專利名稱：一種篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法，屬植物保護技術領域。
背景技術：
煙草黑脛病(Phtophthro nicotinae Breda de Hann)于1896年首次發現于印尼爪哇，現已是世界性煙草的毀滅性病害之一，從苗期到成株期都可發生。我國于1950年發現于黃淮煙區，目前全國大部分煙草種植區均有此病發生。長期以來，生產上對該病的控制主要依靠化學農藥來進行防治，而化學防治難以長期持續有效，還嚴重污染環境。
抗煙草黑脛病放線菌是一類很重要的農用抗生素產生菌，70％以上的農用抗生素均為放線菌產生，在植物病原真菌病害的生物防治中起著非常重要的作用。常規方法大多采用孢子萌發法、菌絲生長速率法等離體篩選模型，由于缺乏在活體植株的防效驗證，有些對孢子萌發和菌絲生長抑制活性較高的產物在溫室盆栽煙苗上卻不表現出防效，造成篩選結果不可靠，并影響到實際應用。將菌絲生長速率法、離體葉片法和溫室盆栽活體試驗集成于有效篩選抗煙草黑脛病放線菌，目前尚未見報道。
發明內容
本發明的目的在于克服傳統技術中的不足，而提供一種使篩選結果可靠的抗煙草黑脛病放線菌的篩選方法。
本發明將離體篩選模型(菌絲生長速率法、離體葉片法)與活體篩選模型(溫室盆栽煙苗)相結合，建立了一套結果可靠的抗煙草黑脛病放線菌的篩選方法。
本發明的篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法，包括菌絲生長速率初篩活性菌株、離體葉片法復篩出活性菌株步驟，及溫室盆栽活體試驗驗證活性菌株步驟其中(1)菌絲生長速率初篩活性菌株步驟中所用的煙草黑脛病菌株從煙草病株上分離出，用V8汁培養基和燕麥培養基培養，25℃保存備用；將Φ5mm的煙草黑脛病菌菌絲塊接種于已帶發酵液提取物的V8汁培養基中，菌絲塊沿培養皿周緣放置，每皿放置4塊，每處理3個重復，置于28℃培養箱中，黑暗培養7天后觀察記錄，分析抑菌效果，初步篩選出對煙草黑脛病菌(Phtophthro nicotinae Breda de Hann)菌絲生長抑制率大于70％的活性菌株；
(2)離體葉片法復篩出活性菌株步驟中剪取長勢均勻一致的葉片，噴施絲生長速率初篩活性菌株步驟中得到的活性菌株發酵液提取物，晾干后，置于鋪有濕紗布的塑料盤內，用0.5cm的菌餅針刺創傷接種8塊/葉；然后放置于保溫保濕接種箱內，每處理3片葉；設清水為空白對照，待空白對照發病后觀察記錄，計算防治效果，復篩出對煙草黑脛病防治效果大于70％的活性菌株；(3)溫室盆栽煙苗驗證步驟中將在V8汁培養基培養10d的煙草黑脛病菌種連同培養基一起切碎，與蛭石充分混勻，裝入紙杯內，移植長至4-5葉期的煙苗，每杯2株，3重復/處理；加入經離體葉片法復篩出的活性菌株發酵液提取物，5mL/杯；然后置于28℃培養箱中保濕培養；設空白對照處理，加滅菌水，接種培養5天后，檢查煙苗發病情況，計算病情指數及相對防治效果，篩選出抗煙草黑脛病放線菌有防治效果的放線菌菌株。
通過本發明的方法，篩選到了一批具有較好抗煙草黑脛病活性的放線菌菌株，入選菌株在抗煙草黑脛病的離體及活體篩選模型上均具有較好活性，為下一步追蹤分離活性化合物提供了可靠結果。本方法還具有簡便、操作、易有效地篩選出防治煙草黑脛病的放線菌等優點。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
