專利名稱：拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其應用。
背景技術：
氮肥是農業生產中最重要的生產資料之一。生產化學氮肥消耗大量能源，占生產總成本的70% 80%。近年來能源日趨緊張，我國化肥生產用煤價格飚升導致化學氮肥價格上漲，農民難以承受，反響強烈。此外，化學氮肥在提高作物產量、保障我國糧食安全方面發揮了巨大作用，但是不合理施氮已經形成了嚴重的面源污染，造成一系列的嚴重危害，如太湖藍藻事件令人觸目驚心。城市地下水硝酸鹽污染已經對飲用水安全造成了威脅。大氣中含有78%的氮素，但其存在形式是分子態氮氣，動植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大氣中氮氣的能力，將其還原成氨，這就是生物固 氮作用。選用高效固氮微生物菌種工廠化生產制成菌劑，或進一步與其它富含植物營養的物料復合加工成生物制品，應用于農業生產，可以提供作物氮素營養，改善作物根際生態環境，提高土壤生物肥力性狀，這就是通常所說的固氮微生物菌劑或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多種優勢①生物氮肥由可再生的生化制劑和活體微生物組成，可以再生，不存在資源枯竭問題，是可持續發展農資產品。②生物氮肥是環境友好型肥料，其生產和使用過程均不產生三廢等污染性物質，而且能改善土壤理化性質，提高土壤肥力，是生態農業農資產品。③生物氮肥生產耗能少、成本低，其成本僅為等效化學氮肥的20% 40%，可以為國家節省大量的煤炭和石油等能源戰略物資。④使用生物氮肥可以顯著降低農業生產成本，提高農產品品質，提升土壤肥力，使農民受益，促進社會和諧發展。核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的是作物菌核病的病原菌,形態特征表現為子囊盤小，呈小杯狀，淺肉色至褐色，單個或幾個從菌核上生出，直徑O. 5-lcm，柄褐色細長，彎曲，長3-5cm，向下漸細，與菌核相連。菌絲體可以形成菌核，長柄的褐色子囊盤產生在菌核上。菌核形狀多樣，長3-15 μ m。子囊圓柱形，120-140 μ mX 11 μ m，孢子通常8個，單行排列，橢圓形，8-14 μ mX 4-8 μ m，側絲細長，線形，無色，頂部較粗。該菌是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，廣泛地侵染、危害十字花科、豆科、茄科、蕓香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黃瓜、辣椒等經濟作物和蔬菜菌核病。目前對菌核病的防治主要依靠化學農藥，然而化學防治不僅成本高、污染環境，而且防效也不理想，同時食品的安全性也受到嚴重影響。菌種是微生物肥料生產應用的基礎。目前，限制我國微生物肥料行業發展的瓶頸就是高效菌種的選育問題。農業生產迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性強、貨架期長的微生物肥料生產用菌種。
發明內容
本發明的目的是提供一株可以在農作物根際進行高效固氮，并且拮抗核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的細菌。
本發明所提供的細菌是芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212，該菌株已于2011年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5035。本發明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035。該菌劑除包含作為活性成分的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035夕卜，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸桿、松殼、稻草、花生皮等。該菌劑可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、產生固氮酶等。
所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在制備下述I)-4)中任一菌劑中的應用也屬于本發明的保護范圍I)用于抑制病原真菌的菌劑；2)用于防治植物真菌病害的菌劑；3)用于固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。所述病原真菌為通過土壤、施入土壤中的肥料、和/或種子傳播的真菌，具體可為引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害可為菌核病。所述引起菌核病的真菌可為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035或以芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035為活性成分的菌劑在生產固氮酶中的應用以及在制備生物有機肥中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明的再一個目的是提供一種含有芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCCNo. 5035或以芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035為活性成分的菌劑的生物有機肥。本發明的又一目的是提供一種培養芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCCNo. 5035的方法，包括將芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在用于培養芽孢桿菌的培養基中培養的步驟。本發明的又一目的是提供一種制備所述菌劑的方法，該方法包括如下步驟將所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035作為活性成分，得到所述菌劑。實驗證明，本發明是從土壤樣品中經過層層篩選，最終篩選出了芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，該菌株具有很高的固氮酶活性，能夠拮抗作物菌核病病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum),競爭適應能力強,接種效果好,在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產中具有廣闊的應用前景。保藏說明菌種名稱芽孢桿菌拉丁名(Bacillussp.)菌株編號⑶SD212保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號
保藏日期2011年7月6日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 503
