專利名稱：用于向細菌培養物上清液中分泌目的蛋白質的融合蛋白質的制作方法
發明描述本發明涉及融合蛋白質，其包含目的蛋白質和融合部分，所述兩種蛋白質的聯合導致融合蛋白質分泌至細菌宿主上清液中，并且目的蛋白質以正確的三維結構存在。融合蛋白質的基因序列為可在細菌宿主中表達的表達盒的一部分。本發明涉及對利用此表達盒的該融合蛋白質進行發酵、表達以及后處理的方法；涉及含有此表達盒的質粒；涉及細菌宿主細胞，所述細菌宿主細胞含有整合至染色體中和/或作為復制子(例如作為質粒)的此表達盒；涉及以蛭素或其衍生物作為融合部分的所述融合蛋白質；涉及生產胰島素或胰島素衍生物的方法；以及涉及所述表達盒在從蛭素或其衍生物制備融合蛋白質以及生產胰島素或胰島素衍生物的方法中的使用。
對基于重組蛋白質生產藥物的優化方法的發展應在盡可能情況下滿足以下兩點，第一，方法應盡量節約成本，以及第二，產物應達到最高純度。
對此而言，表達系統的選擇決定了特定生產方法的過程，并且如熟練技術人員所顯而易見的，新的蛋白質-化學技術的發展、多種生物化學可能性以及已知技術新的聯合總能使現有方法的改進成為可能。
對用于合成的宿主細胞系統的選擇由期望蛋白質的特性決定。細菌(諸如大腸桿菌)代表了利用其可以在便宜培養基中快速生產粗產量為幾克蛋白質的系統。該系統尤其對于不需修飾并且可在體外復性至其生物學活性形式的蛋白質是有用的。對于大量需要的蛋白質(諸如胰島素)，旨在得到導致蛋白質以包含體形式在細胞內聚積的表達速率。細胞裂解后，將蛋白質溶解并使其在之后進一步的方法步驟中折疊。然而，折疊過程并不定量。這可能是由于包含體形成過程中的不可逆破壞、細胞裂解時的相應破壞以及折疊過程中的錯誤所造成。隨后，“錯誤”折疊或修飾的分子不得不在進一步的分離步驟中除去。這不利于節約生產成本。另外，在終產物中也會再次出現痕量所述分子。由于藥物要滿足高純度標準，因此需要適當細致和高成本的純化。由于有利的成本/粗產量比，由大腸桿菌向培養基中分泌正確折疊形式的目的蛋白質的方法將是值得期望的。然而，至今這只是在一些特例中獲得成功。
國際專利申請PCT/EP00/08537描述了這種特例。當利用特異分泌信號序列時，利用大腸桿菌成功地合成和分泌了克級的lepirudin(藥物Refludan的活性成分)。德國專利申請No.100 33 195.2(未發表)描述了一種雙功能蛋白質，其包括蛭素和蛭素衍生物以及來源于壁虱的Xa因子抑制劑及其衍生物。所述蛋白質同樣可以利用大腸桿菌大量合成和分泌。除這一發現之外，隨后又令人驚訝地發現蛭素不僅僅可以以TAP融合蛋白質的形式大量分泌，而且也可作為與多肽(諸如胰島素原衍生物)的融合蛋白質的一部分而大量分泌；還發現其具有生物學活性并且令人吃驚地，融合部分諸如胰島素原以正確的三維結構存在。由于可以省卻經細胞內表達后再進行體外折疊的步驟(所述步驟可造成不可忽略的產量損失)，以及由此導致的更簡單的蛋白質純化方法，這一出乎意料的結果使得利用細菌宿主/載體系統以更節約成本的方法生產諸如胰島素等成為可能。另一優勢是不需加入離液輔助劑來溶解融合蛋白質，而在傳統方法中利用大腸桿菌生產胰島素時這是必須的。生態學上，這通過避免相應廢物從而導致更少的環境污染。
蛭類(Hirudo)中的水蛭已經形成了例如多種凝血酶抑制劑蛭素同工型。蛭素通過分子的人為變異(例如N-末端氨基酸的改變)已進行了優化以適應藥學需要(見EP-A 0 324 712)。
本發明包括在形成融合蛋白質(例如與猿猴胰島素原或其衍生物)時蛭素和蛭素變體的使用。本發明特定實施方案使用一種天然蛭素同工型(所有天然蛭素同工型總稱為“蛭素”)。天然同工型有例如Val-Val-蛭素或Ile-Thr-蛭素。本發明其它實施方案使用天然蛭素同工型的變體。變體來源于天然蛭素同工型，但其與天然同工型相比含有例如氨基酸添加和/或氨基酸缺失和/或氨基酸改變。蛭素變體可以含有天然蛭素同工型的交替肽片斷和新的氨基酸。蛭素變體為人所公知并被描述在例如DE 3 430 556中。蛭素變體可以以蛋白質的形式通過商業途徑得到(CalbiochemBiochemicals，目錄號377-853，-950-960)。
