專利名稱：一種新的煙草黑脛病抗性快速鑒定方法
技術領域：
本發明屬于作物抗病性鑒定技術領域，具體涉及煙草黑脛病抗性鑒定，特別是涉及一種煙草黑脛病抗性的苗期快速鑒定方法。
背景技術：
煙草黑脛病是煙草(Nicotiana tabacum)生產上的毀滅性病害之一，是制約我國各煙區煙葉生產的最重要因素，可以危害烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培煙草。美國北卡羅萊納州每年因煙草黑脛病損失的煙葉約占總產量的 2%，1995年和 1996年兩年間因黑脛病造成的損失就達3610萬美元，占病害總損失的35. 13%，居各病害之首。該病在我國分布范圍很廣，除黑龍江省尚未發現之外，其余各植煙省區(含臺灣省) 均有發生。平均發病率為5% 12%，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收。據不完全統計，我國煙草黑脛病平均每年發病面積高達76373hm2，產量損失2869. 26萬千克，產值損失超過1. 23億元人民幣。生產實踐表明，防治黑脛病最經濟、有效、環保的措施就是選育抗病品種，抗性鑒定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監測等工作中重要的一環。現有的煙草抗性鑒定方法主要有溫室苗期鑒定接種法和病圃活體菌株人工接種鑒定法。苗期鑒定法通常采用游動孢子或菌絲體懸浮液浸根接種，病圃活體菌株人工接種鑒定是目前常用的鑒定方法，現有的接種方法采用莖基部創傷接種法，缺點是移栽緩苗后接種，時間長，工作量大，傷口大小不一致，接種過程繁瑣，不易操作。接種體需要經過固體培養、菌谷培養，時間長，工作量大。我國煙草普遍采用漂浮育苗，漂浮育苗是當前國際上先進的育苗新技術，具有壯苗率高、操作簡便、專業化程度高、省工節時、方便管理、有利環境保護等許多優點，近年來， 在我省得到了大面積推廣應用，因此，在漂浮育苗基礎上，建立新的煙草黑脛病抗性的漂浮池水培接種快速鑒定方法，對抗病種質資源篩選、抗性遺傳特性研究和抗病育種具有重要
意義ο
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種新的煙草黑脛病抗性快速鑒定方法，包括育苗、煙苗移植及日常管理、接種體制備及煙苗切莖接種黑脛菌、病情調查與分級等步驟。本方法直接采用漂浮育苗，不需要移栽緩苗，用漂浮池恒溫水培接種鑒定結果代替傳統的土壤盆栽和大田鑒定結果，采用莖部切斷創傷接種法代替傳統的莖基部創傷接種法。減少環境溫度和濕度對鑒定結果的影響，避免其他病害對鑒定結果的干擾，提高鑒定結果的準確性，減少菌種培養和接種后發病調查時間，大大減少工作量，同時可節省場地、資源和試驗成本，縮短接種鑒定時間。采用菌絲片直接接種，菌種只需要固體培養，時間短而工作量小，接種時間和接種后發病時間短，采用莖部切斷創傷法接種傷口大小基本一致，接種時易于操作，避免由于不同人員操作引起的傷口大小差異，從而減少人為誤差。本發明通過以下技術方案予以實現
1)煙苗移植及日常管理煙苗三次剪葉后，苗齡60d，每個待鑒定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。以小黃金1025作對照，紅花大金元作輔助對照。漂浮池營養液的氮素濃度控制在100mg/kg 250mg/kg。根據池水蒸發量，經常補充池水至初始水深。2)接種體制備及接種煙草黑脛病菌活化后，接種燕麥固體培養基培養2周。莖部高度5cm處用無菌解剖刀切斷，用打孔器打取0. 5cm菌絲塊，貼于莖部切斷處，菌絲面朝下，每株接種1個菌絲片，上套移5mL液槍槍頭保濕，每品種設3個重復，每重復接種15株。接種后將育苗盤放入恒溫池，日常管理。；3)病情調查接種后2d調查發病情況，以后每隔2d調查一次發病情況。記錄發病率及病情指數。以感病對照發病率達到70%左右的病情指數作為品種抗性評價標準。4)病害嚴重度分級以株為單位分級調查。0級莖部綠色，無病斑。1級莖部病斑不超過莖圍。3級；莖部病斑環繞莖圍，病斑高度不超過莖高的三分之一。5級莖部病斑環繞莖圍，病斑高度占莖高的三分之一至三分之二。7級莖部病斑環繞莖圍，病斑高度超過莖高的三分之二以上。9級莖部全部變色，基本死亡。本發明與現有技術相比具有如下優點和有益效果1)直接采用漂浮育苗，不需要移栽緩苗，減少勞動量。2)采用菌絲片直接接種，菌種只需要固體培養，時間短而工作量小， 接種時間和接種后發病時間短。幻采用莖部切斷創傷法接種傷口大小基本一致，接種時易于操作，避免由于不同人員操作引起的傷口大小差異，從而減少人為誤差。該方法的實用性在于占地面積小，在幾十平方米的面積上一次可同時鑒定上千株煙苗；用漂浮池恒溫水培接種鑒定結果代替傳統的土壤盆栽和大田鑒定結果，采用莖部切斷創傷接種法代替傳統的莖基部創傷接種法，結果重復性高，能有效排除土壤溫度差異和其他病害對抗性結果的干擾，有利于年度間和不同實驗室間結果重現和比較，提高鑒定結果的準確性，減少菌種培養，大大減少工作量，同時可節省場地、資源和試驗成本，縮短接種鑒定時間，發病迅速，從接種到調查結束可在一周內完成；結果可靠性高，抗感品種的發病率和病情指數差異明顯。該方法在抗病資源和育種中間材料的抗性鑒定、抗性遺傳規律研究中應用潛力較大。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的說明，但不是對本發明保護范圍的限定。實施例11材料與方法1. 1供試材料
