建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種建立革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的方法，包括下述步驟：大鼠經高脂飼料喂養8周后，注射鏈脲佐菌素，制成糖尿病模型，穩定后在大鼠皮膚上制成深II度燙傷，3天后，燙傷處注射革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液。此外，本發明還公開了一種用于建立革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的試劑盒，該試劑盒包括革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液。本發明的糖尿病潰瘍實驗動物模型通過對藥物干預后生化指標的變化的檢測，結果表明，本模型具有糖尿病足潰瘍的伴發多種菌群感染的特征，潰瘍創面愈合時間較長，對藥物反應敏感等特點。
【專利說明】建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬實驗動物模型領域，具體涉及一種建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]隨著我國的糖尿病發病率急劇升高，糖尿病潰瘍患者的數量也隨之增加，在動物整體水平建立真實模擬糖尿病潰瘍的疾病模型，是探討糖尿病潰瘍發病機制及臨床前藥效學評價等醫學研究的必要條件，具有十分重要的科學意義和臨床意義。
[0003]目前糖尿病足潰瘍動物模型多為誘發性動物模型。文獻研究結果顯示，現有糖尿病足潰瘍的動物模型多模擬單一發病因素(如外周動脈病變，神經病變或感染)，同時動物模型與實際模擬相似程度與研究目的存在較大的差距，而實際上二種以上因素的復合致病在臨床上更為普遍。因此，多因素復合的糖尿病足潰瘍動物模型更能模擬臨床實際的發病情況。
[0004]因此，根據臨床實際的發病特征及病理改變建立模擬程度較高的動物模型對于糖尿病潰瘍的發病機制的研究及相關的手術，藥物等干預的療效評價具有重要的實際意義。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題之一是提供一種可重復性高，穩定，疾病模擬程度高，便于評價的革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗動物模型的建立方法。
[0006]本發明要解決的技術問題之二是提供一種用于建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的試劑盒。
[0007]本發明要解決的技術問題之三是提供一種上述試劑盒在建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型中的應用。
[0008]在本發明的一方面，提供一種建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的方法，包括下述步驟:大鼠經高脂飼料喂養8周后，注射鏈脲佐菌素，制成糖尿病模型，穩定后在大鼠皮膚上制成深II度燙傷，3天后，燙傷處注射革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液。
[0009]作為優選的技術方案，所述革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌菌混懸液為:濃度為1 X 108UfC.mr1的金黃色葡萄球菌ATCC25923與大腸埃希菌ATCC285922等比例混合液。
[0010]作為優選的技術方案，所述注射革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液24小時后取創面膿液做病原微生物及藥敏檢測,用于確定創面細菌定植。
[0011]作為優選的技術方案，所述注射鏈脲佐菌素具體為:1.5%鏈脲佐菌素溶解于PH值4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在大鼠左下腹注射。
[0012]作為優選的技術方案，所述高脂飼料包含以下重量百分比的組分:基礎飼料73 %，豬油20 %，奶粉2 %，膽固醇I %，蔗糖4 %;所述基礎飼料由以下重量百分比的組分組成:大麥15%，小麥31%，玉米15%，麩皮15%,魚粉6%，豆柏、油和鹽共18%。
[0013]在本發明的另一方面，提供一種用于建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的試劑盒，該試劑盒包括革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液。
[0014]作為優選的技術方案，所述革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液是濃度為I X IO8UfC.mr1的金黃色葡萄球菌ATCC25923與大腸埃希菌ATCC25922等比例混合液。