一、菌絲生長速率法初篩活性菌株1.煙草黑脛病指示菌的制備煙草黑脛病菌(Phtophthro nicotinae Breda de Harm)，從煙草病株上分離并用V8汁培養基和燕麥培養基培養，25℃保存備用。
2.抗煙草黑脛病放線菌的制備a.放線菌菌株的制備選用的實驗菌株為334株從云南各地土壤中采集和分離得到的放線菌菌株。分別將菌株接種于斜面上，28℃培養168h。
斜面培養基酵母膏4g、葡萄糖4g、麥芽膏5g、復合維生素5mg、微量鹽1mL、瓊脂粉20g、水1000mL、pH7.2。
b.發酵液的制備將菌株從生長好的斜面接種于100mL種子液中，種子液220rpm、28℃振蕩培養48h后，再按10％的接種量接種于100mL發酵液中，220rpm、28℃振蕩培養120h。
種子培養基酵母膏4g、葡萄糖4g、麥芽膏5g、復合維生素5mg、微量鹽1mL、水1000mL、pH7.2。
發酵培養基大豆粉20g、蛋白胨2g、葡萄糖20g、淀粉5g、酵母膏5g、NaCl4g、K2HPO40.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、CaCO32g、水1000mL、pH7.8。
c.發酵液的后處理上述發酵液加入等體積乙醇，經振蕩8h后，離心(3000rpm，10min)，取上清液，并在旋轉蒸發儀上50℃蒸去乙醇，水相用凍干儀凍成干粉后保存備用，測定活性時用無菌水溶解、稀釋定容到發酵原液的濃度。
3.抗煙草黑脛病放線菌的篩選將Φ5mm的煙草黑脛病菌菌絲塊接種于已帶發酵液提取物的V8汁培養基中，菌絲塊沿培養皿周緣放置，每皿放置4塊，每處理3重復。置于28℃培養箱中，黑暗培養7天，記載生長與否。若生長形成菌落，以mm為單位十字交叉測量菌落直徑，減去菌餅的直徑，取平均值。計算各殺菌劑平板上的生長速率，并以在空白對照培養基平板上的生長速率比較，分析各發酵液提取物對黑脛病菌的抑菌效果。
菌落直徑(mm)＝測量菌落直徑-5.0mm抑菌百分率(％)＝(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落×100對照藥劑分別為53％雷多米爾錳鋅可濕性粉劑1000倍處理和72.2％普力克1000倍處理。
本實驗獲得28株對煙草黑脛病菌絲生長抑制率大于70％的放線菌菌株。
二、離體葉片法復篩活性菌株煙草黑脛病指示菌的制備及抗煙草黑脛病放線菌的制備同菌絲生長速率初篩活性菌株中的制備方法，不同之處在于，對抗煙草黑脛病放線菌的篩選采用離體葉片法實驗進行。
采用離體葉片法對抗煙草黑脛病放線菌的篩選供試植物為煙草，品種為紅花大金元。剪取長勢均勻一致的葉片，噴施經菌絲生長速率初篩后得到的活性菌株發酵液提取物，晾干后，置于鋪有濕紗布的塑料盤內，用0.5cm的菌餅針刺創傷接種8塊/葉；然后放置于保溫保濕接種箱內。每處理3片葉，設清水為空白對照。待空白對照發病后，測定葉片發病率，并進行病情分級，以病情指數來計算防治效果。
分級標準0級無癥狀；1級病斑直徑0.1cm-1.0cm；3級病斑直徑1.1cm-2.0cm以下；5級病斑直徑2.1cm-3.0cm；7級病斑直徑3.0cm以上。
病情指數＝∑(各級病斑×相對級數值)/(調查總病斑數×7)×100防治效果(％)＝(CK病情指數-施藥后病情指數)/CK病情指數×100對照藥劑同絲生長速率初篩活性菌株步驟中所用藥劑。
采用離體葉片法實驗獲得20株對煙草黑脛病防治效果大于70％的放線菌。
