專利名稱：凡納濱對蝦精莢低溫保存方法
技術領域：
本發明涉及一種動物精子低溫保存的方法，特別是一種凡納濱對蝦精莢低溫保存方法。
背景技術：
凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)，又名南美白對蝦，是世界規模化養殖對蝦品種之一，為我國產量最高的對蝦。雖然在養殖業上越來越重要，但其精子保存技術依然很少，大大限制了選擇育種的可行性。目前，哺乳動物及魚類的精子冷凍保存的方法多采用液氮超低溫冷凍法，精子冷凍保存技術存在著凍精活率不夠高、受精率不高、凍精保存量小，達不到實用化水平等諸多問題，而且由于對蝦的精子和其他動物的精子不同，對蝦的精子團被提供其營養物質的精莢包裹。由于精莢的存在，液氮低溫保存時精莢會形成冰晶， 造成精子的死亡。在國外，Chow等(1985)在自來水和10%甘油混合物中平衡羅氏沼蝦 15-30min，然后將精莢轉移到ImL的玻璃試管凍存在液氮中。該方法只是證實了通過甘油平衡作用能夠對精莢起到部分的保護作用，但是不能阻止精莢形成冰晶過程。Dumont等 (1992)發現以二甲基亞砜(DMSO)為抗凍保護劑，在液氮中以1.6°C mirT1的速度冷凍南美白對蝦精子比0. 30C mirT1和1. 8V mirT1有更好的效果。柯亞夫等(1996)用含有10% DMSO和5 10%甘油的稀釋液冷凍中國對蝦精子，發現中國對蝦精子在0-4°C平衡20 30min能夠避免對蝦精子發生頂體反應。該方法雖然保存了精子，但是在處理精莢過程中對精子活力造成了一定的影響，而且去掉精莢的精子在復蘇后很難進行受精過程，成活率僅達60%。因此該方法不能完全滿足利用保存的精子進行后續研究工作的條件。
發明內容
本發明的目的是為凡納濱對蝦種質保存、遺傳多樣性保護、遺傳育種和生產提供一種操作簡單、精莢結構保存完整、精子存活率高、保存時間長、實用化的凡納濱對蝦精莢低溫保存方法。本發明是按以下技術方案實現的凡納濱對蝦精莢低溫保存的方法，包括精莢采集、精莢固定、精莢保存和精子染色過程，方法是在常溫條件下將精莢分裝于EP管，采用配制的培養層包裹精莢，將包裹精莢 EP管置于冰箱中，在4°C的低溫下保存，具體操作過程為(1)精莢采集在無菌細胞間內的超凈工作臺上左手握住對蝦尾部，右手握住頭部，然后用右手食指隔開最后一對步足，左手拇指擠壓精莢，將采集的精莢先放入EP管中。(2)精莢固定常溫條件下在無菌細胞間內的超凈工作臺上將每個精莢分裝于進口 EP管中，快速加入配制培養層包裹精莢，然后用封口膜封口。(3)精莢保存將(2)步包裹精莢的EP管放置于細胞培養室內的4°C保鮮箱中。(4)精子染色及計算成活率輕輕擠出精液并按1 10稀釋，取0. 9mL的精子懸濁液移入試管中，加入0. ImL的0. 4%的臺盼藍溶液，混勻，3分鐘后將其滴入血細胞計數板中，在顯微鏡下觀察著色的精子個數和精子總數。精子存活率=(精子總數-藍色精子數)/精子總數xioo%。以上所述的精莢保存，每1周取出1個精莢用臺盼藍染色觀察其成活率，放入培養層的體積數隨著精莢的大小進行調節，確保3個月以上所保存的精子成活。以上所述的培養層，具有固定和提供精莢所需的營養物質，其配方成分、體積份數及配制方法為0. 3 0. 4份濃度為1. 8 3. 0 %的自制I型液態鼠尾膠原與0. 3 0.4份2X1640培養液，0. 1 0.2份美國GIBCO公司的胎牛血清，0. 1份美國Sigma公司的Matrigel ( 一種可溶性基底膜基質)，裝于放在冰盒的EP管中，充分混勻，加入0. 1 %的 NaOH溶液，調節pH值7. 2 7. 4。以上所述的培養液采用美國GIBCO公司的1640培養基1袋，充分溶解于500ml 過濾除菌的鹽度為30%。的海水中，配制成濃度為20. 8g/L的2X 1640培養液，并加入2. 38g HEPES(羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖劑于溶液中至其終濃度為lOmmol/L，加入用無菌的lmol/ L NaOH調節pH至6. 8 7. 4之間，加入青霉素和鏈霉素調節其終濃度為100萬單位，再經過0. 22 μ m的濾器過濾分裝成50mL/瓶，備用。以上所述的自制I型液態鼠尾膠原，將大鼠鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30min， 于無菌條件下撕下大鼠尾皮，將尾巴切成幾段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0. 