胰島素為具有51個氨基酸的多肽，所述51個氨基酸分布于兩條氨基酸鏈上21個氨基酸的A鏈和30個氨基酸的B鏈。兩條鏈彼此通過2個二硫橋連接。多年來胰島素組合物被用于糖尿病治療。這不僅包括使用天然胰島素，還包括使用胰島素衍生物和類似物。
胰島素衍生物為天然胰島素(即人胰島素或動物胰島素)的衍生物，其通過至少一個天然氨基酸殘基的置換和/或至少一個氨基酸殘基和/或有機殘基的添加而與相應天然胰島素不同，否則，所述胰島素衍生物與天然胰島素相同。總的來說，胰島素衍生物與人胰島素相比具有稍有不同的作用。
起效加速的胰島素衍生物在EP 0 214 826、EP 0 375 437和EP 0 678522中描述。EP 0 214 826等涉及B27和B28的置換。EP 0 678 522描述了在B29位具有不同氨基酸(優選脯氨酸，但不為谷氨酸)的胰島素衍生物。EP 0 375 437涉及在B28位為賴氨酸或精氨酸的胰島素衍生物，如需要，其還可以在B3和/或A21進行額外修飾。
EP 0 419 504公開了胰島素衍生物，其通過B3位的天冬酰胺和A5、A15、A18或A21位的至少一個其它氨基酸的修飾對化學修飾產生耐受性。
WO 92/00321描述了在B1-B6位至少一個氨基酸被賴氨酸或精氨酸替代的胰島素衍生物。根據WO 92/00321，這種胰島素展現出延長的作用。
當利用基因工程生產胰島素和胰島素衍生物時，經常表達胰島素前體，即“胰島素原”，其包含B、C和A鏈。所述胰島素原經適當和正確折疊以及形成二硫橋后可以通過酶促或化學去除C鏈而轉變為胰島素或胰島素衍生物。胰島素原經常以融合蛋白質形式表達。“不想要的”融合部分同樣需要化學或酶促去除。
對本領域熟練技術人員顯而易見的是，重組細胞的培養、增殖和發酵方法取決于所選擇的重組宿主/載體系統。這同樣是本發明的主題。
此融合蛋白質在酸性培養基中顯示出令人驚訝地良好溶解性，這導致在此蛋白質的化學后處理方面的獨特優勢。首先，上清液中許多不需要組分可在所述條件下沉淀，而其次肽酶或蛋白酶在所述條件下失活。因此，在操作的最后，酸化發酵肉湯將使以下成為可能，即從融合蛋白質中直接分離不需要的上清液蛋白質連同宿主細胞，以及在進一步的步驟中濃縮所述融合蛋白質。這同樣是本發明的主題。
在發酵的最后，折疊過程可能不會100％完全。添加硫醇或例如鹽酸半胱氨酸可以使此過程完全。這同樣是本發明的主題。
如果這兩個蛋白質通過內切蛋白酶特異識別的氨基酸接頭融合，那么目的蛋白質就可以直接以活性形式切下，其中所述內切蛋白酶僅在氨基酸接頭處而不在其它位置有效切割融合蛋白質。在生產胰島素時，蛭素和胰島素原之間的接頭優選在其羧基末端含有精氨酸。這樣就使得可在同時的處理中利用胰蛋白酶的轉換作用來切除融合部分以及將胰島素原轉變為單或雙-Arg-胰島素。所述接頭必須相對于胰島素加工過程進行優化以使蛭素部分的切除不慢于連接胰島素B和A鏈的C肽序列或其衍生物的切除。這同樣是本發明的主題。可用的表達系統的例子有載體pJF 118，其描述在歐洲專利0 468 539的
圖1中。
含有編碼胰島素原或胰島素原衍生物的DNA序列的質粒在例如專利EP-A 0 489 780和PCT/EP 00/08537中描述。
含有蛭素序列的質粒pK 152(根據EP-A 0 324 712)被用作蛭素DNA序列的來源。
與跨過細菌內膜有關的目的蛋白質的輸出相容性對分泌而言非常重要。在這一點，選擇對不同蛋白質而言或多或少為最佳的信號序列非常重要，專利申請PCT/EP00/08537描述了基于PCR的信號序列篩選系統。既然蛭素活性令人驚訝地保持完整并且由此可以通過凝血酶抑制試驗在上清液中容易地檢測到，這一系統也可以應用于以蛭素作為N端融合部分的融合蛋白質上。
于是，本發明涉及編碼融合白質的DNA(替代術語表達盒)，其具有-F-Asm-Rn-Y-的形式，其中F為編碼氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列允許蛋白質Y分泌至發酵培養基，As為化學鍵或編碼可由遺傳密碼編碼的氨基酸的DNA序列，m為0-10的整數R為化學鍵或精氨酸密碼子，n為0或1，并且Y為編碼目的蛋白質的DNA序列，在發酵培養基中所述目的蛋白質正確折疊并且為融合蛋白質的一部分，其中尤其選擇編碼蛭素或其衍生物(F)和胰島素原或其衍生物(Y)的DNA序列。