圖I為芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035的固氮酶活性。圖2 為芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035 拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。 左側菌落為病原真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum),右側菌落為芽抱桿菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No. 5035。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。固氮菌富集培養液ACCC55 成份蔗糖 10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3Ig^MgSO4 · 7H20 0. 2g、蒸餾水 1000ml、pH 7. 0 7. 2。改良固氮培養基成份蔗糖10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸餾水 1000ml、瓊脂 I. 5% 2· 0%, pH7. 0 7· 2。無氮培養基蔗糖10g，NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg,MgSO4 · 7H200. 2g，蒸餾水 IOOOmL, pH7. 2。圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (參見“孫建光等.高效固氮芽孢桿菌篩選及其生物學特性.中國農業科學，2009，42 ￠) :2043-2051”)。菌核病菌-核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中國農業微生物菌種保藏管理中心，ACCC30046)。實施例I、固氮菌⑶SD212的分離與鑒定一、固氮菌⑶SD212的富集與分離取IOg土樣(中國黑龍江省氮素營養相對貧瘠的農田土壤)放入90ml無菌水中搖床振蕩20min制成混濁液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培養液ACCC55中，lOOrpm，28°C進行搖床振蕩培養，72h后換新鮮培養液繼續培養。重復培養3次后進行固氮芽孢菌分離。吸取Iml上述固氮菌富集培養物放到9ml無菌水中制成KT1稀釋度，繼續稀釋制成10_2、10_3、10_4、10_5稀釋度的菌懸液，在100°C沸水中加熱lOmin，冷卻后每個稀釋度取0. Iml涂布在固氮菌分離培養基平板上，29°C靜置培養。2 3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌培養基平板上，用平板劃線法進行菌種純化。將分離并純化所得的其中一個菌株命名為固氮菌 GDSD212。二、固氮菌⑶SD212的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一分離并純化得到的固氮菌⑶SD212 I、形態學鑒定將處于對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟一分離并純化得到的固氮菌GDSD212進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規則、放射狀等)。對于處于對數生長期的所述固氮菌⑶SD212，經涂片染色后采用光學顯微鏡觀察菌體的形態。結果表明，上述步驟一分離并純化得到的固氮菌⑶SD212菌落圓形凸起，淺乳白色，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體桿狀，O. 5 X 2. O 3. O μ m，有芽孢。2、生理生化特征分析參考《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊.北京科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗(第三版).北京高等教育出版社，1999.)測定上述固氮菌⑶SD212的生理生化特征。所述固氮菌⑶SD212的生理生化特征測定結果如表I所示表I固氮菌⑶SD212的生理生化特征·
生理生化特征實驗結果生理生化特征實驗結果
接觸酶反應__+ 糖D+葡萄糖__-
VP反應__- 醇D+蔗糖__+吲哚實驗__+ 類D+乳糖__-
明膠液化__+ 發D+半乳糖__-
淀粉水解__+ 酵D+核糖__+
卵磷脂酶__- 產L+阿拉伯糖一
硝酸鹽還原__+ 酸D+果糖__+
甲基紅__~__D+甘露酉早__—
石蕊牛奶反應__+D+山梨醇__+
梓檬酸鹽利用__—__D+麥芽糖__+ 苯丙氨酸脫氨酶__=__D+纖維二糖十
產二輕基丙酮__—__甘油glycerol__—
葡萄糖產氣__+ 2%NaCl__-
pH5.7生長測定__+___
0.001%溶菌酶__+___注“ + ”表示陽性，“”表示陰性。3、16s rDNA序列同源性分析常規方法培養上述步驟一分離純化得到的固氮菌GDSD212，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細菌16s rDNA通用引物，27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行PCR反應。反應體系采用上海生物工程有限公司PCR擴增試劑盒。反應程序為95°C變性30s、55°C退火lmin、72°C延伸2min，共30個循環。DNA測序由北京三博遠志生物技術公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，序列比對通過美國國家生物技術信息中心NCBI數據庫(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)在線完成。固氮芽孢菌⑶SD212菌株16s rDNA的序列詳見序列表中序列I。
4、生長特性分析進行了菌株最適溫度和最適pH生長實驗。采用無氮培養基分別在4°C、28°C、37°C、60°C培養、觀察、記錄菌株的溫度適應性，每個處理3次重復。調整酸度分別為pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pHIO、pHll，每個處理3次重復，培養、觀察、記錄菌株生長的最適pH。結果表明，所述固氮菌⑶SD212的最適生長溫度為28°C，最適生長pH為pH7 8。鑒于上述形態、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析結果，將步驟一分離并純化得到的固氮菌GDSD212鑒定為變型細菌α亞群芽孢桿菌科芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。該固氮菌⑶SD212已于2011年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.5035。實施例2、芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035固氮酶活性測定·對實施例I所得的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035進行固氮酶活性測定，具體操作如下所述在15X 150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培養基制成斜面，接種芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，28°C培養。