專利名稱：O-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿抑菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于一種天然抑菌劑-0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿及其制備方法。
背景技術：
隨著人民生活水平提高，健康和綠色的概念越來越被大眾所接受。開發高效、安全、廣譜、性能穩定的天然防腐抗菌劑越來越受到研究者的關注。對天然防腐抗菌劑的市場需求也必然日益增長。國內外的研究結果表明，殼聚糖的抗菌活性與分子量有一定相關性，分子量在 5000以下溶解性明顯改善的低聚殼聚糖表現出較強的抗菌活性。但與已有的化學合成抗菌劑相比，抗菌活性依然較低且對真菌類基本上沒有抑制活性。與眾多具有抗菌活性的天然提取物相比，低聚殼聚糖具備開發的眾多潛在優勢1)殼聚糖具有可生物降解性、生物相容性、生物無毒性；2)其分子結構上C2-NH2和C6-OH均是結構修飾的理想位點，可通過化學改性來進一步提高抗菌活性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種天然抑菌劑0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法。近年隨著對各種化合物研究的深入，酚酸類化合物的抗菌性能及抗病毒作用逐漸被認知和利用。本發明旨在抑菌較強的低聚殼聚糖分子結構C2-NH2和C6-OH上引入具有較強抑菌活性的酚羥基基團，從而制備一種新型具有多抗菌活性中心的天然抑菌劑。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案一種0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿，在分子量為3000 5000的聚殼聚糖分子結構上WC2-NH2與水楊醛修飾成形成席夫堿，其中，席夫堿取代度大于95m0l% ；并在所述的聚殼聚糖分子結構中的C6-OH與水楊酸酯化，其酯化度為60mol% -75mol%。用本發明的所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿作為抑菌劑。本發明的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿作為抑菌劑，該抑菌劑對大腸桿菌、金色葡萄球菌和啤酒酵母菌具有抑制作用。一種0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，該方法包括下述步驟(1)將分子量為3000 5000的低聚殼聚糖置于2體積％ 4體積％醋酸溶液和甲醇的混合液中，其中，醋酸溶液和甲醇為等體積，低聚殼聚糖在醋酸溶液和甲醇的混合液中的質量濃度為4% 8%，溶脹lh-2h ；(2)將水楊醛溶解于甲醇中，該甲醇和步驟(1)中所用的甲醇是等體積的，溶解后再加入到溶脹完成的步驟(1)得到的低聚殼聚糖溶液中，在室溫下攪拌下反應20 Mh，其中，水楊醛與低聚殼聚糖用量摩爾比Oi(Lffl2))為6 8 1 ；(3)將步驟O)中得到的制備液調節pH呈中性后過濾，對截留物經浸泡、洗滌、過濾和干燥后，得取代度大于95mol%的低聚殼聚糖水楊醛席夫堿；(4)將步驟C3)合成的低聚殼聚糖水楊醛席夫堿溶于二氯甲烷，溶解的濃度為 1. Owt % 5. Owt 再加入作為催化劑的4-二甲氨基吡啶和作為脫水劑的3A分子篩后，加入作為修飾成分的水楊酸，在冰水浴條件下攪拌反應10min-15min后加入DCC (N，N’ - 二環己基碳酰亞胺)，在冰浴條件下酯化反應40 52h，各種組分用量比例為低聚殼聚糖水楊醛席夫堿、水楊酸和DCC的質量比為1 4 5 4 5 ；低聚殼聚糖水楊醛席夫堿與4-二甲氨基吡啶的質量比為5 10 1，而3A分子篩占總反應體積的4 6% ；(5)酯化后，過濾，收集濾液依次用與二氯甲烷和蒸餾水分別洗滌，洗滌后再加入無水Na2SO4干燥劑，經過濾，收集沉淀物干燥，經蒸餾除去二氯甲烷得到黃色0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿。在本發明的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法中，在所述的步驟(3)中對截留物經浸泡、洗滌、過濾具體過程為是用丙酮洗滌、過濾3 4次，之后用 NaHCO3溶液于室溫下浸泡、攪拌，過濾；再用去離子水清洗至中性；最后再用甲醇浸泡。在本發明的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法中，在所述的步驟(3)中，在干燥過程中，是在40°C條件下進行真空干燥。在本發明的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法中，在所述的步驟(5)中，在步驟( 中的收集濾液依次用與二氯甲烷和蒸餾水分別洗滌過程中，每次所用的二氯甲烷或蒸餾水的用量分別與收集濾液同體積，并且分別洗滌2 5次。在本發明的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法中，在所述的步驟(5)中，在蒸餾除去二氯甲烷過程中，蒸餾的溫度為90°C。在本發明的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法中，在所述的步驟(5)中，得到黃色0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的酯化度為60 75mol%。本發明的優點是本制備方法得到的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿由于引入了多個抑菌性較強的酚羥基，在抗菌方面不僅對細菌表現出了較好抑制效果(如對大腸桿菌、金色葡萄球菌和啤酒酵母菌的最小抑菌濃度為改性前低聚殼聚糖的60 70% )，對真菌中的霉菌也表現出較強的抑制作用。本發明中給出的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿天然抑菌劑制備方法， 操作簡單、操作環境安全，所得低聚殼聚衍生物在抗菌性能方面得到了明顯改善。
圖1為本發明的低聚殼聚糖衍生化過程合成的低聚殼聚糖水楊醛席夫堿及0-水楊酸酯化低聚殼聚糖香草醛席夫堿的表觀性狀圖。其中，圖l_a為低聚殼聚糖的表觀性狀圖；圖Ι-b為低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的表觀性狀圖；圖1-c為0-水楊酸酯低聚殼聚糖香草醛席夫堿的表觀性狀圖。圖2為低聚殼聚糖和0-水楊酸酯低聚殼聚糖席夫堿的頂圖譜。其中，圖2-d為低聚殼聚糖的頂圖譜；圖2-e為0-水楊酸酯低聚殼聚糖席夫堿的頂圖譜。圖3為濃度Iwt %的低聚殼聚糖水溶液和濃度Iwt %的0-水楊酸酯低聚殼聚糖水楊醛席夫堿水溶液的對各種微生物的抑制效果的對比圖。其中，圖3-f的右面圖為濃度Iwt %的低聚殼聚糖水溶液對大腸桿菌的抑制效果圖，圖3-f的左面圖為濃度Iwt %的0-水楊酸酯低聚殼聚糖水楊醛席夫堿水溶液對大腸桿菌的抑制效果圖；圖3-g的右面圖為濃度
的低聚殼聚糖水溶液對金色葡萄球菌的抑制效果圖，圖3-g的左面圖為濃度的0-水楊酸酯低聚殼聚糖水楊醛席夫堿水溶液對金色葡萄球菌的抑制效果圖；圖3-h的右面圖為濃度的低聚殼聚糖水溶液對啤酒酵母菌的抑制效果圖，圖3-h的左面圖為濃度的0-水楊酸酯低聚殼聚糖水楊醛席夫堿水溶液對啤酒酵母菌的抑制效果圖；圖 3-s的右面圖為濃度的低聚殼聚糖水溶液對實驗室分離的未知霉菌的抑制效果圖， 圖3-s的左面圖為濃度Iwt %的0-水楊酸酯低聚殼聚糖水楊醛席夫堿水溶液對實驗室分離的未知霉菌的抑制效果圖。