本發明還涉及P-S-F-Asm-Rn-Y-T形式的表達盒(替代術語DNA分子)，其中P為啟動子，S為編碼信號序列的DNA序列，所述信號序列可導致最優產量，T為可增強表達的非翻譯DNA序列。
本發明還涉及含有上述表達盒的質粒，并且還涉及含有所述質粒的宿主細胞或優選含有整合至宿主基因組中的表達盒的宿主細胞，所述宿主細胞選自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.substilis)和鏈霉菌(Streptomyces)。
本發明也涉及發酵生產上述融合蛋白質的方法，在所述方法中(a)如上所述的DNA分子在如上所述的宿主細胞中表達，并且(b)分離表達的融合蛋白質；特別地，在所述方法中，將上清液與宿主細胞分開以分離表達蛋白質，然后將表達蛋白質從上清液中分離出來；在所述方法中，用于沉淀后濃縮上清液中的表達蛋白質的步驟選自微量過濾、疏水相互作用層析和離子交換層析；在所述方法的一個特定實施方案中，分離表達蛋白質包括將培養基或上清液中的組分沉淀而使表達蛋白質保持在溶液中的步驟；在所述方法的本發明另一優選實施方案中，發酵后，向pH 6-9的發酵上清液中加入硫醇或鹽酸半胱氨酸，產生0.05到2.5mM的游離SH基濃度。
本發明的一個特定實施方案包括從宿主細胞中分離發酵上清液，進一步在新鮮培養基中培養宿主細胞并從上清液中分離釋放的融合蛋白質。換言之，本發明另一實施方案為如上所述的方法，在所述方法中，從宿主細胞分離發酵上清液后，將宿主細胞在新鮮培養基中重復培養，并且從培養過程中獲得的每一上清液中分離釋放的融合蛋白質。
本發明還涉及生產胰島素或胰島素衍生物的方法，在該方法中，(a)從通過如上所述方法獲得的表達蛋白質中(b)利用酶促或化學切割釋放目的蛋白質，尤其是胰島素或胰島素衍生物，并且(C)將目的蛋白質分離。
下述實施例用于更詳盡描述本發明，而無意限制本發明。
實施例1附加于來自熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)oprF基因產物的信號序列之后的lepirudin-GNSAR-猿猴胰島素原融合蛋白質的構建專利申請PCT/EP00/08537實施例2描述了一種用于大腸桿菌的表達載體，其通過熒光假單胞菌oprF基因產物的信號序列使Refludan表達和分泌至培養基中(De，E.等人，FEMS微生物學通訊(FEMS MicrobiolLett.)，127，263-272，1995)。這一載體用于構建Refludan-GNSAR-猿猴胰島素原融合蛋白質(GNSAR＝SEQ ID NO.1)，并且將其定義為pBpfu_hir。
另外的起始材料為pJF118(EP 0468 539)和pK152(PCT/EP00/08537)質粒DNA。下列寡核苷酸為必需引物pfuf15′GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca3′(SEQ ID NO.2)引物insu11HindIII5′-TTTTTAAGCT TCATGTTTGA CAGCTTATCA T-3′(SEQ ID NO.3)引物Hir_insf15′ATCCCTGAGG AATACCTTCA GGGAAATTCG GCACGATTTG TG-3′(SEQ IDNO.4)引物Hir_insrev15′-CACAAATCGT GCCGAATTTC CCTGAAGGTA TTCCTCAGGG AT-3′(SEQ IDNO.5)引物pfuf1與表達載體上編碼信號序列與lepirudin的接點的DNA區域雜交。
引物Hir_insrev1中顯示為粗體的部分與質粒pINT90d上編碼前胰島素原和猿猴胰島素原序列的接點的DNA區域雜交，并且與質粒pK152上蛭素序列的3’末端序列雜交。引物Hir_insrev1與引物Hir_insf1 100％互補。
引物insu11HindIII標明了克隆在pINT90d中并編碼猿猴胰島素原序列的DNA區域的3’末端，并額外帶有限制酶HindIII識別的六核苷酸序列。
