專利名稱：懸浮共培養將人參總dna導入馬鈴薯單細胞的方法
技術領域：
本發明涉及作物分子育種領域，特別是涉及馬鈴薯的分子育種方法，具體涉及一 種采用懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞獲得馬鈴薯轉基因植株的方法。
背景技術：
植物分子育種是不經過有性過程，將外源DNA導入受體植物，產生可遺傳的變異， 以選育帶有目的性狀的優良品種的育種技術(周光宇等，中國農業科技出版社，1993)。它 克服了常規育種方法周期長、預見性差、選擇效率低的局限性，可以打破物種界限，實現優 良基因重組和聚合，能夠對農作物新品種定向選育，使得分子育種成為育種研究的熱點。人參作為貴重藥材之一，應用于中醫臨床已有兩千多年的歷史，具有廣泛的藥理 作用和醫療用途。研究表明，從人參中分離出的人參皂苷被認為是人參主要的有效成分之 一，其中人參皂苷RBl在抗氧化、清除氧自由基、心血管系統以及逆轉腫瘤細胞耐藥等方面 有較強活性。馬鈴薯是全世界主要糧食作物之一，具有生育期短、產量高、適應性強等特點， 越來越受到全世界的廣泛重視。但由于馬鈴薯普通栽培品種是同源四倍體，遺傳組成的復 雜性和遺傳背景的狹窄制約馬鈴薯育種發展的主要因素，常規育種進展緩慢。1974年，周光宇提出“DNA片段雜交”假設，并模擬遠緣雜交外源DNA通過花粉管 路線，培育成棉花和水稻新品種。應用“花粉管通道法”、“浸苗法”等方法將外源DNA導入 植物已成為一種新的有效的遺傳轉化方法。總DNA直接導入法逾越了常規育種中的生殖障 礙，彌補了細胞工程技術繁瑣、植株再生頻率低、后代群體小，難以篩選的缺陷，被公認是實 現遠緣雜交的有效途徑，并在多種作物中得到了能穩定遺傳的優良品系。朱生偉等應用“浸 苗法”成功地將外源DNA導入煙草，導入后代在形態、品質和成分等方面已產生廣泛的變異。隨著基因工程技術的發展，植物功能基因分離技術也不斷完善。Witty等用發根農 桿菌介導的轉化方法獲得了轉甜蛋白基因(thaumatin)的馬鈴薯，并檢測到了活性甜蛋白 的表達。盛萬民等把類型I和類型II的240ku蛋白基因的5’端啟動子序列(2. 5ku)連接 到T質粒雙元載體PBl 101. 1的β-葡糖苷酸酶(⑶S)基因上，轉入農桿菌株LBA4404，對馬 鈴薯進行轉化，獲得了蛋白質高水平表達的轉基因植株。從這些報道顯示，雖然采用1-2個 已知功能的基因導入馬鈴薯的確能夠提高塊莖的蛋白質含量和質量，但步驟繁瑣、轉化效 率低、提高的幅度最高也僅為20%，且抗生素等抗性選擇標記還可能存留。洪亞輝等以馬鈴薯愈傷組織的小細胞團作為受體，利用靜止的浸泡共培法導入人 參總DNA，雖然得到轉化體植株，但轉化效率極低，僅為2-3%，且轉化后代的蛋白質含量并 沒有提高。而采用懸浮共培養將外源DNA導入單細胞的方法來改良作物品質的操作在馬鈴 薯方面從未有人嘗試過。因此，本領域中仍然需要一種新的大幅度提高馬鈴薯蛋白質含量 的方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種快速且操作簡便的懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞的方法，可改良馬鈴薯的營養品質。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種懸浮共培養將人參總 DNA導入馬鈴薯單細胞的方法，該方法包括如下步驟(1)、馬鈴薯細胞懸浮培養物的培養將長為0. 8-1. 2cm的馬鈴薯莖段滅菌后接種 到置放有誘導培養基的三角瓶中，每瓶接種6-7塊，該誘導培養基是MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，培養條件為溫度25_28°C，光照3000Lux，光照時間12_14h/ d，培養10天；再繼代培養5天，繼代次數為1次，選取莖段兩側膨大顯著、莖段中部增粗、外 觀疏松、顏色呈亮黃色的愈傷組織作為懸浮細胞，轉移到液體懸浮培養基MS+NAA 0. 4mg/ L+6-BA2mg/L+蔗糖30g/L中，在搖床100-120轉/min，25-28 °C，黑暗條件下，培養3_5天 后，將三角瓶壁上的細胞全部刮取下來，移入到體積比為2 1的新舊混合的液體懸浮培養 基MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，懸浮培養2_4天，繼代1次(通過刮取瓶 壁上的細胞獲得馬鈴薯細胞懸浮培養的繼代材料，并通過鏡檢觀察，篩選分散性好的細胞 作為繼代培養)；O)、分離懸浮細胞中的單細胞先選用孔徑為30目細胞篩過濾除去細胞懸浮培 養物中的大愈傷組織，再根據鏡檢觀測的細胞大小選用孔徑為60-120目的第二層細胞篩 濾去小細胞團，然后選用孔徑為300目的第三層細胞篩得到分散的單細胞懸浮液，最后選 用孔徑為400目細胞篩過濾除去懸浮液中的雜質，得到馬鈴薯單細胞；(3)、人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養獲得人參總DNA，人參總DNA的濃度 為350-400ug/ml ；將人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養，培養條件為搖床120-150轉/ min，溫度 2548°C，培養液為 MS+NAA 0. 