的醋酸中，置于4°C冰箱，并用磁力攪拌器進行攪拌，48h后以3000r/min的速度離心收集上清既得膠原溶液，計算所制備的膠原溶液的濃度，具體方法為取一個濾紙片于烘箱充分烘干后稱濾紙重量，記為WO ；將制備的液態膠原滴數滴于濾紙，稱重量，記為Wl ；將滴有液態膠原的濾紙于烘箱充分烘干稱重量，記為W2，由下面公式可求的所制備膠原的濃度膠原濃度=(W2-W0)/(Wl-WO)本發明的的優點和積極效果本發明具有操作簡單、精莢結構保存完整、精子存活率高的特點。將對蝦精莢保存在4°C的無菌的培養層中，該培養層具有固定和提供營養的作用。結果顯示1. 8 3. 0%的鼠尾膠原適合用于作為培養層收縮的介質，精莢的保存時間至少為3個月以上，精子成活率達到80%以上。
具體實施例方式下面通過實施例，對本發明的技術方案進一步具體的說明。實施例1 一、固定和提供精莢所需的營養物質培養層的配制(一 )培養液將美國GIB⑶公司的1640培養基1袋，充分溶解于500ml過濾除菌的鹽度為30%。 的海水中，配制成濃度為20. 8g/L的2X1640培養液，并加入2. 38g HEPES (羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖劑于溶液中至其終濃度為lOmmol/L，加入用無菌的lmol/L NaOH調節pH 7.2， 加入青霉素和鏈霉素調節其終濃度為100萬單位，再經過0. 22 μ m的濾器過濾分裝成50mL/ 瓶，備用。(二)自制I型液態鼠尾膠原取大鼠鼠尾1條，置于75%的酒精中浸泡30min，于無菌條件下撕下大鼠尾皮，將尾巴切成幾段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0. 的醋酸中，置于4°C冰箱，并用磁力攪拌器進行攪拌，48h后以3000r/min的速度離心收集上清既得膠原溶液，計算所制備的膠原溶液的濃度，具體方法為取一個濾紙片于烘箱充分烘干后稱濾紙重量，記為WO ；將制備的液態膠原滴數滴于濾紙，稱重量，記為Wl ；將滴有液態膠原的濾紙于烘箱充分烘干稱重量，記為W2，膠原的濃度，備用。(三)培養層用刻度吸管吸取0. 4mL 1. 8%的液態鼠尾膠原分別與0. 4mL的2X 1640濃縮液， 0. ImL胎牛血清(美國GIBCO公司)，美國Sigma公司的0. ImL美國sigma公司Matrigel ( — 種可溶性基底膜基質)裝于放在冰盒的1. 5mL的EP管中，充分混勻，加入0. 1% NaOH溶液調節PH值7. 2。二、低溫保存操作過程常溫條件下在無菌細胞間內的超凈工作臺上左手握住對蝦尾部，右手握住頭部， 然后用右手食指隔開最后一對步足，左手拇指擠壓精莢，將采集的精莢先放入EP管中。常溫條件下在無菌細胞間內的超凈工作臺上將每個精莢分裝于進口 EP管中，快速加入配制培養層包裹精莢，然后用封口膜封口。將包裹精莢的EP管放置于細胞培養室內的4°C保鮮箱中。所保存的精莢，每1周取出1個精莢用臺盼藍染色觀察其成活率，放入培養層的體積數隨著精莢的大小進行調節，4個月檢測所保存的精子成活率達到80. 6%。實施例2 一、固定和提供精莢所需的營養物質培養層的配制(一 )培養液將美國GIB⑶公司的1640培養基1袋，充分溶解于500ml過濾除菌的鹽度為30%。 的海水中，配制成濃度為20. 8g/L的2X1640培養液，并加入2. 38g HEPES (羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖劑于溶液中至其終濃度為lOmmol/L，加入用無菌的lmol/L NaOH調節pH7. 3，加入青霉素和鏈霉素調節其終濃度為100萬單位，再經過0. 22 μ m的濾器過濾分裝成50mL/ 瓶，備用。(二)自制I型液態鼠尾膠原取大鼠鼠尾1條，置于75%的酒精中浸泡30min，于無菌條件下撕下大鼠尾皮，將尾巴切成幾段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0. 的醋酸中，置于4°C冰箱，并用磁力攪拌器進行攪拌，48h后以3000r/min的速度離心收集上清既得膠原溶液，計算所制備的膠原溶液的濃度，具體方法為取一個濾紙片于烘箱充分烘干后稱濾紙重量，記為WO ；將制備的液態膠原滴數滴于濾紙，稱重量，記為Wl ；將滴有液態膠原的濾紙于烘箱充分烘干稱重量，記為W2，膠原的濃度。(三)培養層用刻度吸管吸取0. 4mL 3. 0%的液態鼠尾膠原與0. 3mL的2 X 1640培養液，0. 2mL 美國GIBCO公司的胎牛血清，0. ImL美國Sigma公司的Matrigel裝于放在冰盒的1. 5mL的 EP管中，充分混勻，加滴0. 1 % NaOH溶液調節pH值7. 3。二、低溫保存操作過程常溫條件下在無菌細胞間內的超凈工作臺上左手握住對蝦尾部，右手握住頭部， 然后用右手食指隔開最后一對步足，左手拇指擠壓精莢，將采集的精莢先放入EP管中。常溫條件下在無菌細胞間內的超凈工作臺上將每個精莢分裝于進口 EP管中，快速加入配制培養層包裹精莢，然后用封口膜封口。將包裹精莢的EP管放置于細胞培養室內的4°C保鮮箱中。臺盼藍拒染法鑒定成活的精子。所保存的精莢，每1周取出1個精莢用臺盼藍染色觀察其成活率，放入培養層的體積數隨著精莢的大小進行調節，4個月檢測所保存的精子成活率達到80. 6%。
