一種適用馬鈴薯品種“川芋10號”轉基因方法
【專利摘要】本發明提供一種適用馬鈴薯品種“川芋10號”轉基因方法，該方法的特征在于第一天充分培養農桿菌，第二天按一定比例稀釋菌液繼續培養待OD600=0.3時取出，5000rpm離心3min，棄上清，加入液體MS重懸菌體。在超凈工作臺中將試管薯放在被少量無菌水浸濕的濾紙上，切成1-2mm厚的薄片（頂端和底部舍去），轉移試管薯切片至重懸菌體中浸染5min左右。然后將薯片移至無菌濾紙上吸干水分，接著將薯片平放入共培養基上，在24℃黑暗中共培養2d。共培養后，放入含500mg/L Cef+500mg/L Carb的無菌水中清洗3～4遍，吸干水分后轉入芽篩選培養基中。每隔12d左右換1次新鮮的芽篩選培養基。30d之后可見從薯肉中長出的芽，待芽長到2～3cm左右時，剪下接入生根篩選培養基中進行生根。
【專利說明】—種適用馬鈴薯品種“川芋10號”轉基因方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程【技術領域】，特別涉及一種適用馬鈴薯品種“川芋10號”轉基因方法。
【背景技術】
[0002]馬鈴薯(5b7a/w? tuberosum L.)是世界上繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物，具有產量高、營養豐富、可食用加工等特點。由于馬鈴薯普通栽培種是同源四倍體，遺傳組成的復雜性及遺傳背景的狹窄性是制約馬鈴薯育種發展的主要因素，因此，利用轉基因技術進行馬鈴薯的遺傳改良具有重要的意義。王清等通過研究發現通過轉基因技術在馬鈴薯中沉默PPO能降低塊莖的褐化，同時可以降低塊莖中酚物質的含量。湯莉等通過研究發現轉銅鋅超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶基因的馬鈴薯提高了對氧化和鹽脅迫的耐性，為培育抗逆性強的馬鈴薯品種奠定了重要基礎。目前進行馬鈴薯轉基因工作的前提是建立高效的轉基因體系，本發明的目的在于提供一種適用馬鈴薯品種“川芋10號”轉基因方法，該方法能高效的將外源基因轉入馬鈴薯品種“川芋10號”中。
【發明內容】
[0003]剪取試管苗帶1-2葉片莖段插入誘薯培養基中(9株/瓶)，接種好的試管苗在溫度為(18±2) °C，光照強度2000 lx、每天8h光/16h暗條件下培養6-8周左右后收獲試管薯。誘薯培養基的配方是MS+8%蔗糖+0.8%瓊脂+5mg/L CCC +0.5mg/L活性碳，PH值調至 5.8-6.0。
[0004]5mL液體LB中(含50 mg/L卡納霉素和50 mg/L利福平)，200rpm 28°C培養過夜。第二天按1:200的比例稀釋菌液于新鮮的液體LB中，繼續培養待0D600=0.Γθ.3時取出備用。
[0005]在超凈工作臺中將試管薯放在被少量無菌水浸濕的濾紙上，在其上將試管薯塊切成l_2mm厚的薄片(頂端和底部舍去)，并轉移至水中備用，以防止材料發生栓化。
[0006]取制備好的菌液,5000 rpm離心3min,棄上清,加入液體MS重懸菌體用于浸染。室溫下，轉移試管薯切片至重懸菌體中浸染5左右。其間不斷搖動以利于充分接觸。
[0007]侵染結束后將薯片移至無菌濾紙上吸干水分。然后將薯片平放入共培養基上，在24°C，黑暗中共培養2d。共培養基配方是MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂，PH值調至5.8-6.0。
[0008]共培養后,放入含500 mg/L Cef+500 mg/L Carb的無菌水中清洗3?4遍,吸干水分后轉入芽篩選培養基中。芽篩選培養基配方為MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA +0.25mg/L 2，4_D + 500 mg/L Cef + 500 mg/L Carb，PH值調至 5.8-6.0。
[0009]每隔12d左右換I次新鮮的芽篩選培養基。在最初I個月中，去除從塊莖薄片邊緣再生的芽。因為這些最初的芽大部分都是從芽眼長出而不是再生的轉基因芽，基本為假陽性。30d之后可將從薯肉上長出的芽，待芽長到2?3cm左右時，剪下接入生根篩選培養基中。
[0010]生根培養基的配方是 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.25mg/L IAA +500 mg/L Cef+500mg/L Carb最終獲得馬鈴薯轉基因植株。通過PCR檢測，得到轉基因株系的陽性率達到80%以上。
【權利要求】
1.將挑取含有目的基因的農桿菌單菌落接種至5mL液體LB中(含50mg/L卡納霉素和50 mg/L利福平)，200rpm 28°C培養過夜，二天按1:200的比例稀釋菌液于新鮮的液體LB中，繼續培養待0D600=0.1-0.3時取出備用。
2.在超凈工作臺中將試管薯放在被少量無菌水浸濕的濾紙上，在其上將試管薯塊切成l-2mm厚的薄片(頂端和底部舍去)，并轉移至水中備用，以防止材料發生栓化。
3.取制備好的菌液，5000rpm離心3min，棄上清，加入液體MS重懸菌體用于浸染，室溫下，轉移試管薯切片至重懸菌體中浸染5min左右，其間不斷搖動以利于充分接觸。
4.侵染結束后將薯片移至無菌濾紙上吸干水分，然后將薯片平放入共培養基上，在24°C，黑暗中共培養2d，共培養基配方是MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂，PH值調至5.8-6.0。
5.共培養后,放入含500mg/L Cef+500 mg/L Carb的無菌水中清洗3_4遍,吸干水分后轉入芽篩選培養基中，芽篩選培養基配方為MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA +0.25mg/L 2，4_D + 500 mg/L Cef + 500 mg/L Carb，PH 值調至5.8~6.00
6.每隔12d左右換I次新鮮的芽篩選培養基，在最初一段時間，去除從塊莖薄片邊緣再生的芽，30d之后可將從薯肉上長出的芽，待芽長到2-3cm左右時，剪下接入生根篩選培養基中。
7.生根培養基的配方是MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.25mg/L IAA +500 mg/L Cef+500mg/L Carb最終獲得馬鈴薯轉基因植株，通過PCR檢測，得到轉基因株系的陽性率達到80%以上。
【文檔編號】C12N15/82GK104293825SQ201310303556
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】李立芹, 王西瑤, 魯黎明, 倪蘇, 劉帆, 楊先泉, 曾富春, 彭茂林 申請人:四川農業大學