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用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法

文檔序號:551196閱讀:529來源:國知局
專利名稱:用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法
技術領域
本發明涉及一種用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法。
背景技術
生物膜是微生物治理環境污染的重要方法之一,可應用于各種工業企業的污水處理場和市政污水處理場所采用的生物濾池和各種工業或生活產生廢氣的處理塔或處理池。
用生物膜進行廢氣或污水污染控制是目前國內外研究熱點也是發展方向,迄今該領域研究中存在的主要問題是生物膜的菌群組成和空間結構在線快速檢測,即生物膜的解析,一般均以“暗箱”模式進行各種工藝研究及優化,故難以揭示菌群構成與生物膜處理效果之間關系,從而影響對該工藝進行本質的優化,達不到最好的效果。
目前部分研究對生物膜內部的菌群情況采用MPN(Maximum PossibleNumber)方法計數,費時而且需離線進行。另有采用熒光原位雜交FISH(fluorescence in situ hybridization)方法和PCR分子鑒定方法分析活性污泥中特定細菌(如硝化細菌)數目。FISH方法MPN方法有很大進步,但仍須進行以熒光標記探針雜交操作后方可進行熒光觀察。PCR方法需要核酸提取,PCR反應和凝膠電泳鑒定。這些方法存在以下缺點破壞了生物膜的完整性;操作復雜;實時性差。
(三)

發明內容
本發明既是為了提供一種解析過程簡單快捷、對生物膜無破壞性且實時性好的用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法。
為達到發明目的本發明采用的技術方案是一種用于構造生物膜的成膜菌劑,所述的成膜菌劑菌株用有色熒光蛋白基因標記。
所述的成膜菌為大腸菌群或硝化細菌之一或其混合物,所述的不同種的成膜菌標記不同色的熒光蛋白基因標記。
所述成膜菌也可為單一菌種,所述有色熒光蛋白為綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白或紅色熒光蛋白。
用所述的成膜菌劑構造生物膜。
所述的構造生物膜的方法為成膜菌劑菌株用熒光蛋白基因標記后,獲得的標記菌株與生物填料在氨芐含量為20~150μg/mL的培養基中、20~50℃下共混培養1~8天得到所述的生物膜。
所述的成膜菌劑菌株為大腸菌群或硝化細菌之一或其混合。
所述的生物填料為火山巖或多孔碳顆粒。
所述的方法如下有色熒光蛋白基因經CaCl2或電穿孔法轉化標記成膜菌劑菌株,獲得的標記菌株接種氨芐含量為20~150μg/mL的培養基、與生物填料在20~50℃下共混培養1~8天即得到所述的生物膜。
具體的,所述的方法如下綠色熒光蛋白基因pEGFP經CaCl2轉化法標記大腸桿菌菌株,獲得的標記菌株接種氨芐含量為50~150μg/mL的培養基、在搖瓶中與火山巖顆粒在30~45℃下共混培養1~8天即得到所述的生物膜。
或者,所述的方法如下綠色熒光蛋白基因pEGFP經電穿孔法轉化標記硝化桿菌菌株,獲得的標記菌株接種氨芐含量為50~150μg/mL的培養基、在搖瓶中與多孔碳顆粒在30~45℃下共混培養1~8天即得到所述的生物膜。
所得生物膜的解析方法如下用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得火山巖或者多孔碳填料生物膜選定區域不同層面的圖片堆,比如選取250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片經COMSTAT程序處理便可以獲得生物膜定量化參數,如生物膜平均厚度、最大厚度、生物膜表面積及生物膜比表面積等,用以表征生物膜的空間結構特征。
本發明所述的用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法的有益效果主要體現在(1)可保證生物膜不被破壞的情況下進行解析,達到原位分析的目的;(2)生物膜解析過程中不需對生物膜中微生物細菌進行培養計數或提取細菌細胞的核酸進行雜交或電泳等鑒定分析,操作簡單方便;(3)生物膜的解析在線進行,實時性好。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述實施例1綠色熒光蛋白基因載體pEGFP經CaCl2轉化法標記大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含50μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與火山巖顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(37℃,120r/min,1天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得火山巖填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理獲得相關的定量化參數1天生物膜平均厚度為0.120844μm,生物膜最大厚度為10.5μm,單位面積的生物膜體積為0.136986μm3/μm2,生物膜表面積21338.1μm2,生物膜比表面積為3.36854μm2/μm3。
