專利名稱：一種用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制作方法
一種用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜技術領域
本發明屬于環境微生物污染控制技術領域，具體涉及一種共固定化抗生素和溶菌酶用于室內微生物污染防治的新型膜功能材料。
背景技術：
細菌、真菌等微生物無處不在、無孔不入，其生存空間與人們日常生活息息相關， 如空調、電腦、電話機等生活用具均為微生物的棲息地。由于這些設備使用頻率高、使用人員復雜、消毒滅菌不及時，被微生物污染的趨勢愈來愈嚴重，特別是病原微生物，嚴重的威脅著人們的身心健康，已奪取了成千上萬人的生命。生活用品的微生物的污染與控制已經成為環境保護的一項重要內容，引起越來越多人的重視。
溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質酶，是一種專門作用于細菌細胞壁的水解酶，主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β -1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶廣泛存在于生物組織中，作為一種無毒蛋白質，能選擇性地分解微生物的細胞壁又不破壞其它的組織。且溶菌酶抗菌譜較廣，不僅對G+菌有很好的滅菌效果，對G—也有很好的抑制效果。 溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。因其具有抑菌效果好、抗熱抗酸、活力穩定、安全性高、生產成本低等優點而被廣泛用于各種微生物控制領域。伊曲康唑(itraconazole，ICZ)是一種親脂性三氮唑類廣譜抗真菌藥，其作用機制是高選擇性地抑制真菌細胞的細胞色素酶，依賴酶的活性，導致真菌細胞膜損傷，從而使真菌細胞死亡。亦可抑制真菌細胞膜的主要成份之一麥角留醇的合成，從而發揮抗真菌效應。對包括酵母菌、霉菌等在內的大部分真菌有很好的抑制效果。同時選擇使用這兩種抗微生物藥劑能高效、安全的控制細菌和真菌等絕大部分微生物的滋生，因二者作用機制和作用對象明顯不同，理論上同時使用不會發生拮抗作用，然而游離藥劑的應用存在技術上的困難，且不能回收利用，易對環境造成二次污染，限制了其在家電維護方面的使用。
電紡纖維膜是以高分子聚合物為原料，利用電紡技術制備而得到的。該技術是一種應用高壓電使帶電荷的高分子溶液或熔體在靜電場中流動或變形，然后由于溶劑蒸發或熔體冷卻而固化，最終產生直徑數十納米到幾十毫米的纖維的過程。電紡纖維膜具有比表面積大、孔隙率高和吸附性能強等優點，是一種潛在的酶固定化基質。將其作為固定化酶的載體，有利于酶與底物充分接觸，能有效提高酶的催化效率，且容易從反應體系中分離回收。伊曲康唑作為一種具有三唑環的唑類抗生素，固定化后不會影響其抑菌效力，且解決了其不能回收利用、易流失等缺點。制備電紡纖維膜所用的高分子聚合物可以選用可生物降解的親水性高分子材料(如聚乙烯醇)，這類材料在自然界中可逐漸完全降解為二氧化碳和水，并不會對環境造成二次污染，是一種環境友好材料。負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜能同時抑制細菌和真菌的滋生，將其應用于家電設備的微生物污染防治方面，相比其它的微生物防治技術，具有高效、便捷、無二次污染等優點，為微生物防治技術提供了一種新的思路，有著廣闊的應用前景。發明內容
本發明的目的在于提供一種新型的用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜，即利用靜電紡絲技術將溶菌酶和伊曲康唑直接共固定于聚乙烯醇納米纖維中，得到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜。該纖維膜利用溶菌酶的廣譜殺菌效果以及伊曲康唑的高效抗真菌效果，抑制大多數微生物的滋長，此方法在于安全、便捷、高效的達到抑菌效果。
本發明是通過采用以下的技術方案來實現上述發明目的
本發明所提供的用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜是以高分子量的聚乙烯醇為原料，通過靜電紡絲技術制備得到載有溶菌酶和伊曲康唑的電紡纖維膜，然后將其用于室內空調的微生物防治。本發明主要包括兩個步驟負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備及利用其抑制室內空調微生物的滋長。
其中，負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟包括
1)將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108溶于6. 4克去離子水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清，制備成共聚物混合凝膠；
2)分別將一定量的溶菌酶、伊曲康唑溶于1. 0毫升磷酸鹽緩沖溶液(pH值為6. 5) 和121°C，0. IMPa條件下滅菌21分鐘所得到的無菌水中，振蕩搖勻至全部溶解；
3)將步驟幻中的溶菌酶與伊曲康唑溶液全部同時加入步驟1)所得的共聚物混合凝膠中，并劇烈震蕩混合20分鐘制備成均質溶液；
4)將步驟幻中所得均質溶液引入到高壓靜電紡絲裝置中，調節各參數以獲得穩定連續的噴射；
5)在接收板的鋁箔上收集纖維，4 5小時后待纖維膜厚度達到0. 5 1毫米，停止紡絲，得到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜；
利用負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜抑制室內空調微生物的滋長的步驟包括
a)將制備得到的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜剪成4片(規格為3厘米X3 厘米)，然后向100毫升的液體牛肉膏蛋白胨培養基和100毫升馬液體鈴薯葡萄糖培養基中各加入2片膜；
b)對辦公室空調過濾網采樣后制備菌懸液，然后分別取1毫升菌懸液加入到步驟 a)中所述的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯葡萄糖培養基中，培養過程中采用比濁法測定微生物含量。
本發明中聚乙烯醇的醇解度為98 99%，平均聚合度為MOO 2500，其在水中的質量濃度為6%。