利用Hir_insf1/Insu11hindIII引物對和質粒pINT90d為模板以及利用pfuf1/Hir_insrev引物對和質粒pBpfu_hir為模板進行兩個標準聚合酶鏈式反應。將兩反應產物混和，并取出一小份利用引物pfuf1/Insu11HindIII進行第三個聚合酶鏈式反應。結果為含有信號(部分)-lepirudin-GNSAR-猿猴胰島素原序列的DNA產物。將DNA片斷利用限制酶BamH I和HindIII消化，其中BamH I在lepirudin序列中而HindIII在胰島素原編碼序列的3’末端切割。
在平行的反應中，載體pBpfu用所述兩個酶消化并分離大的載體片斷。兩反應的分離產物在T4連接酶反應中連接。利用連接混合物轉化大腸桿菌菌株K12 Mc1061感受態細胞(Sambrook等人，分子克隆(MolecularCloning)(冷泉港實驗室出版社Cold Spring Habor Laboratory Press)1989)并涂布至含有25μg/ml氨芐青霉素的NA平板上。從轉化體中分離質粒DNA進行鑒定。同時，將經質粒分析鑒定的轉化體制平板以保種。DNA通過限制性分析和DNA序列分析進行鑒定。鑒定為正確的質粒命名為pBpfuHir_Ins。
實施例2附加至鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)外膜蛋白質(fimD)信號序列后的Ser-蛭素-GNSAR-猿猴胰島素原融合蛋白質的構建構建根據實施例1所述方案進行。
專利申請PCT/EP00/08537實施例10描述了通過鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白質信號序列(Rioux，C.R.，Friedrich，M.J.和Kadner，R.J.；細菌學雜志(J.Bacteriol.)172(11)，6217-6222(1990))用于輸出lepirudin的載體的構建。所產生的質粒命名為pBstyfim_hir，用于實驗目的。質粒pK152和pINT90d的DNA在各自場合作為模板。
構建需要4個引物。
引物insu11HindIII、Hir_insf1和Hir_insrev1如實施例1所述。
引物styfimf1為新合成的，并且其序列如下5′CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC CTCTacgtatactgactgcaCTG 3′(SEQ ID NO.6)
顯示為粗體的DNA三聯體表示絲氨酸密碼子。其結果產生在氨基酸序列的1位由絲氨酸代替亮氨酸的蛭素。
與實施例1相類似，用Hir_insf1/Insu11HindIII引物對及質粒pINT90d為模板以及利用styfimf1ser/Hir_insrev引物對及pK152 DNA為模板進行兩個標準聚合酶鏈式反應。將兩反應產物混和，并取出一小份利用引物styfimf1ser/Insu11HindIII進行第三個聚合酶鏈式反應。結果為含有信號(部分)-Ser-蛭素-GNSAR-猿猴胰島素原序列的DNA產物。將DNA片斷利用限制酶BamH I和HindIII消化。
在平行的反應中，載體pBstyfim_Hir用所述兩個酶消化并將大的載體片斷分離出來。兩反應的分離產物在T4連接酶反應中連接。利用連接混合物轉化大腸桿菌菌株K12 Mc1061感受態細胞。從轉化體中分離質粒DNA進行鑒定。同時，將經質粒分析鑒定的轉化體制平板以保種。DNA通過限制性分析和DNA序列分析進行鑒定。鑒定為正確的質粒命名為pBstyfim_SerHir_Ins。
實施例3附加至大腸桿菌堿性磷酸酶前體蛋白質信號序列之后的Ala-蛭素-R-猿猴胰島素原融合蛋白質的構建大腸桿菌堿性磷酸酶前體蛋白質具有信號序列MKQSTIALAL LPLLFTPVTK A(SEQ ID NO.7)(Shuttleworth H.，Taylor J.，Minton N.；Nucleic Acids Res.148689，(1986)).