以微生物肥料常用生產菌種圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCC11103為陽性對照,不接種空白斜面為陰性對照，設3個重復。培養72h后，換橡膠塞，注入乙炔氣體使終濃度為10%，用醫用膠布密封，繼續培養72h，取100 μ I反應氣體，用氣相色譜儀測定乙烯生成量，根據以下公式計算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg ·1ι) = C2H4nmol/[菌體蛋白量(mg) X反應時間(h)]，其中 C2H4nmol = IOOOXC2H4 體積(μ I) X 273XP/[22. 4X (273+t) X 760]，其中P為氣壓(mm汞柱)，t為反應溫度CC )。其中，菌體蛋白含量測定方法如下所述用5ml生理鹽水將試管斜面上的菌苔洗入離心管中，收集菌體，向沉淀中加入3ml 0. 5M的NaOH沸水煮沸5min,加入3ml 0. 5M的HCl混合，離心后取上清I. Oml，加入5ml考馬斯亮藍溶液，在漩渦混合器上混合，顯色3min，測定595nm處的吸光值A595，根據牛血清白蛋白標準曲線計算菌體蛋白含量。結果顯示，篩選到的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035的固氮酶活性為68. 403nmol C2H4/h -mg蛋白，統計分析顯著高于微生物肥料常用生產菌種圓褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性25. IOOnmol C2H4/h · mg蛋白，如圖I所示。這一結果表明，本發明的芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD212 CGMCC No. 5035能高效固氮。實施例3、芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035拮抗病原真菌抑菌率測定采用兩點對峙法對實施例I所得到的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCCNo. 5035進行拮抗病原真菌抑菌率測定，具體操作如下所述在PDA平板上距離中心2cm的兩點上分別接種作物病原真菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，每個篩選處理3個重復，以只接病原真菌不接固氮菌的平板為對照。28°C恒溫培養，15d后用毫米刻度尺測量對峙平板上病原真菌沿被測芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035方向的菌落半徑Γι、及對照平板上病原真菌的菌落半徑4。病原真菌生長抑制率(％)=(對照半徑對峙培養病原真菌菌落半徑r)/對照半徑rQX 100%。
結果顯不，菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的 rQ 是 63. 0±2· Imm，I11 是 14.67±1. 13mm。將平均值代人上述公式計算得所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCCNo. 5035對菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率為 76. 71 %，如圖 2所不。
權利要求
1.芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD212，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5035。
2.一種菌劑，它的活性成分為權利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCC No. 5035。
3.根據權利要求2所述的菌劑，其特征在于所述菌劑為下述I)-4)中任一的菌劑 1)用于抑制病原真菌的菌劑； 2)用于防治植物真菌病害的菌劑； 3)用于固氮的菌劑； 4)產生固氮酶的菌劑。
4.權利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD212 CGMCC No. 5035在制備下述I)-4)中任一的菌劑中的應用 1)用于抑制病原真菌的菌劑； 2)用于防治植物真菌病害的菌劑； 3)用于固氮的菌劑； 4)產生固氮酶的菌劑。
5.根據權利要求3所述的菌劑或權利要求4所述應用，其特征在于所述病原真菌為引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害為菌核病。
6.根據權利要求5所述的菌劑或應用，其特征在于所述引起菌核病的真菌為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
7.權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或權利要求.2、3、5、或6所述菌劑在生產固氮酶中應用；或， 權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或權利要求2、.3、5、或6所述菌劑在生產生物有機肥中應用。
8.含有權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或權利要求2、3、5、或6所述菌劑的生物有機肥。
9.培養權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD212 CGMCC No. 5035的方法，包括將芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在用于培養芽孢桿菌的培養基中培養的步驟。
10.權利要求2、3、5或6所述菌劑的制備方法，包括如下步驟將權利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035作為活性成分，得到所述菌劑。
全文摘要
本發明公開了拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途。該固氮芽孢菌是芽孢桿菌(Bacillus sp.)GDSD212，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.5035。本發明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035具有較高的固氮活性，可以有效拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C05G3/00GK102876596SQ20111019758
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月15日 優先權日2011年7月15日
發明者周劍浩, 孫建光, 江峰, 徐晶, 張友恒 申請人:上海環墾生態科技有限公司, 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所