供試煙草材料包括1-；35、NC1071、NC729、SC 71、Virginia 182、筑波 1 號、 Burley2UBanket A_l、Tennessee90、Virginia509、TI245、安麻山曬煙 _3、祥云土煙-1、克撒錫巴斯瑪、土耳其巴斯瑪、希臘巴斯瑪、紅大、小黃金1025，其中小黃金1025和紅花大金元為國內外報道的感黑脛病資源。接種用黑脛菌強致病力菌株162#，分離自云南省文山州文山縣。1.2室內苗期抗性鑒定1.2. 1莖部切斷創傷接種法煙苗三次剪葉后，苗齡60d，每個待鑒定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。以紅花大金元品種、小黃金1025為對照。漂浮池營養液的氮素濃度控制在100mg/kg 250mg/ kg。根據池水蒸發量，經常補充池水至初始水深。煙草黑脛病菌活化后，接種燕麥固體培養基培養2周。莖部高度5cm處用無菌解剖刀切斷，用打孔器打取0. 5cm菌絲塊，貼于莖部切斷處，菌絲面朝下，每株接種1個菌絲片，上套移液槍槍頭(5mL)保濕，每品種設3個重復，每重復接種15株。接種后將育苗盤放入恒溫池，日常管理。接種后2d調查發病情況，以后每隔2d調查一次發病情況。記錄發病率及病情指數。以感病對照發病率達到70% 左右的病情指數作為品種抗性評價標準。病害嚴重度分級以株為單位分級調查。0級莖部綠色，無病斑。1級莖部病斑不超過莖圍。3級；莖部病斑環繞莖圍，病斑高度不超過莖高的三分之一。5級莖部病斑環繞莖圍，病斑高度占莖高的三分之一至三分之二。7級莖部病斑環繞莖圍，病斑高度超過莖高的三分之二以上。9級莖部全部變色，基本死亡。1. 2. 2莖基部創傷接種鑒定法在塑料拱棚溫室內進行。盆栽苗齡50d煙苗，每材料30株。采用直徑12cm的一次性黑色塑料花盆，每盆裝紅壤土約500g。移栽成活后，在煙株兩側將刀刮傷煙苗莖基部， 每株傷口處接種5g菌谷。通過溫室通風簾控制室內白天溫度、傍晚關閉通風簾保溫。接種后每周觀察一次發病情況，在感病對照發病率達到20%左右詳細調查病情，以感病對照發病率達到75%左右的調查結果作為品種抗性評價標準。病害嚴重度分級標準按照GB/T 23222-2008的規定。0級全株無病；1級莖部病斑不超過莖圍得三分之一，或三分之一以下葉片萎焉；3級頸部病斑環繞莖圍三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑；5級莖部病斑超過莖圍得二分之一，但未全部環繞莖圍，獲二分之一至三分之二葉片凋萎；7級莖部病斑全部環繞莖圍，或三分之二以上葉片凋萎；9級病株基本枯死。2結果與分析2. 1兩種不同接種方法抗性鑒定結果相關性比較表1兩種不同黑脛病抗性鑒定方法發病情況
權利要求
1. 一種新的煙草黑脛病抗性快速鑒定方法，其特征在于步驟為(1)煙苗移植及日常管理煙苗三次剪葉后，苗齡60d，每個待鑒定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中；以小黃金1025作對照，紅花大金元作輔助對照，漂浮池營養液的氮素濃度控制在100 mg/kg 250 mg/kg,根據池水蒸發量，經常補充池水至初始水深；(2)接種體制備及接種煙草黑脛病菌活化后，接種燕麥固體培養基，28°C培養2周；莖部高度5cm處用無菌解剖刀切斷，用打孔器打取0. 5cm菌絲塊，貼于莖部切斷處，菌絲面朝下，每株接種1個菌絲片，上套5mL移液槍槍頭保濕，每品種設3個重復，每重復接種15株；接種后將育苗盤放入恒溫池，日常管理；(3)病情調查接種后2 d調查發病情況，以后每隔2d調查一次發病情況；記錄發病率及病情指數，以感病對照發病率達到70%左右的病情指數作為品種抗性評價標準；(4)病害嚴重度分級以株為單位分級調查，0級莖部綠色，無病斑；1級莖部病斑不超過莖圍；3級；莖部病斑環繞莖圍，病斑高度不超過莖高的三分之一；5級莖部病斑環繞莖圍，病斑高度占莖高的三分之一至三分之二 ；7級莖部病斑環繞莖圍，病斑高度超過莖高的三分之二以上；9級莖部全部變色，基本死亡。
全文摘要
本發明公開了一種新的煙草黑脛病抗性快速鑒定方法，包括育苗、煙苗移植及日常管理、接種體制備及煙苗切莖接種黑脛菌、病情調查與分級等步驟。本發明直接采用漂浮育苗，不需要移栽緩苗，用漂浮池恒溫水培接種鑒定結果代替傳統的土壤盆栽和大田鑒定結果，采用莖部切斷創傷接種法代替傳統的莖基部創傷接種法。減少環境溫度和濕度對鑒定結果的影響，避免其他病害對鑒定結果的干擾，提高鑒定結果的準確性，減少菌種培養和接種后發病調查時間，采用莖部切斷創傷法接種傷口大小基本一致，接種時易于操作，避免由于不同人員操作引起的傷口大小差異，從而減少人為誤差。
文檔編號A01G31/00GK102498878SQ201110343658
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者冷曉東, 劉勇, 盧秀萍, 李梅云, 李永平, 李祥, 肖炳光, 高家合 申請人:云南省煙草農業科學研究院