實施例2綠色熒光蛋白基因載體pEGFP經電穿孔轉化法標記大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含150μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與多孔碳顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(37℃,120r/min,1天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得多孔碳填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理獲得相關的定量化參數1天生物膜平均厚度為0.110685μm,生物膜最大厚度為9.1μm,單位面積的生物膜體積為0.116928μm3/μm2,生物膜表面積18982.3μm2,生物膜比表面積為3.05456μm2/μm3。
實施例3綠色熒光蛋白基因載體pEGFP經CaCl2轉化法標記硝化桿菌Nitrobacter sp.N-20菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含50μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與火山巖顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(30℃,120r/min,7天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得火山巖填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理可以獲得相關的定量化參數,7天生物膜平均厚度為0.121085μm,生物膜最大厚度為11.2μm,單位面積的生物膜體積為0.198646μm3/μm2,生物膜表面積21338.1μm2,生物膜比表面積為4.36854μm2/μm3。
實施例4綠色熒光蛋白基因載體pEGFP經電穿孔法轉化標記硝化桿菌Nitrobacter sp.N-20菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含50μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與多孔碳顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(30℃,120r/min,7天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得多孔碳填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理可以獲得相關的定量化參數,7天生物膜平均厚度為0.132148μm,生物膜最大厚度為12.6μm,單位面積的生物膜體積為0.263966μm3/μm2,生物膜表面積30513.7μm2,生物膜比表面積為4.98865μm2/μm3。
實施例5黃色熒光蛋白基因載體pEYFP經CaCl2轉化法標記大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含50μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與多孔碳顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(25℃,120r/min,5天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得多孔碳填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理可以獲得相關的定量化參數,5天生物膜平均厚度為0.128365μm,生物膜最大厚度為11.9μm,單位面積的生物膜體積為0.213586μm3/μm2,生物膜表面積28945.5μm2,生物膜比表面積為4.43568μm2/μm3。
實施例6藍色熒光蛋白基因載體pECFP經電穿孔法轉化標記硝化桿菌Nitrobacter sp.N-20菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含50μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與多孔碳顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(45℃,120r/min,3天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得多孔碳填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理可以獲得相關的定量化參數,3天生物膜平均厚度為0.120336μm,生物膜最大厚度為10.2μm,單位面積的生物膜體積為0.168795μm3/μm2,生物膜表面積20568.6μm2,生物膜比表面積為3.98465μm2/μm3。
實施例7紅色熒光蛋白基因載體pDsRed 2-1經CaCl2轉化法標記硝化桿菌Nitrobacter sp.N-20菌株,獲得的標記菌株作為模式細菌以5環/瓶的接種量接種含50μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與火山巖顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(35℃,120r/min,6天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取獲得火山巖填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理可以獲得相關的定量化參數,6天生物膜平均厚度為0.121085μm,生物膜最大厚度為12.2μm,單位面積的生物膜體積為0.184567μm3/μm2,生物膜表面積20391.6μm2,生物膜比表面積為4.29654μm2/μm3。