5mg/L+6-BA 2mg/L+ 蔗糖 40g/L，黑暗培養 6-8 天；0)、獲得試管苗，經培養獲得種薯將共培養后的馬鈴薯單細胞轉到 MS+NAAO. 05mg/L+6BA 2. 0mg/L+GA3 5. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L 的分化培養基上誘導 單細胞不定芽分化，培養條件是溫度25-28 °C，光照3000LUX，光照時間14-Wh/d，將分化 出的不定芽轉到1/2MS+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L的生根培養基上誘導生根培 養，培養條件是溫度25-28°C，光照3000LUX，光照時間14_16h/d，獲得試管苗，進行RAPD 分子檢測，篩選出含有馬鈴薯對照體和人參供體相同條帶的試管苗作外植體再誘導愈傷組 織并分化、生根培養成苗，經培養獲得種薯。上述將馬鈴薯莖段滅菌是指將沖洗干凈的馬鈴薯莖段用體積濃度75%的乙醇消 毒30s，用0. 升汞溶液消毒7-8min，最后用無菌水漂洗3次。上述人參總DNA可以從人參組織如根、莖、葉、中獲得。從人參組織中獲得人 參總DNA的方法是本領域普通技術人員所熟知的，例如可采用(Bendich A. J，Plant Physiology, 1967,42 (7) :959-967)報道的快速提取植物組織DNA的方法來制備獲得人參 總DNA，只需獲得的人參總DNA的濃度為350-400ug/ml即可。在本發明方法中，RAPD分子檢測可采用本領域常規技術(王秀玲等，南開大學學 2003, 36 (2) 37-40)進行。在本發明方法中，馬鈴薯愈傷組織誘導培養、繼代培養、分化培養和生根培養方法 是本領域技術人員所熟知的，例如可參見(Lan S. L, Am Potato J，1977，54 :575-580)的 方法。在本發明方法中，獲得馬鈴薯種薯后，可采用常規方法(孫慧生，中國農業出版社， 2003,283-340)使馬鈴薯種薯生長并栽培獲得后代塊莖，然后選出蛋白質有所提高的單株進行播種，連續數代后得到遺傳性穩定的塊莖。馬鈴薯塊莖的蛋白質含量、氨基酸含量和 人參RBl的測定可用本領域常規技術進行(Samakana KI, Chem Pharm Bull, 1995,43(1) 137-141)。本發明方法中所用的人參和馬鈴薯并不局限于任何特定的品種(系)，但是為了 使馬鈴薯蛋白質含量有較大的提高，宜選用蛋白質含量較高的品系。另外，在選擇馬鈴薯品 系，應根據馬鈴薯抗病性、產量等性狀來選擇較好的馬鈴薯品種(系)作為受體。本發明建立了一種快速且操作簡便的改良馬鈴薯營養品質的方法，利用該方 法獲得的馬鈴薯第一代塊莖在蛋白質、總氨基酸、賴氨酸含量上最高可分別比對照提高 47. 96%,46. 13%、86.M%。而且，經過對其后代的表型分析，沒有發現其它明顯的表型變 異現象，其高產、抗病性等性狀并沒有因為塊莖蛋白質含量和質量的提高而發生變化，在后 代可獲得能夠穩定遺傳的高蛋白品系。
圖1是本發明的人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養的后代中人參皂苷RBl的 色譜圖。圖2是本發明的人參樣品中皂苷RBl的色譜圖。
具體實施例方式下面將以具體實例對本發明作進一步地說明實施例1在本實施例中，外源人參總DNA供體為新鮮人參，受體馬鈴薯由湖南省馬鈴薯工 程技術研究中心提供的高產、抗病性好的大西洋。1、將沖洗干凈的馬鈴薯莖段用體積濃度75%的乙醇消毒30s，用0. 升汞溶液 消毒7-8min，最后用無菌水漂洗3次，接種到誘導培養基中，每瓶接種6_7塊外植體，該 誘導培養基是MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA ang/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，，培養條件是溫度 25-28°C，光照3000LUX，光照時間12_14h/d，培養10天，再繼代培養5天(繼代1次)，選 取莖段兩側膨大顯著、莖段中部增粗、外觀疏松、顏色呈亮黃色的愈傷組織作為懸浮細胞培 養。