此肽序列通過GCG程序Backtranslate(Wisconsin Package 10.1版，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)使用大腸桿菌高密碼子使用標準翻譯成DNA。
這產生下述序列5′ATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAGCG 3′(SEQ ID NO.8)
為將此序列克隆并加至編碼蛭素(其特征在于1位為丙氨酸(EP-A 0448 093))的DNA序列上，所述序列由以下顯示為粗體的序列延長5′TTTTTTGAATTCATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAG-CGGCTacgtat actgactgcaCTG(SEQ ID NO.9)如下部分重疊的兩寡核苷酸序列即來源于此。
引物phoaf1具有以下序列5′CTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAGCGGCTACGTATACTGACTGCACTG-3′(SEQ ID NO.10)引物phoaf2具有以下序列5′TTTTTTGAATTCATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTG-3′(SEQ ID NO.11)表達載體的構建需要引物insu11HindIII、Hir_insf2和Hir_insrev2以及質粒pK152、pINT90d和pJF118的DNA。
引物Hir_insf2具有以下序列5′-ATCCCTGAGGAATACCTTCAGcgaTTTGTGAACCAGCAC C -3′(SEQ ID NO.12)引物Hir_insrev2具有以下序列5′-GGTGCTGGTTCACAAAtcgCTGAAGGTA TTCCTCAGGG AT-3′(SEQ ID NO.13)粗體中的大寫字母表示與胰島素原雜交的序列，而普通字體中的大寫字母表示與蛭素序列3’末端重疊的序列。帶有下劃線的粗體小寫字母表示接頭精氨酸的密碼子。
與實施例1相類似，利用Hir_insf1/Insu11HindIII引物對及質粒pINT90d的DNA為模板以及利用phoaf1/Hir_insrev引物對及pK152 DNA為模板進行兩個標準聚合酶鏈式反應。將兩反應的產物混和，并取出一小份利用引物phoaf1/Insu11HindIII進行第三個聚合酶鏈式反應。結果為含有信號-Ala-蛭素-GNSAR-猿猴胰島素原序列的DNA產物。將DNA片斷利用限制酶BamH I和HindIII消化。在平行的反應中，載體pJF118用所述兩個酶消化并分離大的載體片斷。兩反應的分離產物在T4連接酶反應中連接。利用連接混合物轉化大腸桿菌菌株K12 Mc1061感受態細胞。并且從轉化體中分離質粒DNA進行鑒定。同時，將經質粒分析鑒定的轉化體制平板以保種。DNA通過限制性分析和DNA序列分析進行鑒定。鑒定為正確的質粒命名為pNS22。
實施例4凝血酶抑制試驗蛭素濃度根據Grieβbach等人(血栓形成研究(ThrombosisResearch)37，347-350頁，1985)的方法確定。為此，測定中包括特定量的Refludan標準以建立校正曲線，從所述曲線可直接確定產物的量(mg/l)。生物學活性也是對融合蛋白質中胰島素原組分正確折疊的直接測定。或者，可以利用金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白質水解消化和隨后RP-HPLC系統的分析來確定正確S-S橋形成。
實施例5融合蛋白質的表達重組細胞在含有100μg/ml氨芐青霉素的2YT培養基(每升16克胰蛋白胨、10克酵母提取物、5克NaCl)中培養過夜。將過夜培養物用新鮮培養基1∶50稀釋并將細胞培養至密度為約0.8OD600。
然后通過添加IPTG至0.05-2mM來誘導表達。以這種方式誘導的細胞進一步孵育3-26小時。
3小時后，可清楚地測量到上清液中蛭素的抗凝血酶作用。由于經考馬斯亮藍染色后的SDS PAGE顯示只有在誘導細胞中有可在Western印跡分析中與多克隆抗胰島素抗體反應的新條帶，因此所述作用歸因于目的融合蛋白質的分泌。在發酵實驗中，誘導只在培養至顯著高的光密度時開始。此處優選基于基本培養基的合成培養基。
細胞生產力可以通過利用抽取細菌“奶”(milking)的原理增加，即通過在最佳誘導時間后，小心從上清液中移去細胞并進一步將細胞在新鮮培養基中孵育，然后可以向該培養基中再次加入誘導劑。之后平行地從收獲的上清液中制備胰島素。