[0015]作為優選的技術方案，所述試劑盒還包括1.5%鏈脲佐菌素，PH值4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，PBS液，注射器，無菌拭子，無菌手套，安爾碘液(用于遺棄菌液滅活)。
[0016]此外，在本發明的另一方面，提供上述試劑盒在建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型中的應用。
[0017]本發明實驗動物模型屬于復合制備糖尿病足潰瘍大鼠模型，模型制備分為三個階段，各有其具體的制備方法及評價方法，具體分為糖尿病模型制備階段，潰瘍模型制備階段，復合感染模型制備階段。
[0018]本發明的糖尿病潰瘍實驗動物模型通過對藥物干預后生化指標的變化的檢測，結果表明，本模型具有糖尿病足潰瘍伴多菌群感染的特征，創面感染膿腐明顯，潰瘍創面愈合時間較長，對藥物反應敏感等特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是本發明實施例1中大鼠燙傷后的病理切片HE染色示意圖。
【具體實施方式】
[0020]本發明的模型制備及驗證通過下述實驗證實:
[0021]實施例1
[0022]運用高脂飼料配合鏈脲佐菌素誘導的大鼠2型糖尿病，使用燙傷儀制成深II度燙傷誘導皮膚潰瘍，采用皮下注射質控菌金黃色葡萄球菌-ATCC25923 (Staphylococcusaureus)與大腸埃希菌-ATCC25922 (Escherichia coli, Ε.coli)株等量混合液制成糖尿病足潰瘍感染大鼠模型。
[0023]I材料和方法
[0024]1.1動物:SD雄性大鼠，SPF級，體重(180±10)g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。
[0025]1.2主要試劑及藥物:鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ),購自Alexis公司；高脂飼料(成份:基礎飼料73 %，豬油20 %，奶粉2 %，膽固醇I %，蔗糖4 % ;其中基礎飼料配方:大麥15%，小麥31%，玉米15%，麩皮15%，魚粉6%，豆柏、油和鹽共18%，該基礎飼料購自中國人民解放軍海軍醫學研究所)，高脂飼料的制備方法為:首先，將大麥15%，小麥31%，玉米15%，麩皮15%，魚粉6%按比例攪拌混合均勻后，加入豆柏、油、鹽混勻后加壓成型制成基礎飼料，然后，將基礎飼料73 %，豬油20 %，奶粉2 %，膽固醇I %，蔗糖4%按比例攪拌混合均勻后加壓成型制成高脂飼料，成品為圓柱塊狀；質控菌株金黃色葡萄球菌-ATCC25923 (Staphylococcus aureus),質控菌株大腸埃希菌-ATCC25922 (Escherichiacoli, E.coli),由曙光醫院病原微生物室提供，原始來源:購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection),間接來源為:上海市疾病預防控制中心國際實驗工作站；外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子(商品名:貝復濟，Recombinant BovineBasic Fibroblast Growth Factor For External Use, rb-bFGF),珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準字S10980077。安爾碘液(遺棄菌液滅活使用)；lml注射器，無菌拭子，無菌手套。
[0026]1.3主要儀器:燙傷儀SQL-5Q燙傷儀，上海欣軟信息科技有限公司。
[0027]1.4方法:48只大鼠隨機分為正常潰瘍組(N) (12只)，糖尿病潰瘍組(DU) (12只)，感染對照組(IU-C) (12只)，感染治療組(IU-T) (12只)。正常潰瘍組普通飼料喂養；糖尿病潰瘍組及感染對照組高脂飼料飼養8周，空腹24小時后，腹腔注射1.5%鏈脲佐菌素35mg.kg4, 3天后尾靜脈取血測量血糖>16.7mmol.L4,制成糖尿病模型；糖尿病潰瘍組及感染對照組血糖>16.7mmol.T1 一周后3%戊巴比妥鈉2ml.Kg—1劑量腹腔注射麻醉下燙傷儀燙傷(lOOOg，90°C，10S)，三天后，糖尿病潰瘍組(DU)，感染對照組(IU-C)，感染治療組(IU-T)分別腹腔注射0.1ml的PBS液，0.1ml的IO8Ufc.πιT1金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌的等量混合液。48小時后各組無菌拭子取病原微生物培養及藥敏檢驗，取皮膚組織10%甲醛固定后備檢。
[0028]糖尿病足實驗動物模型的制備及評價方法如下，具體分為3個試驗階段:
[0029]①糖尿病模型制備階段
