專利名稱：一種高脂飼料及在構建非酒精性脂肪肝動物模型中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫療評價、檢測技術領域，具體涉及一種高脂飼料，以及該高脂飼料在 構建非酒精性脂肪肝動物模型中的應用，構建的非酒精性脂肪肝動物模型可用于研究非酒 精性脂肪肝發病發展機理以及非酒精性脂肪肝纖維化的預防和治療方法。
背景技術：
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝實質細胞脂肪蓄積和脂肪 變性為特征的臨床病理綜合癥。根據肝組織病理學改變程度進行分類，可分為單純性脂肪 肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化。單純性脂肪肝僅表現為肝細胞的脂肪變性。在肝細胞 脂肪變性基礎上發生肝細胞炎癥即為脂肪性肝炎。在脂肪性肝炎的基礎上，肝細胞周圍發 生了纖維化改變，形成肝纖維化。肝纖維化繼續發展則病變為脂肪性肝硬化。近年來，隨著人類生活水平的提高和飲食結構的變化，NAFLD的發病率呈逐年上升 趨勢，且發病呈低齡化。越來越多的證據表明，部分NAFLD并不是一種良性的、靜止的病變， 它可在較短期內發展為不可逆的肝損害，其肝纖維化的發生率高達25%。因此，積極探索非 酒精性脂肪肝的有效預防治療措施，已成為目前廣受關注的肝病醫學難題。動物模型是研究人類疾病的重要手段。非酒精性脂肪肝發病發展機理尚未清楚， 也無有效地、理想的治療方法，特別是目前沒有非酒精性脂肪肝臨床病理發展階段的動物 模型，使醫藥學家難以對非酒精性脂肪肝進行深入系統的實驗研究。因此，建立有臨床病理 發展階段的非酒精性脂肪肝動物模型，是進一步深入研究非酒精性脂肪肝的發病機理、進 行預防和治療非酒精性脂肪肝的研究，尤其是篩選預防和治療非酒精性脂肪肝肝纖維化的 新藥、篩選預防和治療非酒精性脂肪肝肝纖維化的措施、客觀評價預防和治療各個階段非 酒精性脂肪肝的方法的前提和基礎。以SD大鼠為實驗動物構建NAFLD動物模型的方法為目前最常用的方法，但該方法 成模時間較長，模型TG血癥難以出現或不穩定；另外，以SD大鼠為實驗動物，模型停滯在脂 肪性肝炎模型階段，因而無法利用該模型建立臨床診斷病程進展的系統血清學診斷指標。 以上種種缺陷限制了該方法用于NAFLD病因機理研究及藥物評價。采用普通的動物飼料飼養大鼠等常規的實驗動物，模型也僅停滯在脂肪性肝炎模 型階段，無法構建非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型。目前開發一種與人類疾病特征相似、病變有一定發展過程并最終可形成肝纖維 化，形成時間短、重復性好、成本低、簡便易行的非酒精性脂肪肝動物模型造模方法，以及構 建非酒精性脂肪肝動物模型所需的動物和飼料迫在眉睫。
發明內容
本發明提供了一種高脂飼料以及該高脂飼料在構建非酒精性脂肪肝動物模型中 的應用，以單純的高脂飲食來構建非酒精性脂肪肝動物模型，操作簡單，易于操作。一種高脂飼料，由如下質量百分比的原料組成大鼠育成飼料80. 5%，雞蛋10%，豬油7%，膽固醇2%，三號膽鹽0. 5%。所述的大鼠育成飼料、雞蛋、豬油、膽固醇和三號膽鹽均選用市售產品。所述的高脂飼料的制備方法為將雞蛋(帶殼)搗碎，與大鼠育成飼料、豬油、膽固 醇和三號膽鹽混合均勻，得到高脂飼料。所述的高脂飼料可用于構建非酒精性脂肪肝動物模型。所述的用高脂飼料構建非酒精性脂肪肝動物模型的方法為選取長爪沙鼠，將長爪沙鼠自由采食高脂飼料，得到非酒精性脂肪肝動物模型。所述的長爪沙鼠優選為成年雄性長爪沙鼠。所述的用高脂飼料構建非酒精性脂肪肝動物模型的方法優選為將長爪沙鼠自由采食高脂飼料12天 16天，得到非酒精性單純性脂肪肝動物模 型；繼續自由采食高脂飼料觀天，得到非酒精性脂肪性肝炎動物模型；再繼續自由采食高 脂飼料98天，得到非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型。本發明發現采用特定的動物長爪沙鼠自由采食高脂飼料，其肝臟可相繼形成非 酒精性脂肪肝臨床病理進展的前三個階段逐步由單純性脂肪肝，演變為脂肪性肝炎，最 后形成纖維化。在2、6、16周時，由肝臟切片后蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,即HE染色)和膠原纖維特殊染色(即Mallory三色染色)可觀察到分別形成單 純性脂肪肝、脂肪性肝炎、纖維化。16周時模型組羥脯氨酸含量較正常對照組明顯升高，差 異有統計學意義，也說明模型組動物肝臟有膠原纖維的產生。由此說明本發明方法建立了 非酒精性脂肪肝纖維化長爪沙鼠動物模型。與現有技術相比，本發明具有如下優點本發明操作簡單，易于控制，構建的動物模型，可用于研究非酒精性脂肪肝發病發 展機理以及預防和治療不同階段的非酒精性脂肪肝的方法，尤其用于篩選預防和治療非酒 精性脂肪肝纖維化的新藥、用于篩選預防和治療非酒精性脂肪肝纖維化的措施、用于客觀 評價預防和治療各個階段非酒精性脂肪肝的方法。