實施例6融合蛋白質的純化誘導完畢后，將細胞上清液調節至pH 2.5-3，并通過離心或過濾將細胞和上清液組分除去。將沉淀后的上清液加至陽離子交換柱(S-Hyper DF，Source 30S)上并在30％2-丙醇存在下利用150到450mM NaCl線性梯度于pH 3.5進行分級分離。各級分利用RP-HPLC方法分析。胰島素原-蛭素融合蛋白質在約300mM的NaCl濃度處洗脫下來。將足夠純的級分合并，用0.1％TFA稀釋并利用泵將其加至RP柱(PLRP-S 7.5×50mm)上。洗脫利用25-50％乙腈梯度進行。合并兩組級分。去除溶劑后將材料凍干。通過SDS聚丙烯酰胺電泳檢查材料的純度。純化的融合蛋白質利用質譜(ESI)分析。通過實驗確定的融合蛋白質分子量與去除信號肽后其理論預期分子量相符。
實施例7二硫橋連接的確定用胰蛋白酶消化融合蛋白質，并將形成的片斷通過RP-HPLC方法以及隨后利用質譜方法分析。標識為de-(B30)胰島素的片斷基于其5706 Da的質量被成功鑒定。這一產物用金黃色葡萄球菌(S.aureus)V8蛋白酶消化。RP-HPLC分析顯示出預期的肽譜。
胰蛋白酶切割按照以下所述進行將凍干的融合蛋白質溶于50mM Tris-HCl pH 8(1mg/ml)，并加入胰蛋白酶(每mg融合蛋白質1μg)。在反應結束后，pH調至3以失活胰蛋白酶。
金黃色葡萄球菌(S.aureus)消化按照以下所述進行分離的de-(B30)胰島素于pH 8溶于水，加入金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白酶(胰島素量的1/50)。并將混合物于37℃孵育5小時，而后室溫過夜。
實施例8胰島素的純化不同于上清液中大多數其它由于宿主細胞自發裂解或是由于分泌而存在的多肽，融合蛋白質令人驚訝地在pH2.5-3.5條件下不沉淀。因此培養基就可以適當酸化，并且隨后在沉淀作用完成后通過離心或微量過濾除去沉淀和細胞，并進行濃縮。
隨后，將培養基調節至pH 6.8，并且平行地通過分析性HPLC測定法確定融合蛋白質含量。測定后向上清液中加入胰蛋白酶使其約為每1-1.5mg融合蛋白質1μg。在室溫下孵育約4小時后，純化利用陽離子交換樹脂在2-丙醇存在下、pH 3.5進行。洗脫通過在緩沖液中應用0.15至0.45M的梯度進行。
雙-Arg-胰島素在約0.3M處洗脫。經1∶1稀釋后，雙-Arg-胰島素通過添加10％強度ZnCl2溶液于pH 6.8從含胰島素的級分中沉淀出來。將胰島素濾出并隨后將其溶于0.05M Tris-HCl(pH 8.5)而產生2mg/ml的溶液。
隨后向每100ml溶液中加入約1單位羧肽酶B，并在反應進行時輕微攪動。然后用檸檬酸調節pH至5.5，并將胰島素在ZnCl2存在下結晶。將結晶移出、溶解，經RP-HPLC純化后，胰島素再經結晶純化。
實施例9在培養基中直接處理融合蛋白質在表達期的最后，將培養基調節至pH 6.8并隨后邊攪動邊加入胰蛋白酶至每升4-8mg。孵育約4小時后，將以此方式處理的發酵肉湯調節至pH 2.5-3。沉淀1-6小時后，將pH升至3.5，并通過陽離子交換層析在30％2-丙醇存在下純化形成的雙-Arg-胰島素。洗脫通過0.05-0.5M的NaCl梯度進行。含有產物的級分用水1∶1稀釋并隨后加入ZnCl2，使之形成0.1％強度的ZnCl2溶液。雙-Arg-胰島素在pH 6.8時沉淀然后可例如根據實施例8轉變為胰島素。
實施例10用于融合蛋白質分泌的其它信號序列利用專利申請PCT/EP00/08537描述的技術可以檢測到能導致蛭素-胰島素原融合蛋白質分泌的其它信號序列信號序列smompa，其來源于粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)的主要外膜蛋白質的ompA基因(GenEMBL數據庫定位SMOMPA，1364bpDNA BCT 30-3-1995)信號序列ecoompc，其來源于大腸桿菌編碼主要外膜蛋白質的ompC基因(GenEMBL數據庫定位SMOMPA，1364bp，DNA BCT 30-3-1995)信號序列af009352，其來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)osmoprotectant結合蛋白前體(opuCC)(GenEMBL數據庫定位AF009532，4500bp，DNA BCT 23-7-1997)信號序列aeoxyna，其來源于豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)編碼木聚糖酶I前體的xynA基因(GenEMBL數據庫定位AEOXYNA，1139bp，DNA BCT 07-2-1999)信號序列stomps1，其來源于鼠傷寒沙門氏菌(S.typhi)編碼外膜蛋白質S1的基因(GenEMBL數據庫定位STOMPS1，1938bp，DNA BCT24-8-1995)