實施例8綠色熒光蛋白基因載體pEGFP經電穿孔轉化法標記大腸桿菌Escherichia coii JM109菌株,紅色熒光蛋白基因載體pDsRed經電穿孔法轉化標記硝化桿菌Nitrobacter sp.N-20菌株,獲得的標記菌株分別作為模式細菌以2環/瓶的接種量接種含150μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與多孔碳顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(37℃,120r/min,7天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡以不同激發光(480nm和580nm)分別攝取獲得多孔碳填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理獲得相關的定量化參數7天生物膜(綠色)平均厚度為0.15285μm,生物膜最大厚度為12.5μm,生物膜體積為0.13198μm3,生物膜表面積209882.3μm2,生物膜比表面積為3.55561μm2/μm3。7天生物膜(紅色)平均厚度為0.10165μm,生物膜最大厚度為8.2μm,生物膜體積為0.09692μm3,生物膜表面積13256.3μm2,生物膜比表面積為2.00446μm2/μm3。
實施例9黃色熒光蛋白基因載體pEYFP經電穿孔轉化法標記大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株,藍色熒光蛋白基因載體pECFP經電穿孔法轉化標記硝化桿菌Nitrobacter sp.N-20菌株,獲得的標記菌株分別作為模式細菌以2環/瓶的接種量接種含150μg/mL氨芐的LB培養基50mL/瓶,在搖瓶中與多孔碳顆粒(5g/瓶)共混培養掛膜(37℃,120r/min,7天)。用激光共聚焦掃描顯微鏡以不同激發光(520nm和440nm)分別攝取獲得多孔碳填料生物膜250×250μm區域不同層面的圖片堆,所獲圖片堆經COMSTAT程序處理獲得相關的定量化參數7天生物膜(藍色)平均厚度為0.13525μm,生物膜最大厚度為11.5μm,生物膜體積為0.12388μm3,生物膜表面積189823.1μm2,生物膜比表面積為3.23555μm2/μm3。7天生物膜(黃色)平均厚度為0.11625μm,生物膜最大厚度為7.9μm,生物膜體積為0.10628μm3,生物膜表面積128326.1μm2,生物膜比表面積為2.20656μm2/μm3。
權利要求
1.一種用于構造生物膜的成膜菌劑,其特征在于所述的成膜菌劑菌株用有色熒光蛋白基因標記。
2.如權利要求1所述的用于構造生物膜的成膜菌劑,其特征在于所述的成膜菌為大腸菌群或硝化細菌之一或其混合物,所述的不同種的成膜菌標記不同色的熒光蛋白基因標記。
3.如權利要求1所述的用于構造生物膜的成膜菌劑,其特征在于所述成膜菌為單一菌種,所述有色熒光蛋白為下列之一①綠色熒光蛋白 ②黃色熒光蛋白③紅色熒光蛋白 ④藍色熒光蛋白。
4.用如權利要求1所述的成膜菌劑構造生物膜。
5.如權利要求4所述的構造生物膜的方法為成膜菌劑菌株用熒光蛋白基因標記后,獲得的標記菌株與生物填料在氨芐含量為20~150μg/mL的培養基中、20~50℃下共混培養1~8天得到所述的生物膜。
6.如權利要求4所述的構造生物膜的方法,其特征在于所述的生物填料為火山巖或多孔碳顆粒。
7.如權利要求4~6所述的構造生物膜的方法,其特征在于所述的方法如下有色熒光蛋白基因經CaCl2或電穿孔法轉化標記成膜菌劑菌株,獲得的標記菌株接種氨芐含量為20~150μg/mL的培養基、與生物填料在20~50℃下共混培養1~8天即得到所述的生物膜。
8.如權利要求7所述的構造生物膜的方法,其特征在于所述的方法如下綠色熒光蛋白基因pEGFP經CaCl2轉化法標記大腸桿菌菌株,獲得的標記菌株接種氨芐含量為50~150μg/mL的培養基、在搖瓶中與火山巖顆粒在30~45℃下共混培養1~8天即得到所述的生物膜。
9.如權利要求5所述的構造生物膜的方法,其特征在于所述的方法如下綠色熒光蛋白基因pEGFP經電穿孔法轉化標記硝化桿菌菌株,獲得的標記菌株接種氨芐含量為50~150μg/mL的培養基、在搖瓶中與多孔碳顆粒在30~45℃下共混培養1~8天即得到所述的生物膜。
10.用如權利要求1所述的成膜菌劑構成生物膜的解析方法,其特征在于所述的方法是用激光共聚焦掃描顯微鏡攝取所述生物膜選定區域不同層面的圖片堆,所獲圖片經COMSTAT程序處理便可得到生物膜定量化參數。
全文摘要
本發明提供了一種用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法。所述的成膜菌劑菌株用有色熒光蛋白基因標記。本發明所述的用于構造生物膜的成膜菌劑及其構造和解析生物膜的方法的有益效果主要體現在(1)可保證生物膜不被破壞的情況下進行解析,達到原位分析的目的;(2)生物膜解析過程中不需對生物膜中微生物細菌進行培養計數或提取細菌細胞的核酸進行雜交或電泳等鑒定分析,操作簡單方便;(3)生物膜的解析在線進行,實時性好。
文檔編號C12N1/00GK1644674SQ20041009306
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月10日 優先權日2004年12月10日
發明者鐘衛鴻, 陳建孟, 葉海仁, 汪琨, 宋艷絨, 路爭 申請人:浙江工業大學
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