權利要求
1.一種凡納濱對蝦精莢低溫保存的方法，包括精莢采集、精莢固定、精莢保存和精子染色過程，其特征在于在常溫條件下將精莢分裝于EP管，采用配制的培養層包裹精莢，將包裹精莢EP管置于冰箱中，在4°C的低溫下保存，具體操作過程為(1)精莢采集在無菌細胞間內的超凈工作臺上左手握住對蝦尾部，右手握住頭部，然后用右手食指隔開最后一對步足，左手拇指擠壓精莢，將采集的精莢先放入EP管中。(2)精莢固定常溫條件下在無菌細胞間內的超凈工作臺上將每個精莢分裝于EP管中，快速加入配制培養層包裹精莢，然后用封口膜封口。(3)精莢保存將(2)步包裹精莢的EP管放置于細胞培養室內的4°C保鮮箱中。(4)精子染色輕輕擠出精液并按1 10稀釋，取0.9mL的精子懸濁液移入試管中，加入0. ImL的0. 4%的臺盼藍溶液，混勻，3分鐘后將其滴入血細胞計數板中，在顯微鏡下觀察著色的精子個數和精子總數，計算精子存活率。
2.根據權利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的精莢保存，每1周取出1個精莢用臺盼藍染色觀察其成活率，放入培養層的體積數隨著精莢的大小進行調節，確保3個月以上所保存的精子成活。
3.根據權利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的培養層具有固定和提供精莢所需的營養物質，其配方成分、體積份數及配制方法為0. 3 0. 4份濃度為1. 8 3. 0%的自制I型液態鼠尾膠原與0. 3 0. 4份2 X 1640培養液，0. 1 0. 2份美國GIBCO公司的胎牛血清，0. 1份美國Sigma公司的Matrigel裝于放在冰盒的EP管中，充分混勻，加入0. 1% 的NaOH溶液，調節pH值7. 2 7. 4，備用。
4.根據權利要求3所述的保存方法，其特征在于所述的培養液采用美國GIBCO公司的1640培養基1袋，充分溶解于500ml過濾除菌的鹽度為30%的海水中，配制成濃度為 20. 8g/L的2X 1640培養液，并加入2. 38g HEPES緩沖劑于溶液中至其終濃度為lOmmol/L， 加入用無菌的lmol/L NaOH調節pH至6. 8 7. 4之間，加入青霉素和鏈霉素調節其終濃度為100萬單位，再經過0. 22 μ m的濾器過濾分裝成50mL/瓶，備用。
5.根據權利要求3所述的保存方法，其特征在于所述的自制I型液態鼠尾膠原是將大鼠鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30min，于無菌條件下撕下大鼠尾皮，將尾巴切成幾段， 抽出白色尾腱，浸入150ml的0. 的醋酸中，置于4°C冰箱，并用磁力攪拌器進行攪拌，48h 后以3000r/min的速度離心收集上清既得膠原溶液，計算所制備的膠原溶液的濃度。
全文摘要
本發明公開了一種凡納濱對蝦精莢低溫保存的方法，包括精莢采集、精莢固定、精莢保存和精子染色過程，采用濃度為1.8～3.0％的自制I型液態鼠尾膠原0.3～0.4份為培養層收縮的介質，與2×1640培養液0.3～0.4份，美國GIBCO公司的胎牛血清0.1～0.2份，美國Sigma公司的Matrigel(一種可溶性基底膜基質)0.1份，配制得到凡納濱對蝦精莢培養層。該培養層具有在常溫條件下呈粘稠狀，而在4℃條件下會凝固的特性，能包裹精莢。在常溫條件下將精莢分裝于EP管，采用配制的培養層包裹精莢，將包裹精莢EP管置于冰箱中，在4℃的低溫下保存。本發明具有操作簡單、精莢結構保存完整、精子存活率高、保存時間長、低溫保存效果穩定等特點，易于推廣應用。精莢的保存時間至少為3個月，精子成活率達到80％以上。
文檔編號A01N1/02GK102258006SQ201110129658
公開日2011年11月30日 申請日期2011年5月19日 優先權日2011年5月19日
發明者楊春玲, 蔣偉明, 謝達祥, 趙永貞, 陳曉漢, 陳秀荔 申請人:廣西壯族自治區水產研究所