序列表序列表<110>安萬特醫藥德國有限公司(Aventis Pharma Deutschland GmbH)<120>用于向細菌培養物上清液中分泌目的蛋白質的融合蛋白質<130>DEAV2001/0009<140>10108212.6<141>2001-02-20<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pBpfu_hir<400>1Gly Asn Ser Ala Arg1 5<210>2<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pfuf1<400>2ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述insu11hindlll<400>3tttttaagct tcatgtttga cagcttatca t31<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Hir_insf1<400>4atccctgagg aataccttca gggaaattcg gcacgatttg tg42<210>5<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Hir_insrev1<400>5cacaaatcgt gccgaatttc cctgaaggta ttcctcaggg at42<210>6<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述styfimf1<400>6cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ctctacgtat actgactgca 60ctg 63
<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述堿性磷酸酶(信號序列)<400>7Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr1 5 10 15Pro Val Thr Lys Ala20<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述堿性磷酸酶(信號序列)<400>8atgaaacagt cgaccatcgc gctggcgctg ctgccgctgc tgttcacccc ggttaccaaa 60gcg 63<210>9<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述克隆片段<400>9ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttcacc 60ccggttacca aagcggctac gtatactgac tgcactg 97<210>10<211>58
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述phoaf1<400>10ctgctgccgc tgctgttcac cccggttacc aaagcggcta cgtatactga ctgcactg 58<210>11<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述phoaf2<400>11ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctg 54<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Hir_insf2<400>12atccc tgagg aataccttca gcgat t tgtg aaccagcacc 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Hir_insrev2<400>13ggtgctggtt cacaaatcgc tgaaggtatt cctcagggat 40