圖1為實施例1中實驗2周時正常對照組動物的肝臟切片HE染色結果圖；圖2為實施例1中實驗2周時模型組動物的肝臟切片HE染色結果圖；圖3為實施例1中實驗6周時正常對照組動物的肝臟切片HE染色結果圖；圖4為實施例1中實驗6周時模型組動物的肝臟切片HE染色結果圖；圖5為實施例1中實驗16周時正常對照組動物的肝臟切片HE染色結果圖；圖6為實施例1中實驗16周時模型組動物的肝臟切片HE染色結果圖；圖7為實施例1中實驗16周時正常對照組動物的肝臟切片Mallory三色染色結 果圖；圖8為實施例1中實驗16周時模型組動物的肝臟切片Mallory三色染色結果圖；圖9為實施例1中模型組與正常對照組動物的肝臟羥脯氨酸含量變化圖。
具體實施例方式實施例1
選取健康雄性成年長爪沙鼠作為實驗動物，隨機分為模型組和正常對照組。正常 對照組連續自由采食普通大鼠育成飼料(浙江省實驗動物飼料生產基地提供)。模型組連 續自由采食高脂飼料建立NAFLD模型。高脂飼料由如下質量百分比的原料組成普通大鼠 育成飼料(浙江省實驗動物飼料生產基地提供)80. 5%、雞蛋10%、豬油7%、膽固醇2%、 三號膽鹽(杭州微生物試劑有限公司)0. 5% ；高脂飼料的制備方法為將雞蛋(帶殼)搗 碎，與普通大鼠育成飼料、豬油、膽固醇和三號膽鹽混合均勻，得到高脂飼料。于自由采食 第2周、6周、16周末，處死實驗動物。將肝最大葉中部組織用體積百分濃度為10%的甲醛 水溶液固定后制備石蠟切片，進行HE染色和Mallory三色染色觀察病理變化。另切肝右葉 0. 5g，盲樣檢測羥脯氨酸含量(GB/T 9695. 23-2008)。檢測結果發現正常對照組動物2、6、16周時肝臟細胞形態、小葉結構及匯管區均 未見異常；正常對照組動物16周時肝臟細胞無纖維化。模型組動物實驗2周時，HE染色結果顯示30 60% (質量百分比)肝細胞脂肪 變性，形成非酒精性單純性脂肪肝動物模型；羥脯氨酸含量較正常對照組無明顯升高；模 型組動物實驗6周時，HE染色結果顯示肝細胞脂肪變性進一步加劇，脂變細胞排列混亂，索 狀結構消失，門管區有輕度炎癥，形成非酒精性脂肪性肝炎動物模型；羥脯氨酸含量較正常 對照組無明顯升高；模型組動物實驗16周時，HE染色結果顯示75 90% (質量百分比) 肝細胞脂肪變性，腺泡III帶廣泛的氣球樣肝細胞，Mallory三色染色結果顯示竇周細胞中 度橋接纖維化；羥脯氨酸含量較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義；動物形成非酒 精性脂肪性肝纖維化動物模型。
權利要求
1.一種高脂飼料，其特征在于，由如下質量百分比的原料組成大鼠育成飼料80.5%， 雞蛋10%，豬油7%，膽固醇2%，三號膽鹽0.5%。
2.根據權利要求1所述的高脂飼料在構建非酒精性脂肪肝動物模型中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的應用方法為選取長爪沙鼠，將長爪沙鼠自由采食高脂飼料，得到非酒精性脂肪肝動物模型。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的長爪沙鼠為成年雄性長爪沙鼠。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的應用方法為將長爪沙鼠自由采食高脂飼料12天 16天，得到非酒精性單純性脂肪肝動物模型；繼 續自由采食高脂飼料觀天，得到非酒精性脂肪性肝炎動物模型；再繼續自由采食高脂飼料 98天，得到非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型。
全文摘要
本發明公開了一種高脂飼料及在構建非酒精性脂肪肝動物模型中的應用，所述的高脂飼料由如下質量百分比的原料組成大鼠育成飼料80.5％，雞蛋10％，豬油7％，膽固醇2％，三號膽鹽0.5％。本發明構建的模型可相繼出現非酒精性脂肪肝臨床病程進展的前三階段單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、纖維化。該模型用于研究非酒精性脂肪肝的發病發展機理、進行預防與治療不同階段的非酒精性脂肪肝的研究，尤其用于篩選預防和治療非酒精性脂肪肝纖維化的新藥、用于篩選預防和治療非酒精性脂肪肝纖維化的措施、用于客觀評價預防和治療各個階段非酒精性脂肪肝的方法。
文檔編號A23K1/18GK102106476SQ20111000889
公開日2011年6月29日 申請日期2011年1月17日 優先權日2011年1月17日
發明者盧領群, 李巍, 樓琦, 石巧娟, 薩曉嬰, 郭紅剛 申請人:浙江省醫學科學院