本發明的方法中，負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟1)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式為PE0132-PP050-PE0132，分子量為 15500克/摩爾，F108的用量為聚乙烯醇質量的5%。
本發明的方法中，伊曲康唑分子式為C35H38Cl2N8O4，分子量為582. 58克/摩爾，溶菌酶為超純級(ultra pure Grade)，均可由相應的供應商獲得。
本發明的方法中，微生物測定采用比濁法，即用空白培養基為陰性對照，利用分光光度計(Varian，Cary50)在450納米條件下測培養液的吸光度值。
本發明的優點在于本發明利用靜電紡絲技術將伊曲康唑和溶菌酶直接共固定于電紡纖維膜中，從而解決了游離溶菌酶和伊曲康唑易流失、不能回收利用等問題。而且，將此負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜應用于室內家電設備的微生物污染防治方面具有高效、便捷、無二次污染的優點。
圖1為負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的掃描電子顯微鏡圖像；
圖2為將菌懸液分別接種不同培養基的培養結果(a 有負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的富集細菌的牛肉膏蛋白胨培養基；b 有負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的富集真菌的馬鈴薯葡萄糖培養基；c 無負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的富集細菌的牛肉膏蛋白胨培養基；d 無負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜富集真菌的馬鈴薯葡萄糖培養基)。
具體實施方式
本發明所提供的用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜主要包括兩個步驟負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備及利用其抑制室內空調微生物的滋長。
其中，負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟包括
1)將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108溶于6. 4克去離子水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清，制備成共聚物混合凝膠；
2)分別將一定量的溶菌酶、伊曲康唑溶于1. 0毫升磷酸鹽緩沖溶液(pH值為6. 5) 和121°C，0. IMPa條件下滅菌21分鐘所得到的無菌水中，振蕩搖勻至全部溶解；
3)將步驟幻中的溶菌酶與伊曲康唑溶液全部同時加入步驟1)所得的共聚物混合凝膠中，并劇烈震蕩混合20分鐘制備成均質溶液；
4)步驟幻中所得均質溶液引入到高壓靜電紡絲裝置中，調節各參數，在電壓為18 千伏-20千伏，接收距離為15厘米，溶液流速為0. 5毫升/分 1. 0毫升/分條件下獲得穩定連續的噴射；
5)在接收板的鋁箔上收集纖維，4 5小時后待纖維膜厚度達到0. 5 1毫米，停止紡絲，得到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜；
利用負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜抑制室內空調微生物的滋長的步驟包括
a)將制備得到的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜剪成4片(規格為3厘米X3 厘米)，然后向100毫升的液體牛肉膏蛋白胨培養基和100毫升馬鈴薯葡萄糖培養基中各加入2片膜；
b)對辦公室空調過濾網采用五點取樣法進行2厘米X 2厘米取樣，用無菌棉簽在空調過濾網的每個采樣點往返涂抹五次采樣，之后將棉簽放入2. 0毫升無菌水中，充分振蕩制備菌懸液，然后分別取1毫升菌懸液加入到步驟a)中所述的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯葡萄糖培養基中，培養過程中采用比濁法測定微生物含量。
本發明中聚乙烯醇的醇解度為98 99%，平均聚合度為MOO 2500，其在水中的質量濃度為6%。
本發明的方法中，負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟1)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式為PE0132-PP050-PE0132，分子量為 15500克/摩爾，F108的用量為聚乙烯醇質量的5%。
本發明的方法中，伊曲康唑分子式為C35H38Cl2N8O4，分子量為582. 58克/摩爾，溶菌酶為超純級(ultra pure Grade)，均可由相應的供應商獲得。
本發明方法中，負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟幻中添加溶菌酶的質量范圍為2. 8 4. 8克，添加伊曲康唑的質量范圍為0. 2 0. 4克。
本發明方法中，利用負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜抑制室內空調微生物的滋長的步驟a)中加入2片負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜(規格為3厘米X3厘米)的質量范圍為0. 10 0.11克。
本發明的方法中，微生物測定采用比濁法，即用空白培養基為陰性對照，利用分光光度計(Varian，Cary50)在450納米條件下測培養液的吸光度值。
實施例1
1)將0. 6g分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和0. 03g嵌段共聚物F108溶于6. 4克去離子水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清，制備共聚物混合凝膠；
