專利名稱：一種新的茯苓菌株及其液體發酵方法
技術領域：
本發明涉及藥用真菌液體發酵領域，特別是涉及茯苓液體發酵。
背景技術：
茯苓Poria cocos為一種多年生腐生真菌，屬于真菌門，擔子菌綱，無隔擔子菌亞綱，多孔菌目，多孔菌科，多孔菌屬。茯苓始載于《神農本草經》，被列為上品。我國早在春秋末期就有應用茯苓的記載，而人工栽培茯苓的歷史也已有1500多年。中醫學認為茯苓“利水而不傷正，補而不助邪”，能利水滲濕、健脾安神；近代醫學研究表明，茯苓的藥理作用主要表現在利尿、鎮靜、抗腫瘤、增強免疫等方面。茯苓以干燥菌核入藥，不同部位經加工分別成為白茯苓、赤茯苓、茯神、茯神木及茯苓皮等藥材。茯苓藥性平和，效用廣泛，被譽為“除濕之圣藥”、“仙藥之上品”，為多種方劑配伍的要藥及中成藥的重要原料，在常用中藥方劑中， 茯苓的配伍率達到70%。目前對茯苓液體發酵已有較多研究。用液體發酵培養及提取分離等新技術取代傳統的固體發酵來生產茯苓，可連續地、大規模地進行工業化生產，縮短生產時間，節省大量的木材。李羿等的“茯苓液體發酵條件的研究”(成都中醫藥大學學報，2005年第觀卷第 2期)中報道了一種茯苓液體發酵的方法，其發酵菌株為四川農科所茯苓菌種，最適發酵培養基為葡萄糖30g，酵母浸膏3. 9g，蛋白胨5. lg, K2HPO4 lg, MgSO4. 7H20 0. 5g，水IL ；茯苓液體發酵的最適PH值5. 5，液體菌種的菌齡為2d，液體菌種接種量6%，搖瓶培養時間7d, 菌絲體產量最高為11.88g/L。李羿等的“茯苓的搖瓶補料發酵和發酵罐補料液體發酵”(藥物生物技術，2007年第14卷第1期)中報道了一種茯苓液體發酵的方法，其發酵菌株為四川農科所提供的茯苓菌種通過分批補料加入碳源的方式可以提高茯苓液體發酵的水平，菌絲體產量最高為 11. 95g/Lo綜上所述，現有的茯苓液體發酵方法的發酵水平仍然不高，不能滿足市場對茯苓的需求。中藥中含有豐富的纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等物質，而藥用真菌具有分解纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等物質的強大酶系，因此，藥用真菌可利用中藥基質進行深層發酵。 同時，中藥中的某些成分(生物堿、皂苷、黃酮等)可促進或抑制藥用真菌的生長及代謝產物的生產。楊海龍等的“中藥對藥用真菌深層發酵的影響”(食品與發酵工業，2009年35卷 1期)中報道了中藥對靈芝、灰樹花、黑木耳、冬蟲夏草和雞腿蘑深層發酵水平的影響，不同中藥對不同真菌的發酵有不同作用，有的中藥具有促進作用，有的中藥具有抑制作用，有的中藥兼具有促進作用和抑制作用。目前還沒有文獻報道在培養基中加入中藥來提高茯苓液體發酵水平的方法。 發明內容
為了進一步提高茯苓發酵水平，本發明提供了一種新的茯苓菌株和一種新的茯苓液體發酵的方法。首先，本發明提供了一種茯苓菌株，菌株名稱為Poria cocos (Schw. )wolf. P6, 它由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO :M2010361o該茯苓菌株于2010 年12月21日保藏于中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO =M 2010361。本發明又提供了一種茯苓液體發酵方法，它包括如下步驟a、制備發酵種子取保藏號為CCTCC NO =M 2010361的茯苓菌株接種于種子培養基培養，得茯苓種子；b、發酵將步驟a得到的種子接種于茯苓液體發酵培養基中進行發酵，得發酵液， 即為茯苓發酵產物。步驟a的種子培養基由下述原料制備而成葡萄糖20g/L、酵母浸膏4g/L、蛋白胨 5g/L、K2HPO4 lg/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L 和蒸餾水；步驟 a 的培養溫度為 25°C，pH 為 5. 5 ；步驟b所述的茯苓液體發酵培養基是由下述原料制備而成葡萄糖20g/L、酵母浸膏 3. 5g/L、蛋白胨 4. 5g/L,K2HPO4 lg/L,MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、蒸餾水和粒徑小于 250 μ m 的中藥材固體粉末2. 5g/L 20g/L，所述的中藥材為薏苡仁、黃芪、金銀花、甘草、淡竹葉、桑葉、丹參、靈芝或者枸杞子。上述薏苡仁固體粉末的量優選為2. 5g/L 10g/L，進一步優選為7. 5g/L ；上述甘草的固體粉末的量優選為2. 5g/L 10g/L，進一步優選為5g/L ；上述淡竹葉的固體粉末的量優選為2. 5g/L 15g/L，進一步優選為7. 5g/L ；上述桑葉的固體粉末的量優選為2. 