專利名稱：一株殺線蟲的綠僵菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株殺線蟲的綠僵菌及其應用。
背景技術：
蔬菜根結線蟲病是世界性病害，其病原物為根結線蟲(Meloidogyne spp.)，分類上屬于異皮科根結線蟲屬。迄今已報道的根結線蟲達80余種，主要種類有南方根結線蟲、 瓜哇根結線蟲、花生根結線蟲和北方根結線蟲。根結線蟲通常沒有明顯的寄主專化性，能夠侵染的植物超過3000種，分屬114科，包括單子葉植物，雙子葉植物，草本植物和木本植物，對大多數的糧食作物、油料作物、纖維作物、煙草、茶葉、果樹、蔬菜、藥材和花卉等均可造成嚴重損失。受其危害后，作物品質下降，大幅度減產，甚至絕產，同時線蟲病的發生又加劇了枯萎病、黃萎病和立枯病等土傳病害的危害，造成植物抵抗能力下降，極易受其它病原物侵染。病害發生時，一般每年造成10% -15%的經濟損失，發病嚴重的時候損失可達30% -40%，甚至絕產。據不完全統計，全世界每年因根結線蟲危害所造成的農業經濟損失達1000億美元以上。據預測，未來10年線蟲的發生會有明顯的上升，年平均增幅約 1 %-9%，長期連作使得土壤根結線蟲累積為害尤為嚴重，因此在未來相當長的時間內根結線蟲病依然是農作物的主要病害之一。目前，對于根結線蟲的防治，主要以化學藥劑防治為主，以及抗線蟲品種和輪作等其它方法。這些方法雖然對線蟲防治有一定作用，但都存在著一些弊端。在控制該類病害的方法中，由于根結線蟲通常存活于土壤中和植物根內，所以一般化學農藥難以控制其危害， 因此該類病害成為大量劇毒農藥頻繁使用的對象，對農產品生產的安全性構成嚴重威脅。 同時，由于化學殺線蟲劑只能在短期內控制線蟲數量，同時還存在成本高、持效短和抗藥性等問題；抗性品種的選擇作用會使線蟲的群體發生變化，最后逐漸喪失抗性；而輪作防治根結線蟲不適合現代農業生產的要求等。綜上所述，由于目前缺乏實用、高效、可持續的治理技術，根結線蟲病發生區域不斷擴大，危害作物種類持續增加，致使農業生產面臨嚴峻挑戰，殺線蟲生物農藥具有非常廣闊的應用價值和市場前景。安全、有效的防治根結線蟲類病害是目前農業生產上亟待解決的緊迫問題，而現有的化學防治等措施并不能滿足這一要求，現在生物制劑面臨到如下問題1.定植問題。實際應用過程中，菌株在土壤中的定植能力差，防治效果達不到要求。2.穩定性問題。制劑活力喪失十分迅速，導致生防制劑貨架期短，難以商業化生產。為了保證制劑具有較長時間的貨架期，往往要求嚴格的保存條件，直接限制了真菌類生物農藥的大規模應用。綜上所述，高效生防菌株以及穩定劑型的開發是植物寄生線蟲病害生物防治工作重要方向
發明內容
本發明的目的是提供一株綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2。本發明所提供的綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. M33，該綠僵菌具有高效防治根結線蟲的功能。該綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433 具有以下特征在PDA和SMAY培養基上20-25°C下生長7天，菌落直徑；35_，14天達50_。在查氏培養基上菌落擴張較慢。菌落質地絨毛狀至棉絮狀，初為白色，產孢后變為深綠色至墨綠色，背面棕黃色，菌落表面常因分生孢子粘聚而呈厚苔樣。分生孢子梗不形成分生孢子座，直徑2. 2-3. 1 μ m。分生孢子單細胞，長橢圓形，表面光滑，脫落后聚集成孢子團 5. 6-8. 4 μ m 2. 5-3. 2 μ m ；最佳生長溫度為 25-30°C。本發明的另一個目的是提供一種綠僵菌制劑，所述制劑的活性成分為綠僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433，在所述制劑中的含量為 IO7-IO9Cfu/克。所述制劑為微球型制劑，所述微球型制劑的單粒微球重為0. 032-0. 034克，粒徑為 4. 2-4. 8mm。本發明所提供的綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2CGMCC No. 5433或所述制劑可用于防治植物根結線蟲。本發明還提供一種防治植物根結線蟲的方法，包括如下步驟將綠僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433或所述制劑施于植物的根下，防治植物根結線蟲，所述防治植物根結線蟲為降低所述植物根結線蟲的病情指數。所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433 或所述制劑按照如下用量施于所述植物的根下每畝AxiOll-SxiO12Cfu所述綠僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，優選為每畝4X 10"_8X IO11Cfu所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，最優選為每畝 4X IO11 所述 ^iSlii (Metarhizium anisopliae ν8Γ·8π 8ορ1: 8θ)] ΥΝ_1_20所述植物為黃瓜、青椒或西紅柿。所述根結線蟲為南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)和/或北方根結線蟲 (Meloidogyne hapla)。