2)分別將2. 8克溶菌酶、0. 2克伊曲康唑溶于pH值為6. 5的1. 0毫升磷酸鹽緩沖溶液和1. 0毫升在121°C，0. IMPa條件下滅菌21分鐘所得到的無菌水中，振蕩搖勻至全部溶解；
3)將步驟幻中的溶菌酶與伊曲康唑溶液全部同時加入步驟1)所得的共聚物混合凝膠中，并在旋渦混合器上混合20分鐘制備成均質溶液；
4)步驟幻中所得均質溶液引入到高壓靜電紡絲裝置中，調節各參數，在電壓為18 千伏-20千伏，接收距離為15厘米，溶液流速為0. 5毫升/分 1. 0毫升/分條件下獲得穩定連續的噴射，并在接收板的鋁箔上收集纖維膜，4 5小時后待纖維膜厚度達到0. 5 1.0毫米，停止紡絲，得到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜；
5)將制備得到的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜剪成4片(規格為3厘米X3 厘米)，然后向100毫升的液體牛肉膏蛋白胨培養基和100毫升馬鈴薯葡萄糖培養基中各加入2片膜；
6)對辦公室空調過濾網采用五點取樣法進行2厘米X 2厘米取樣，用無菌棉簽在空調過濾網的每個采樣點往返涂抹五次采樣，之后將棉簽放入2. 0毫升無菌水中，充分振蕩制備菌懸液；然后分別取1毫升菌懸液加入到步驟幻中所述的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯葡萄糖培養基中，培養過程中采用比濁法測定微生物含量，觀察到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜對細菌的抑制周期為3天，對真菌的抑制周期為7天。
實施例2
調整實施例1步驟2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分別為3. 8克和0. 28克，其余步驟與實施例1相同，觀察到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜對細菌的抑制周期為4 天，對真菌的抑制周期為8天。
實施例3
調整實施例1步驟2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分別為4. 4克和0. 3克，其余步驟與實施例1相同，觀察到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜對細菌的抑制周期為4天， 對真菌的抑制周期為8天。
實施例4
調整實施例1步驟2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分別為4. 6克和0. 35克，其余步驟與實施例1相同，觀察到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜對細菌的抑制周期為5 天，對真菌的抑制周期為9天。
實施例5
調整實施例1步驟2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分別為4. 8克和0. 4克，其余步驟與實施例1相同，觀察到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜對細菌的抑制周期為5天， 對真菌的抑制周期為9天。
權利要求
1.一種用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜，其特征在于 負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟包括1)將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物 F108溶于6. 4克去離子水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清，制備成共聚物混合凝膠；2)分別將一定量的溶菌酶、伊曲康唑溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖溶液(pH值為6. 5)和 1. 0毫升121°C，0. IMPa條件下滅菌21分鐘所得到的無菌水中，振蕩搖勻至全部溶解；3)將步驟幻中的溶菌酶與伊曲康唑溶液全部同時加入步驟1)所得的共聚物混合凝膠中，并劇烈震蕩混合20分鐘制備成均質溶液；4)步驟幻中所得均質溶液引入到高壓靜電紡絲裝置中，調節各參數以獲得穩定連續的噴射；5)在接收板的鋁箔上收集纖維，4 5小時后待纖維膜厚度達到0.5 1毫米，停止紡絲，得到負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜。
2.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟1)中所述的聚乙烯醇的醇解度為98 99%，平均聚合度為MOO 2500，其在水中的質量濃度為6%。
3.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟1)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式為 PE0132-PP050-PE0132，分子量為15500克/摩爾，F108的用量為聚乙烯醇質量的5%。
4.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟2)中添加溶菌酶的質量范圍為2. 8 4. 8克，添加伊曲康唑的質量范圍為0. 2 0.4 克。
5.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜的制備步驟4)中所用的電紡參數為電壓18千伏-20千伏，接收距離15厘米，溶液流速0. 5毫升/分 1.0毫升/分。
全文摘要
本發明涉及一種用于防治室內微生物污染的負載伊曲康唑-溶菌酶電紡纖維膜。利用靜電紡絲技術可以將能抑制真菌的伊曲康唑和溶解細菌的溶菌酶同時共固定于電紡纖維膜中。將負載溶菌酶和伊曲康唑的電紡纖維膜用于抑制空調過濾網上微生物滋長。該負載溶菌酶和伊曲康唑的電紡纖維膜能夠高效、便捷的控制微生物的滋長。相比其它的微生物防治技術，負載溶菌酶和伊曲康唑的電紡纖維膜效率高、無能耗、環境友好，可實現對常見室內微生物持續穩定的防治和滅除。
文檔編號A01P1/00GK102505180SQ20111027513
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者彭可揚 申請人:彭可揚