5g/L 10g/L，進一步優選為5g/L ；上述靈芝的固體粉末的量優選為2. 5g/ L 15g/L，進一步優選為7. 5g/L ；上述枸杞子的固體粉末的量優選為2. 5g/L 10g/L，進一步優選為5g/L。步驟b的發酵方法為液體補料發酵，具體步驟如下①將茯苓種子接種到茯苓初始培養基內發酵，所述的初始培養基由下述原料制備而成葡萄糖100g，酵母浸膏8. 75g，蛋白胨11.25g，K2HP04 5g,MgSO4. 7H20 2. 5g，初始pH值 5. 5，蒸餾水4. 05L，發酵溫度為^°C，pH值為5. 5，溶氧水平為60% 90% ；②在茯苓液體發酵第48h、60h、7ai和84h時，分別將IOOmL補料培養基或者200mL 補料培養基補入發酵罐中，所述的補料培養基由下述原料制備而成葡萄糖I00g，酵母浸膏8. 75g，蛋白胨11. 25g，蒸餾水600mL ；③發酵至發酵時間為117 U9h，收取發酵液，即得發酵產物。步驟②在48h、60h、7ai和84h時加入的補料培養基依次為100mL、200mL、200mL和 100mL。 本發明還提供了一種根據上述方法制備的茯苓發酵產物。本發明提供的茯苓菌株具有較好的生產性能和穩定性，本發明提供的茯苓液體發酵方法，可以提高茯苓液體發酵的水平，使茯苓的菌絲體干重、胞外多糖含量顯著提高，滿足市場對茯苓的需求，為茯苓相關保健食品和藥品的開發打下基礎。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
具體實施例方式1實驗材料1. 1菌種茯苓菌株，購買于四川省農科所，保藏號為P0，與李羿等的“茯苓液體發酵條件的研究”(成都中醫藥大學學報，2005年第觀卷第2期)中使用的茯苓菌株相同。1. 2儀器和試劑超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；全溫振蕩器(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)；NBS Bioflo III型發酵罐；離心機Beckman J2-HS;電子天平 Sartorius BP121S。酵母浸膏、蛋白胨為Oxoid產品，葡萄糖、蔗糖、K2HP04、MgSO4 · 7H20、NaN03、KCl和 I^eSO4均采用國產分析純。1. 3 中藥材薏該仁(Coicis Semen)、黃芪(Astragali Radix)、金銀花(Lonicerae Flos)、甘草(Glycyrrhizae Radix)、淡竹葉(Lophatheri Folum)、桑葉(Mori Folum), 丹參(Salviae Miltirrrhizae Radix et Rhizoma)、靈芝(Ganoderma)禾口枸杞子(Lycii Rructus)均購置于杏林大藥房，粉碎過60目篩，60°C烘干至恒重后裝入有塞瓶中，貼上標簽，放入干燥器內備用。實施例1茯苓優良菌株的選育1、培養基完全培養基(TYEG培養基)胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，K2HPO4 3g，葡萄糖lg，瓊脂 15g,蒸餾水 1L, pH 7. O。1. 05kg/cm2,121. 3°C滅菌 20min。液體發酵種子培養基葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4Ig, MgSO4. 7H20 0. 5g，初始 pH 5. 5，蒸餾水 1L。1.(^1^/0112，121.31滅菌20111土11。液體發酵培養基葡萄糖20g，酵母浸膏3. 5g，蛋白胨4. 5g，K2HPO4 lg, MgSO4. 7H20 0. 5g，初始 pH 5. 5，蒸餾水 1L。1.(^1^/0112，121.31滅菌20111土11。2、誘變育種1)紫外誘變a，孢子懸液的制取取保藏號為PO的茯苓典型菌株，置于無菌生理鹽水中，制備成孢子懸液，倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，充分搖動lOmin，使孢子均勻分散，用滅菌脫脂棉過濾，即為孢子懸浮液。取上述孢子懸浮液計數，調整孢子懸浮液濃度為IO6個孢子/mL ；b，紫外線照射將紫外燈開關打開遇熱20min。取直徑6cm無菌平皿5套，分別加入上述孢子懸液3mL，并將無菌攪拌棒放于平皿中。