[0030]方法:高脂飼料喂養8周后，1.5%鏈脲佐菌素溶解于PH值4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按35mg/kg的劑量左下腹注射。
[0031]結果:注射24小時后血糖大于16.7mml/L,穩定3天后檢測血糖仍大于16.7mml/L，糖尿病模型成功，穩定2周后，進入下一階段實驗。
[0032]②糖尿病潰瘍模型制備階段
[0033]方法:使用SQL- 5Q燙傷儀，溫度90°C，接觸時間10S，壓力9.8N,面積4cm2，麻醉后于后背部皮膚進行燙傷。
[0034]結果:觀察記錄燙傷處皮膚變化。燙傷后24h后取交界區皮膚做病理切片，HE染色觀察達到深度II燙傷，如圖1所示，正常潰瘍組(N)，糖尿病潰瘍組(DU)，感染對照組(IU-C)，感染治療組(IU-T)大鼠皮膚組織破壞達真皮層，毛囊，汗腺等皮膚附件破壞，炎癥細胞浸潤，符合深II度燙傷。穩定48小時后進入下一階段實驗。
[0035]③模型感染制備階段
[0036]方法:選用微生物檢測質控菌種，金黃色葡萄球菌-ATCC25923，大腸埃希菌-ATCC25922，調定菌懸液濃度:I X 108uf c/ml，等比例混合后每個創面皮下注射劑量
0.lm。(細菌懸液10倍梯度稀釋后計數使用分光光度計，OD值600，析光度為1，即為
I* 108uf c/ml) ο
[0037]結果:注射后48小時取膿培養檢測:使用Phoenix-100-BD，做細菌鑒定及藥敏。24小時后開放創面，進行藥物干預評價。
[0038]實施例2西藥-外用重組牛堿件成纖維細胞牛長因子(商品名:貝復濟)干預試驗結果
[0039]1.方法:正常潰瘍組(N)，糖尿病潰瘍組(DU)，感染對照組(IU-C)每日生理鹽水換藥，感染治療組(IU-T)貝復濟800iu傷口每日換藥。測量換藥后0d，3d，10d，愈合后創面面積，愈合后3%戊巴比妥鈉按2ml *Kg_1劑量腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，離心分離血清，取皮膚組織備檢。
[0040]2.數據處理:均采用SPSS16.0進行統計分析，計量資料用? ± s表示，符合正態性和方差齊性的數據用單因素方差分析，組件采用配對t檢驗，不符合正態性或方差齊性的數據用非參數檢驗，以P < 0.05有統計學意義。
[0041]表1各組血清NO治療后比較(?+s，μ mol/1)
[0042]
【權利要求】
1.一種建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的方法，其特征在于，包括下述步驟:大鼠經高脂飼料喂養8周后，注射鏈脲佐菌素，制成糖尿病模型，穩定后在大鼠皮膚上制成深II度燙傷，3天后，燙傷處注射革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌菌混懸液為:濃度為I X IO8Ufc ?ι? 1的金黃色葡萄球菌ATCC25923與大腸埃希菌ATCC25922等比例混合液。
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述注射革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液24小時后取創面膿液做病原微生物及藥敏檢測，用于確定創面細菌定植。
4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述注射鏈脲佐菌素具體為:1.5%鏈脲佐菌素溶解于PH值4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在大鼠左下腹注射。
5.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述高脂飼料包含以下重量百分比的組分:基礎飼料73%，豬油20<%，奶粉2%，膽固醇1(%，蔗糖4(% ;所述基礎飼料由以下重量百分比的組分組成:大麥15%，小麥31%，玉米15%，麩皮15%，魚粉6%，豆柏、油和鹽共18%。
6.一種用于建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌混懸液是濃度為IXlO8Ufc.πι 1的金黃色葡萄球菌ATCC25923與大腸埃希菌ATCC25922等比例混合液。
8.如權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括1.5%鏈脲佐菌素，PH值4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，PBS液，注射器，無菌拭子，無菌手套，安爾碘液。
9.如權利要求6-8任一項所述的試劑盒在建立革蘭氏陽性菌與陰性菌混合感染的糖尿病足潰瘍大鼠實驗模型中的應用。
【文檔編號】A61K31/7008GK103463135SQ201310423294
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】柳國斌, 韓強 申請人:上海中醫藥大學附屬曙光醫院