權利要求
1.編碼融合蛋白質的DNA，其具有-F-Asm-Rn-Y-形式，其中，F為編碼氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列使得蛋白質Y可分泌至發酵培養基中，As為化學鍵或編碼可由遺傳密碼編碼的氨基酸的DNA序列，m為0-10的整數，R為化學鍵或精氨酸密碼子，n為0或1，并且Y為編碼目的蛋白質的DNA序列，在發酵培養基中所述目的蛋白質正確折疊并且為融合蛋白質的一部分。
2.根據權利要求1所述的DNA，其中表達盒為P-S-F-Asm-Rn-Y-T的形式，其中P為啟動子S為編碼信號序列的DNA序列，所述信號序列可導致最優產量，T為可使表達增強的非翻譯DNA序列。
3.根據權利要求2所述的DNA，其中S為來源于熒光假單胞菌的oprF基因；編碼鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白質(fim D)的信號序列的DNA；編碼大腸桿菌堿性磷酸酶前體蛋白質的信號序列的DNA序列；編碼信號序列smompa的DNA序列，所述信號序列smompa來源于粘質沙雷氏菌編碼主要外膜蛋白質的ompA基因；編碼信號序列ecoompc的DNA序列，所述信號序列ecoompc來源于大腸桿菌編碼主要外膜蛋白質的ompC基因；編碼信號序列af009352的DNA序列，所述信號序列af009352來源于枯草芽孢桿菌osmoprotectant結合蛋白前體(opuCC)；編碼信號序列aeoxyna的DNA序列，所述信號序列aeoxyna來源于豚鼠氣單胞菌編碼木聚糖酶I前體的xynA基因；或者編碼信號序列stomps1的DNA序列，所述信號序列stomps1來源于鼠傷寒沙門氏菌編碼外膜蛋白質S1的基因。
4.根據權利要求2或3任一所述的DNA，其中DNA序列F為lepirudin、Ser-蛭素或Ala-蛭素。
5.根據權利要求2至4任一所述的DNA，其中目的蛋白質Y為胰島素原、胰島素或其衍生物。
6.蛋白質，其由權利要求1至5任一所述的DNA所編碼。
7.質粒，其含有權利要求1至5任一所述的DNA。
8.宿主細胞，其含有權利要求7所述的質粒。
9.宿主細胞，其含有權利要求1至5任一所述的DNA。
10.根據權利要求8或9所述的宿主細胞，其中細胞選自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌，并且權利要求7所述的質粒和權利要求1至5任一所述的DNA任選地整合至宿主細胞的基因組中。
11.發酵生產融合蛋白質的方法，在該方法中(a)權利要求1至5任一所述的DNA分子在權利要求8至10任一所述的宿主細胞中表達；并且(b)將表達的融合蛋白質分離。
12.根據權利要求11所述的方法，其中將上清液與宿主細胞分開以分離表達的蛋白質，然后將表達的蛋白質從上清液中分離出來。
13.根據權利要求11或12任一所述的方法，其中用于在沉淀后濃縮上清液中的表達蛋白質的步驟選自微量過濾、疏水相互作用層析和離子交換層析。
14.根據權利要求11至13之任一所述的方法，其中表達蛋白質的分離包括步驟沉淀培養基或上清液中的組分而使表達蛋白質保持在溶液中。
15.根據權利要求11至14之任一所述的方法，其中發酵后，于pH 6-9向發酵上清液中加入硫醇或鹽酸半胱氨酸，產生濃度為0.05到2.5mM的游離SH基團。
16.根據權利要求11至15之任一所述的方法，其中在從宿主細胞分離出發酵上清液后，將宿主細胞在新鮮培養基中重復培養，并從培養中獲得的每一上清液中將釋放的融合蛋白質分離出來。
17.根據權利要求11至15之任一所述的方法，其中于pH 6-9向細胞培養物的上清液中加入硫醇或鹽酸半胱氨酸，使游離SH基團的濃度達到0.05到2.5mM。
18.生產胰島素或胰島素衍生物的方法，其中a)根據權利要求11至17任一所述的方法獲得表達的蛋白質，b)利用酶促或化學切割的方法釋放目的蛋白質，尤其是胰島素或胰島素衍生物，并且c)將其分離。
全文摘要
本發明涉及包含融合部分和目的蛋白質的融合蛋白質，兩種蛋白質的聯合導致融合蛋白質分泌至細菌宿主的上清液中，而且目的蛋白質以其正確的三維結構存在。
文檔編號A61P3/10GK1529757SQ02806850
公開日2004年9月15日 申請日期2002年2月8日 優先權日2001年2月20日
發明者P·哈伯曼, J·埃特爾, P 哈伯曼, 囟 申請人:安萬特醫藥德國有限公司