具體實施例方式實施例將2. Og相對分子量為5000的低聚殼聚糖溶解于60ml的2體積％的醋酸溶液中， 置于裝有攪拌器的三頸燒瓶；再加60ml甲醇，混合均勻后溶脹lh。向反應體系中加入溶解于60ml甲醇的醛(-CH0/-NH2摩爾比為8:1)，室溫下攪拌反應24h。取出反應液，滴加10wt%的NaOH溶液調pH值為中性，每次用180ml丙酮洗滌、過濾3次；之后用180ml 5wt% NaHCO3溶液于室溫下浸泡、攪拌lOOmin，過濾；再用反復用去離子水清洗至中性。最后用甲醇浸泡過夜，過濾后于40°C條件下真空干燥至恒重，得到低聚殼聚糖水楊醛席夫堿，經元素分析其席夫堿取代度為IOOmol %。取制備的低聚殼聚糖席夫堿1.5g分散于40ml的二氯甲烷中，置于裝有攪拌器和回流裝置的250mL四頸瓶中，再加入6g水楊酸，0. 25gDMAP(4-二甲基嘧啶)和3A分子篩 5g，在冰水浴條件下攪拌反應IOmin后加入6gDCC，反應4 后出料。料漿過濾后對收集的濾液依次用以二氯甲烷和蒸餾水分別洗滌3次，洗滌后用分液漏斗去掉油脂層。每次二氯甲烷或蒸餾水的用量分別與收集濾液的體積相同。洗滌3次后加入無水Na2SO4干燥劑，用分液漏斗過濾收集濾液，用旋轉蒸發儀進行旋蒸除去二氯甲烷，在蒸餾除去二氯甲烷過程中，蒸餾的溫度為90°C，除去二氯甲烷后得到粉紅色固狀物的 O-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿，經過測定其酯化度為73mol %。其中酯化度的測定方法為精確稱取0. 5g的O-水楊酸酯低聚殼聚糖席夫堿置于250mL錐形瓶中，加入25mL 丙酮和數滴酚酞指示劑，混勻后加入0. 5mol/L的NaOH標準溶液25mL，在電磁攪拌條件下皂化60min。用濃度0. 5mol/LHCl標準溶液滴定至紅色消失即為終點，得HCl消耗體積義。 用低聚殼聚糖做空白試驗，得HCl消耗體積V2。酯化度(%) = (I-V1A2) X 100%低聚殼聚糖衍生化過程合成的低聚殼聚糖水楊醛席夫堿及O-水楊酸酯化低聚殼聚糖香草醛席夫堿的表觀性狀見圖1。由圖1可以觀察到，淡黃色的低聚殼聚糖粉末(如圖Ι-a所示)與水楊醛合成席夫堿后為低聚殼聚糖水楊醛席夫堿(如圖l_b所示)，表觀顏色發生了很大的改變，呈亮黃色的晶體顆粒。進一步與水楊酸發生酯化后為O-水楊酸酯低聚殼聚糖香草醛席夫堿(如圖1-c所示)，呈粉紅色脂狀固體。兩種衍生物即低聚殼聚糖水楊醛席夫堿和O-水楊酸酯低聚殼聚糖香草醛席夫堿都略帶刺激性氣味。采用KBr壓片法，在4000 ^OcnT1范圍內測定低聚殼聚糖和0_水楊酸酯低聚殼聚糖席夫堿的頂圖譜見圖2。對比圖2中低聚殼聚糖和水楊酸酯低聚殼聚糖席夫堿的頂圖可以發現，0-水楊酸酯低聚殼聚糖席夫堿的頂譜圖(如圖2-e所示)在1274cm1處出現了酚羥基的特征峰，在 1648cm"1出現C = N席夫堿的特征峰，在1120CHT1和1180CHT1處出現了酯基的特征峰。而在1072CHT1處C6-OH特征吸收峰強度變小，且3446cm—1處的-OH吸收峰明顯變窄，推測是因為大量糖環上-OH參與發生酯化反應減少所致。在1580，1498和1461cm—1處出現的苯環特征吸收峰進一步證實了水楊酸和水楊醛已經分別與低聚殼聚糖發生了酯化反應和席夫堿修飾。Iwt % (其溶劑均為去離子水)的0-水楊酸酯低聚殼聚糖水楊醛席夫堿對各種微生物的抑制效果與低聚殼聚糖對比見圖3和表1。表1低聚殼聚糖及衍生物對微生物的抑菌圈平均直徑(cm)
權利要求
1.一種0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿，在分子量為3000 5000的聚殼聚糖分子結構上的C2-NH2與水楊醛修飾成形成席夫堿，其中，席夫堿取代度大于95mol% ；并在所述的聚殼聚糖分子結構中的C6-OH與水楊酸酯化，其酯化度為60mol% -75mol%。
2.用權利要求1所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿作為抑菌劑。
3.根據權利要求2所述的抑菌劑，所述的抑菌劑對大腸桿菌、金色葡萄球菌和啤酒酵母菌具有抑制作用。