2、馬鈴薯細胞懸浮培養的條件為搖床100-120轉/min，25-28 °C，黑暗培養 3-5天后將三角瓶壁上的細胞全部刮取下來，移入新舊混合的液體懸浮培養基(MS+NAA 0. 4mg+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L)，其體積比為2 1，懸浮培養2_4天，繼代1次(通過鏡檢 觀察，篩選分散性好的細胞作為繼代培養)。3、采用四層細胞篩過濾得到單細胞，首先選用孔徑為30目細胞篩過濾除去細胞 懸浮培養物中的大愈傷組織，再根據鏡檢觀測的細胞大小選用孔徑為120目的第二層細胞 篩濾去小細胞團，然后選用孔徑為300目的第三層細胞篩得到分散的單細胞懸浮液，最后 選用孔徑為400目細胞篩過濾除去懸浮液中的雜質，經鏡檢觀察得到馬鈴薯單細胞。4、將人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養，共培養條件為搖床120-150轉/min， 25-28"C，人參總 DNA 的濃度為 350_400ug/ml，培養基為 MS+NAAO. 5mg/L+6-BA 2mg/L+ 蔗 糖 40g/L，黑暗培養 6-8 天后，轉到 MS+NAA 0. 05mg/L+6BA2. 0mg/L+GA3 5. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+瓊脂8g/L的分化培養基上誘導單細胞不定芽分化，培養條件為溫度2548°C，光照 3000LUX，光照時間14-lMi/d，將分化出的不定芽轉到1/2MS+NAA 0. ang/L+蔗糖30g/L+瓊 脂8g/L的生根培養基上誘導生根培養，培養條件為溫度2548°C，光照3000LUX，光照時 間14-16h/d，獲得試管苗，進行RAPD分子檢測，篩選出含有馬鈴薯對照體和人參供體相同 條帶的試管苗作外植體再誘導愈傷組織并分化、生根培養成苗，經培養獲得種薯。其中，試 管苗可培養成215株完整植株，經檢測，轉基因植株為26株，轉化率是12. 1 %。5、從第一代材料中，篩選出蛋白質含量較高的單株分別進行播種，獲得第二代馬 鈴薯塊莖。再篩選出蛋白質含量較高的單株分別繼續種植獲得第三代馬鈴薯塊莖，同樣操 作收獲第四代塊莖。6、如表1所示，對轉化成功的第一代馬鈴薯后代塊莖中任意抽取5個單株塊莖，其 蛋白質含量比對照有明顯提高，方差分析顯示，與對照組都有極顯著的差異(P < 0.01)，第 一代塊莖蛋白質含量最高可比對照提高47. 96%。再分別對轉化和未轉化的馬鈴薯、人參樣 品進行人參皂苷RBl的測定中，檢測出轉化馬鈴薯和人參樣品中有相同的人參皂苷RBl峰 波，而在未轉化馬鈴薯中沒有檢測到此峰波(見圖1和圖2)。在檢測第一代馬鈴薯塊莖蛋白質含量的基礎上，對高蛋白單株的塊莖進行氨基酸 含量分析(結果見表1)。測定結果顯示，高蛋白變異后代隨著塊莖蛋白質含量增加的同時， 塊莖總氨基酸和各種氨基酸含量也有明顯提高。經直線相關分析顯示，馬鈴薯后代塊莖總 氨基酸含量也都呈正相關關系。對照塊莖賴氨酸含量為0. 52%，經人參總DNA與馬鈴薯單 細胞懸浮共培養后獲得的高蛋白馬鈴薯塊莖賴氨酸含量最高值達到0. 97%，比對照提高了 86. M%。第一代高蛋白材料又經過三代繼續種植篩選，在第四代獲得了蛋白質含量能夠穩 定遺傳的高蛋白株系。綜合四代的分析結果可以得知，采用懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞 的方法能夠提高塊莖的蛋白質含量和質量，而且效果很好。雖然導入人參的總DNA不是一個目的性非常明確的高蛋白基因，而且由于沒有抗 性標記基因協助篩選，從而增加了后期篩選的工作量。但從食品的安全性角度考慮，目前許 多可能存留抗生素等抗性選擇標記基因的轉基因作物的推廣已受到限制，而本發明中采用 懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞的方法培育的高蛋白馬鈴薯中不存在任何可 能影響動物或人類的不利基因，因此其推廣不會受到限制。在本發明實施過程中，對經過人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養的后代進行 表型分析，沒有發現其它明顯的表型變異現象，其高產、抗病性等性狀并沒有因為塊莖蛋白 質含量和質量的提高而發生變化，所以在后代可獲得能夠穩定遺傳的高蛋白品系。在本發 明中成功培育高蛋白馬鈴薯品系表明，將人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養的方法不 僅可以快速有效地提高馬鈴薯塊莖的蛋白質含量和質量，而且還能克服馬鈴薯高產與高蛋 白之間的負相關性。最后應說明的是以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，盡管參照 上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，依然可以對本發 明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應 涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。表1人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養的第一代馬鈴薯后代塊莖各氨基酸權利要求
