevDl片段克隆到pET18a(+)載體(Novagen)的Eco RI/Hindlll位點，熱激發轉化到大腸桿菌TranslO (Transgene)，挑取陽性克隆，搖菌并提取質粒，酶切并測序驗證。(2)誘導表達將步驟(1)中所獲得表達載體用熱激發轉化到大腸桿菌BL21(DE!3)中。質粒提取及轉化表達宿主菌株的方法同(1)，驗證正確后，進行表達。將驗證正確的重組表達菌株過夜活化，同時取pET28a空質粒的菌株作為對照。分別取ImL過夜培養液加入到含有100 μ g/ mLKan的IOOmL LB液體培養基中(1%接種量)，37°C，200r/min振蕩培養2 汕培養至 0D600為0. 6 0. 8。加入誘導劑IPTG(終濃度為0. lmmol/L)，22. 5°C,220r/min繼續振蕩培養Mh，誘導表達目的蛋白。高速離心，收集菌體加入緩沖液。經超聲破碎菌體后，4°C高速離心，收集上清。取20yL上清液，加入5yL 5 X SDS上樣緩沖液(變性)重懸菌體，沸水浴中加熱lOmin，13000r/min離心lOmin，取上清進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮蘭R250染色，觀察表達情況。結果經過SDS-PAGE檢測，獲得一個分子量約20_kDa的融合表達蛋白 (His-PevDl)，與預測一致。(3)重組蛋白的純化利用AKTAexplorerlO蛋白純化儀進行重組蛋白的純化。選用Hitrap chelating Column柱進行親和層析，先用清洗緩沖液平衡親和柱；取步驟( 離心后的重組蛋白液5mL 進樣，流速為lmL/min，淋洗至基線后，洗脫緩沖液進行洗脫；收集的各洗脫峰，在大量體積的磷酸鹽緩沖液中4°C透析過夜，隨后進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮蘭染色檢測蛋白的純度。生物活性測定采用實施例2中方法測定重組蛋白質激發子對煙草的活性。結果獲得純化的約20KD的融合表達蛋白(His-PevDl重組蛋白)實施例7重組蛋白(His-PevDl)在煙草上引起的反應用ImL不帶針頭的注射器，分別將約50mL，1 μ M融合表達蛋白(His-PevDl)，相同濃度的pET48a(+)空質粒表達蛋白及Tris-HCK20mM，pH 8.0)溶液分別從葉子背面分別注入不同的煙草葉片中。24h后觀察葉片上的反應。如實例3中(1)的方法，觀察重組蛋白誘導H2O2在處理葉片上的積累；如實例3中 (2)的方法，觀察重組蛋白引起煙草細胞培養基的堿化。結果重組蛋白(His-PevDl)能夠引起煙草葉片發生HR反應；His-PevDl使處理葉片獲得H2A積累，產生紅褐色沉淀；His-PevDl使處理的煙草懸浮細胞培養基堿化，培養基PH最高的時間和天然純化的PevDl引起的基本一致。(1)抗性相關基因半定量RT-PCR分析取所需的樣品液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入Trizol，室溫5min靜置， 12000rpm離心5min，棄沉淀；按200 μ L氯仿/mL Trizol，震蕩混勻15min放置，4 °C， 12000rpm離心15min，吸取上層，加入0. 5mL異丙醇/mL Trizol，混勻，_20°C靜置20min ；離心，75%乙醇漂洗，離心去除乙醇，5-lOmin晾干。加入DEPC處理水，測RNA濃度，調成相同濃度。第一鏈cDNA 的合成，采用 TransGen 公司的 TransScript Two-Step RT-PCR Kit。取 500ng 總 RNA，按照試劑盒說明書，用 iTransScript RT/RI Enzyme Mix,以 Anchored Oligo (dT) 18 為引物，42 °C 孵育 30min，85 °C 加熱 5min 使酶失活。取 IyL 反轉錄產物做PCR，. β-actin為內標基因，以抗性相關基因特異引物做PCR(rai-a基因 F :5 ‘ -TGGATGCCCATAACACAGC-3 ‘ R5 ‘ -AATCGCCACTTCCCTCAG-3 ‘ ；PRl-b 基因 F 5 ‘ -GATGTGGGTTGATGAGAAGC-3 ‘ R 5 ‘ -CTCCAATTACCAGGTGGATC-3 ‘ ；PDF1. 2 基因 F :5 ‘ -GGAAATGGCAAACTCCATGCG-3 ‘ R 5 ‘ -ATCCTTCGGTCAGACAAACG-3 ‘ ；NPRl 基因 F :5 ‘ -ACATCAGCGGAAGCAGTAG-3 ‘ R 5 ‘ -GTCGGCGAAGTAGTCAAAC-3 ‘ ；ACSl 基因 F 5' -GAGAATGAGAAGAACAGCTCA-3‘ R 5' -TTCTAGCACAATTAACGACGG-3‘)，觀察抗性相關基因的表達情況。結果經過半定量RT-PCR結果可見His-PevDl在處理煙草葉片后2天，就可以誘導抗性相關基因的表達，但是ACSl除外，至始至終沒有表達。(2)誘導減少TMV對煙草的危害通過預實驗可知1 μ M融合表達蛋白對煙草抗TMV有較佳效果。將50 μ L、純化后的His-PevDl(IyM)溶液通過無針頭的注射器，從背面注入煙草葉片中。以Tris-HCL緩沖液作對照，每處理10株，重復3次。TMV的接種方法為取新鮮TMV病葉加0. 01mol/L磷酸緩沖液(pH = 7.4)研磨成勻漿，病汁液濃度為每克病葉加15mL磷酸緩沖液。分別確定最佳接種時間和最佳誘導時間(a)最佳接種時間分別于重組蛋白處理后1、3、5和7d，在處理葉的上一位葉摩擦接種TMV。于接種后3天，調查枯斑數量，計算枯斑抑制率。抑制率(％)=[(壞死斑個數/直徑-處理組壞死斑個數/直徑)/壞死斑個數 /直徑]X 100結果如下表。
權利要求
1.一種分離的蛋白質，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根據權利要求1所述的蛋白質在提高植物抗性和誘導植物防御反應中的應用。
3.根據權利要求2所述的蛋白質在提高植物抗性和誘導植物防御反應中的應用，其特征在于，所述的植物為煙草。
4.一種多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(1)編碼如權利要求1所述蛋白質的多核苷酸；(2)與多核苷酸(1)互補的多核苷酸。
5.一種編碼如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求4或5所述的多核苷酸序列。
7.一種遺傳工程的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.—種權利要求1所述的蛋白質制備方法，其特征在于，包含下列方法(1)在表達條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(2)從培養物中分離出權利要求1所述的蛋白質。
全文摘要
一種能在煙草等植物上引起抗性過敏性反應的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)蛋白質，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。一種編碼如本發明所述的蛋白質的基因，其中，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發明所述的蛋白質能夠引起煙草的抗病相關防御信號分子的生成。在較低的濃度下蛋白質可以誘導植物抗病相關基因的表達；次生代謝物的增多來加強細胞壁的防御病原菌的能力。將該蛋白質注射煙草植株，在形成壞死斑的同時提高了整株煙草抗煙草花葉病毒(TMV)的能力。本發明的優點為，該種蛋白質可以明顯的提高植物的抗性，濃度低起效快，為提高植物的抗病性提供了新的途徑，因而在農業生產上具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01P21/00GK102558320SQ201010593488
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者曾洪梅, 楊秀芬, 王炳楠, 袁京京, 邱德文, 郭立華 申請人:中國農業科學院植物保護研究所