將盛有菌懸液的平皿置磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為15W的紫外燈下分別照射77s ；c，稀釋在紅燈下，將上述處理菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10_2，ΙΟ"3,10_4四個不同的稀釋度；d，在紅燈下，取川人川入^^三個稀釋度的化ImL孢子懸液涂在含ang/mL茯苓胞外多糖的濃度梯度完全培養基平板上，用無菌玻璃刮棒涂勻；e，將上述涂勻的平板用黑布包好，置恒溫培養箱倒置培養，得到茯苓單菌落；2)優良菌株的篩選a，將步驟1)得到茯苓單菌落用無菌牙簽挑到含％ig/mL茯苓胞外多糖的完全培養基平板上，挑選出生長較好的菌落用無菌牙簽接種到含8mg/mL茯苓胞外多糖的完全培養基平板上，挑選出生長較好的菌落用無菌牙簽接種到含16mg/mL茯苓胞外多糖的完全培養基上，從中挑選出生長較好的菌株；將保藏號為PO的典型菌株與上述篩選出的菌株分別接種到盛有50mL液體種子培養基的250mL三角瓶中，在25°C，150r/min搖瓶振蕩培養5d作為液體菌種備用；分別吸取已制備的種子液3. 5mL,接種于盛有50mL液體搖瓶發酵培養基的250mL三角瓶中(按7% 的比例接種)，在培養溫度，培養基初始pH值5. 5，搖瓶轉速150r/min的培養條件下培養7d。取發酵液50mL，經6000r/min離心15min，收集沉積的菌絲球，60°C烘干至恒重，用電子天平精確稱重。經過搖瓶培養，保藏號為PO的典型菌株的菌絲體干重為11.08g/L，篩選得到的菌株中，有一株茯苓菌株發酵得到的菌絲體干重為11. 92g/L,比出發菌株提高了 7. 58%。 因此，以該菌株為優良菌株，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO =M 2010361。3)、穩定性檢測挑取步驟2)篩選得到的保藏號為CCTCC NO =M 2010361的優良菌株，接種到盛有 50mL液體種子培養基的250mL三角瓶中。在25°C，150r/min搖瓶振蕩培養5d作為液體菌種備用，稱為第一代種子液。用無菌移液器吸取250 μ L第一代種子液，接種到盛有50mL液體種子培養基的 250mL三角瓶中(按0. 5%的比例接種)。在培養溫度25°C，150r/min搖瓶振蕩培養2d得到第二代優良菌株的種子液。再將第二代種子接種到液體種子培養基中，在培養溫度25°C， 150r/min搖瓶振蕩培養2d得到第三代優良菌株種子液。依此類推，可得到第十代優良菌株種子液。分別吸取已制備的優良菌株第一代至第十代的種子液3. 5mL，接種于盛有50mL液體發酵培養基的250mL三角瓶中(按7%的比例接種)。在培養溫度^TC，培養基初始pH 值5. 5，搖瓶轉速150r/min的培養條件下，搖瓶振蕩培養7d。取發酵液50mL，經6000r/min 離心15min，收集沉積的菌絲球，60°C烘干至恒重，用電子天平精確稱重。結果如表1所示表1茯苓優良菌株的穩定性
傳代數12345678910菌絲體干重(g/L)11.8611. 8111. 9211.9711. 7911. 8411. 7011. 8711.9011. 95從表1可知，保藏號為CCTCC NO =M 2010361的優良菌株第一代至第十代的菌絲干重在11. 70 11. 97g/L之間波動，波動幅度很小，表明其具有良好的遺傳穩定性。本實施例證明了本發明紫外誘變育種得到的保藏號為CCTCC NO :M2010361茯苓菌株不僅對多糖具有很好的耐受性，可產生更多的多糖，而且菌絲體的產量也有提高。實施例2中藥對茯苓搖瓶液體發酵的影響1、培養基
種子培養基葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4 lg, MgSO4 · 7H20 0. 5g， 蒸餾水1L，初始pH 5.5。發酵基礎培養基葡萄糖20g，酵母浸膏3. 5g，蛋白胨4. 5g,K2HPO4 IgjMgSO4 ·7Η20
0.5g，蒸餾水1L，初始pH 5.5。2、發酵方法1)、茯苓搖瓶液體發酵菌種的制備將50mL種子培養基培養基裝入250mL三角瓶，按0. 5%的比例接種實施例1得到的保藏號為CCTCC NO =M 2010361的茯苓菌株，25°C搖瓶振蕩培養2d作為液體發酵菌種備用。2)、接種培養在搖瓶液體發酵基礎培養基中以10g/L的濃度將薏苡仁等9味中藥固體粉末 (固體粉末的粒徑小于250 μ m)分別加入搖瓶液體發酵基礎培養基中，對照不加中藥，于
1.05kg/cm2,121. 3°C滅菌20min。搖瓶液體發酵培養條件冷卻后按6%比例接入茯苓液體菌種，培養溫度26°C，搖瓶裝量60mL (250mL三角瓶)，150r/min搖瓶振蕩培養7d，即得發酵液。3)、菌絲體稱重取發酵液于6000r/min離心15min，收集沉積的菌絲球60°C烘干至恒重，用精密天