1.一種懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞的方法，其特征在于該方法包括 如下步驟(1)、馬鈴薯細胞懸浮培養物的培養將長為0. 8-1. 2cm的馬鈴薯莖段滅菌后接種到置 放有誘導培養基的三角瓶中，每瓶接種6-7塊，該誘導培養基是MS+NAAO. 4mg/L+6-BA 2mg/ L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，培養條件是溫度25-28°C，光照3000Lux，光照時間12_14h/d， 培養10天；再繼代培養5天，繼代次數為1次，選取莖段兩側膨大顯著、莖段中部增粗、外 觀疏松、顏色呈亮黃色的愈傷組織作為懸浮細胞，轉移到液體懸浮培養基MS+NAA 0. 4mg/ L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，在搖床100-120轉/min，2548°C，黑暗條件下，培養3_5天 后，將三角瓶壁上的細胞全部刮取下來，移入到體積比為2 1的新舊混合的液體懸浮培養 基MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，繼代懸浮培養2_4天，繼代次數為1次； O)、分離懸浮細胞中的單細胞先選用孔徑為30目細胞篩過濾除去細胞懸浮培養物 中的大愈傷組織，再根據鏡檢觀測的細胞大小選用孔徑為60-120目的第二層細胞篩濾去 小細胞團，然后選用孔徑為300目的第三層細胞篩得到分散的單細胞懸浮液，最后選用孔 徑為400目細胞篩過濾除去懸浮液中的雜質，得到馬鈴薯單細胞；(3)、人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養獲得人參總DNA，人參總DNA的濃度為 350-400ug/ml ；將人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養，培養條件為搖床120-150轉/ min，溫度 2548°C，培養液為 MS+NAA 0. 5mg/L+6-BA 2mg/L+ 蔗糖 40g/L，黑暗培養 6-8 天； 、獲得試管苗，經培養獲得種薯將共培養后的馬鈴薯單細胞轉到MS+NAAO. 05mg/ L+6BA 2. 0mg/L+GA35. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L的培養基上誘導單細胞不定芽分化， 培養條件為溫度2548°C，光照3000LUX，光照時間14_16h/d，將分化出的不定芽轉到 1/2MS+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L的培養基上誘導生根培養，培養條件為溫度 2548°C，光照3000LUX，光照時間14_16h/d，獲得試管苗，進行RAPD分子檢測，篩選出含有 馬鈴薯對照體和人參供體相同條帶的試管苗作外植體再誘導愈傷組織并分化、生根培養成 苗，經培養獲得種薯。
2.如權利要求1所述的懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞的方法，其特征在 于所述步驟(1)中將馬鈴薯莖段滅菌是指將沖洗干凈的馬鈴薯莖段用體積濃度75%的乙 醇消毒30s，用0. 升汞溶液消毒7-8min，最后用無菌水漂洗3次。
全文摘要
一種懸浮共培養將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞的方法，該方法包括如下步驟馬鈴薯細胞懸浮培養物的培養；分離懸浮細胞中的單細胞；將人參總DNA與馬鈴薯單細胞懸浮共培養；獲得試管苗，經培養獲得種薯。本發明方法獲得的馬鈴薯后代塊莖中含有人參皂苷RB1，且氨基酸、蛋白質含量大幅度提高，而其他性狀并沒有因為塊莖蛋白質含量和質量的提高而變化。
文檔編號A01H4/00GK102124949SQ20101059571
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月20日 優先權日2010年12月20日
發明者洪亞輝, 熊興耀, 程鵬 申請人:湖南農業大學