三、溫室盆栽活體驗證采用溫室盆栽活體試驗步驟為供試植物煙草，品種為紅花大金元。將在V8汁培養基培養10d的煙草黑脛病菌種連同培養基一起切碎，與蛭石充分混勻，裝入紙杯內，移植長至4-5葉期的煙苗，每杯2株，3重復/處理；加入經離體葉片法篩選后得到的活性菌株發酵液提取物，5mL/杯；然后置于28℃培養箱中保濕培養。設空白對照處理，加滅菌水。接種培養5天后，檢查煙苗發病情況，計算病情指數及相對防治效果。
抗抗煙草黑脛病藥效的計算采用下列兩公式病情指數＝∑(各級病株×相對級數值)/(調查總株數×7)×100防治效果(％)＝(CK病情指數-施藥后病情指數)/CK病情指數×100當計算出的防治效果(％)≥70％時，可認為該菌株發酵液供試樣品具有較好的抗煙草黑脛病活性。
本實施例通過溫室盆栽活體試驗，確定獲得9株對煙草黑脛病防治效果大于70％的放線菌。
權利要求
1.一種篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法，包括菌絲生長速率初篩活性菌株、離體葉片法復篩出活性菌株步驟，其特征在于該方法還包括溫室盆栽活體試驗驗證步驟其中(1)菌絲生長速率初篩活性菌株步驟中所用的煙草黑脛病菌株從煙草病株上分離出，用V8汁培養基和燕麥培養基培養，25℃保存備用；將Φ5mm的煙草黑脛病菌菌絲塊接種于已帶發酵液提取物的V8汁培養基中，菌絲塊沿培養皿周緣放置，每皿放置4塊，每處理3重復，置于28℃培養箱中，黑暗培養7天后觀察記錄，分析抑菌效果，初步篩選出對煙草黑脛病菌(Phtophthro nicotinae Breda de Hann)菌絲生長抑制率大于70％的活性菌株；(2)離體葉片法復篩出活性菌株步驟中剪取長勢均勻一致的葉片，噴施絲生長速率初篩活性菌株步驟中得到的活性菌株發酵液提取物，晾干后，置于鋪有濕紗布的塑料盤內，用0.5cm的菌餅針刺創傷接種8塊/葉；然后放置于保溫保濕接種箱內，每處理3片葉；設清水為空白對照，待空白對照發病后觀察記錄，計算防治效果，復篩出對煙草黑脛病防治效果大于70％的活性菌株；(3)溫室盆栽煙苗驗證步驟為將在V8汁培養基培養10d的煙草黑脛病菌種連同培養基一起切碎，與蛭石充分混勻，裝入紙杯內，移植長至4-5葉期的煙苗，每杯2株，3重復/處理；加入經離體葉片法復篩出的活性菌株發酵液提取物，5mL/杯；然后置于28℃培養箱中保濕培養；設空白對照處理，加滅菌水，接種培養5天后，檢查煙苗發病情況，計算病情指數及相對防治效果，篩選出抗煙草黑脛病放線菌有防治效果的放線菌菌株。
全文摘要
本發明涉及一種篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法，屬植物保護技術領域。本方法包括菌絲生長速率法初篩活性菌株、離體葉片法復篩出活性菌株步驟，及溫室盆栽活體試驗驗證步驟。首先用菌絲生長速率法，初篩出對煙草黑脛病菌Phtophthro nicotinae Bredade Hann菌絲生長抑制率大于70％的放線菌發酵液提取物；再對菌絲生長速率法得到的提取物，用離體葉片法和溫室盆栽煙苗復篩其對煙草黑脛病的防治效果，篩選出應用前景好的抗煙草黑脛病放線菌。本方法篩選到的具有較好抗煙草黑脛病活性的放線菌菌株，入選菌株在抗煙草黑脛病的離體及活體篩選模型上均具有較好活性，為追蹤分離活性化合物提供了可靠結果。本方法還具有簡便、操作、易有效地篩選出防治煙草黑脛病的放線菌等優點。
文檔編號C12N1/20GK1778894SQ20051001105
公開日2006年5月31日 申請日期2005年10月12日 優先權日2005年10月12日
發明者曾莉, 李銘剛, 劉樹芳, 李一青, 李家瑞, 崔曉龍, 文孟良 申請人:云南大學