平稱重。4)、胞外多糖的純化與稱量取發酵液6000r/min離心15min，收取上清液；上清液濃縮后用Sevag法除蛋白； 6000r/min離心20min，上清液加入3倍量的95%乙醇，冷藏12h。6000r/min離心20min，收集沉淀，低溫干燥得茯苓胞外粗多糖；將茯苓胞外初多糖依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌， 低溫干燥，得茯苓胞外多糖，用電子天平精確稱重。3、結果不同中藥對茯苓搖瓶液體發酵菌絲體產量和胞外多糖產量的影響如表2所示表2不同中藥對茯苓深層發酵的影響
權利要求
1.一種茯苓菌株(Poria cocos)，其特征在于它是由中國典型培養物保藏中心保藏的菌株，保藏號為CCTCC NO =M 2010361。
2.一種茯苓液體發酵的方法，其特征在于它包括如下步驟a、制備發酵種子取保藏號為CCTCCNO =M 2010361的茯苓菌株接種于種子培養基培養，得茯苓種子；b、發酵將步驟a得到的種子接種于茯苓液體發酵培養基中進行發酵，得發酵液，即為茯苓發酵產物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟a的種子培養基由下述原料制備而成葡萄糖20g/L、酵母浸膏4g/L、蛋白胨5g/L、K2HP04 lg/L、MgS04. 7H20 0. 5g/L和蒸餾水。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟a的培養溫度為25°C，pH為5.5。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟b所述茯苓液體發酵培養基由下述原料制備而成葡萄糖20g/L、酵母浸膏3. 5g/L、蛋白胨4. 5g/L、K2HPO4 lg/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、蒸餾水和粒徑小于250 μ m的中藥材固體粉末2. 5g/L 20g/L，所述的中藥材為薏苡仁、黃芪、金銀花、甘草、淡竹葉、桑葉、丹參、靈芝或者枸杞子。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的中藥材是 薏苡仁，其濃度為2. 5g/L 10g/L ；或者甘草，其濃度為2. 5g/L 10g/L ； 或者淡竹葉，其濃度為2. 5g/L 15g/L ； 或者桑葉，其濃度為2. 5g/L 10g/L ； 或者靈芝，其濃度為2. 5g/L 15g/L ； 或者枸杞子，其濃度2. 5g/L 10g/L。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的中藥材是 薏苡仁，其濃度為7. 5g/L；或者甘草，其濃度為5g/L; 或者淡竹葉，其濃度為7. 5g/L； 或者桑葉，其濃度為5g/L; 或者靈芝，其濃度為7. 5g/L； 或者枸杞子，其濃度為5g/L。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟b的發酵方法為液體補料發酵，具體步驟如下①將茯苓種子接種到茯苓初始培養基內發酵，所述的初始培養基由下述原料制備而成葡萄糖 100g，酵母浸膏 8. 75g，蛋白胨 11.25g，K2HPO4 5g，MgSO4JH2O 2. 5g，初始 pH 值 5. 5，蒸餾水4. 05L，發酵溫度為^°C，pH值為5. 5，溶氧水平為60% 90% ；②在茯苓液體發酵第48h、60h、7ai和84h時，分別將IOOmL補料培養基或者200mL補料培養基補入發酵罐中，所述的補料培養基由下述原料制備而成葡萄糖100g，酵母浸膏 8. 75g，蛋白胨 11. 25g，蒸餾水 600mL ；③發酵至發酵時間為117 U9h，收取發酵液，即得發酵產物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步驟②在48h、60h、7a!和84h時加入的補料培養基依次為100mL、200mL、200mL和100mL。
10.權利要求2 9任意一項所述的方法制備得到的茯苓發酵產物。
全文摘要
一種新的茯苓(Poria cocos)菌株及其液體發酵方法，涉及茯苓液體發酵領域。本發明提供了一種由中國典型培養物保藏中心保藏的茯苓菌株，保藏號為CCTCC NOM 2010361。本發明還提供了一種茯苓液體發酵的方法，它包括如下步驟a、制備發酵種子取保藏號為CCTCC NOM 2010361的茯苓菌株接種于種子培養基培養，得茯苓種子；b、發酵將步驟a得到的種子接種于茯苓液體發酵培養基中進行發酵，得發酵液，即為茯苓發酵產物。該發酵方法可以提高茯苓液體發酵的菌絲體產量或者胞外多糖產量，滿足市場對茯苓的需求，為茯苓相關保健食品和藥品的開發打下基礎。
文檔編號A01G1/04GK102199543SQ20111002080
公開日2011年9月28日 申請日期2011年1月19日 優先權日2011年1月19日
發明者李晨, 李羿, 游元元, 鐘世紅 申請人:成都醫學院