4.一種0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，其特征在于該方法包括下述步驟(1)將分子量為3000 5000的低聚殼聚糖置于2體積％ 4體積％醋酸溶液和甲醇的混合液中，其中，醋酸溶液和甲醇為等體積，低聚殼聚糖在醋酸溶液和甲醇的混合液中的質量濃度為4% 8%，溶脹lh-2h ；(2)將水楊醛溶解于甲醇中，該甲醇和步驟(1)中所用的甲醇是等體積的，溶解后再加入到溶脹完成的步驟(1)得到的低聚殼聚糖溶液中，在室溫下攪拌下反應20 Mh，其中， 水楊醛與低聚殼聚糖用量摩爾比Oi(Lffl2))為6 8 1 ；(3)將步驟O)中得到的制備液調節pH呈中性后過濾，對截留物經浸泡、洗滌、過濾和干燥后，得取代度大于95mol%的低聚殼聚糖水楊醛席夫堿；(4)將步驟(3)合成的低聚殼聚糖水楊醛席夫堿溶于二氯甲烷，溶解的濃度為 1. Owt % 5. Owt 再加入作為催化劑的4-二甲氨基吡啶和作為脫水劑的3A分子篩后，加入作為修飾成分的水楊酸，在冰水浴條件下攪拌反應10min-15min后加入DCC (N，N’ - 二環己基碳酰亞胺)，在冰浴條件下酯化反應40 52h，各種組分用量比例為低聚殼聚糖水楊醛席夫堿、水楊酸和DCC的質量比為1 4 5 4 5 ；低聚殼聚糖水楊醛席夫堿與4-二甲氨基吡啶的質量比為5 10 1，而3A分子篩占總反應體積的4 6% ；(5)酯化后，過濾，收集濾液依次用與二氯甲烷和蒸餾水分別洗滌，洗滌后再加入無水 Na2SO4干燥劑，經過濾，收集沉淀物干燥，經蒸餾除去二氯甲烷得到黃色0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿。
5.根據權利要求4所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，其特征在于在所述的步驟C3)中對截留物經浸泡、洗滌、過濾具體過程為是用丙酮洗滌、過濾3 4次，之后用NaHCO3溶液于室溫下浸泡、攪拌，過濾；再用去離子水清洗至中性；最后再用甲醇浸泡。
6.根據權利要求4所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，其特征在于在所述的步驟(3)中，在干燥過程中，是在40°C條件下進行真空干燥。
7.根據權利要求4所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，其特征在于在所述的步驟( 中，在步驟( 中的收集濾液依次用與二氯甲烷和蒸餾水分別洗滌過程中，每次所用的二氯甲烷或蒸餾水的用量分別與收集濾液同體積，并且分別洗滌2 5 次。
8.根據權利要求4所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，其特征在于在所述的步驟(5)中，在蒸餾除去二氯甲烷過程中，蒸餾的溫度為90°C。
9.根據權利要求4所述的0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的制備方法，其特征在于在所述的步驟(5)中，得到黃色0-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿的酯化度為60 75mol%。
全文摘要
本發明公開了一種天然抑菌劑-O-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿及其制備方法。首先采用水楊醛對抑菌較強的低聚殼聚糖分子結構上的C2-NH2進行修飾，合成低聚殼聚糖水楊醛席夫堿；之后再采用DDC法對低聚殼聚糖水楊醛席夫堿上的C6-OH進行縮合形成O-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿。該制備方法，操作簡單、操作環境安全，所得低聚殼聚衍生物在抗菌性能方面得到了明顯改善。本發明的O-水楊酸酯化低聚殼聚糖水楊醛席夫堿作為抑菌劑，該抑菌劑對大腸桿菌、金色葡萄球菌和啤酒酵母菌具有抑制。
文檔編號A01N43/16GK102321196SQ20111030640
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者林強, 覃菲, 韓永萍 申請人:北京聯合大學生物化學工程學院