本發明還提供一種所述制劑的制備方法，包括如下步驟1)將硅藻土、所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 和海藻酸鈉水溶液按照20-24克硅藻土、AxiollCfu-Txio11Cfu權利要求1所述綠僵菌 (Metarhizium anisopliae)HYN-1-2和2. 6-4. 0克海藻酸鈉的配比混合均勻，得到懸浮液；2)將步驟1)得到的懸浮液按2. 6-4. 0克海藻酸鈉與1. 11-2. 22克氯化鈣的配比加入氯化鈣水溶液中，獲得所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2的微球型制劑。田間試驗證明，本發明所提供的綠僵菌制劑在室溫20-25 V條件、30-40 %濕度條件下放置180天后，仍具有較好的防治線蟲功效，防治效果可達50% -70%，說明該制劑較為穩定，且其活性成分即本發明的綠僵菌菌株在土壤中的定植效果好。另外，本發明的綠僵菌制劑還具有無毒無污染、性價比高、施用方便等優點。本發明的綠僵菌菌株及其制劑在植物根結線蟲病害防治中可發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例詳細描述本發明，所述實施例用于理解而不是限制本發明。保藏說明 菌種名稱綠僵菌 Τ^ι :Metarhizium anisopliae var. anisopliae菌株編號HYN-1-2保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期2011年10月31日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 543
圖 1 為以綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCCNo. 5433為活性成分的微球型制劑形態圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中所使用的材料來源和規格如下海藻酸鈉粘度500，煙臺新旺海藻有限公司；硅藻土 200-300目，堆密度0. 38g/cm3,滲透率3. 6達西，北京創清源過濾器材有限公司。實 M M I, M Wl M (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCCNo. 5433的分離鑒定與保藏采集河北永年黃瓜根結線蟲病根，用自來水沖洗病根3-5分鐘除去土壤，然后將病根放在解剖鏡下，用小鑷子挑出卵囊，用次氯酸鈉處理卵囊1分鐘對卵囊表面消毒并使線蟲卵釋放，將次氯酸鈉卵懸液分別過200 μ m和30 μ m的網篩，用滅菌蒸餾水沖洗3遍以除去次氯酸鈉，大約每100個卵涂布在PDA平板上，每天觀察菌落出現情況。最終自黃瓜根結線蟲卵上分離得到一株殺線蟲的真菌菌株，命名為HYN-1-2，并于2011年10月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. M33，經鑒定，該菌株為綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)。該綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)菌株 HYN-1-2CGMCC No. 5433 具有以下特征在 PDA 和 SMAY 培養基上20-25°C條件生長7天，菌落直徑35mm，14天達50mm。在查氏培養基上菌落擴張較慢。菌落質地絨毛狀至棉絮狀，初為白色，產孢后變為深綠色至墨綠色，背面棕黃色，菌落表面常因分生孢子粘聚而呈厚苔樣。分生孢子梗不形成分生孢子座，直徑2.2-3. 1 μ m。分生孢子單細胞，長橢圓形，表面光滑，脫落后聚集成孢子團5. 6-8. 4 μ m 2. 5-3. 2 μ m ；最佳生長溫度為25-30°C。以下內容所述綠僵菌如無特別說明均為綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-l-2 CGMCC No. 5433。實施例 2、綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的培養1、試管種培養將綠僵菌HYN-1-2的菌絲或孢子接種到試管PDA培養基斜面上，在25_27°C下培養，培養72-96小時，獲得試管種。2、菌種搖床擴大培養將斜面種子接種到三角瓶液體YES-2培養基中，25-260C、120_180rpm搖床振蕩培養。3、液體發酵生產將逐級擴大的綠僵菌HYN-1-2菌液按照1 10的體積比接種于發酵罐(發酵培養基為YES-2培養基)中，25j6°C攪拌并通氣(通氣量1 1)，培養48小時，得到綠僵菌 HYN-1-2 濃度為 4X 109-7X 109cfu/mL 的發酵液。上述YES-2培養基的配方為葡萄糖30克，酵母6. 12克，K2HPO4 1克，MgSO4 0. 5克， KCl 0. 5 克，FeSO4 0. 01 克，ZnSO4 · 7H20 10 毫克，用水定容至 1L, pH 調至 6. 5。實施例3、綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制劑的制備1、微球海藻酸鈉凝膠液的配制(100升)將2. 6千克海藻酸鈉緩緩加入到100升 80°C的自來水中，不斷攪拌使其溶化，得到海藻酸鈉水溶液，冷卻至約30°C，備用；2、取實例2得到綠僵菌HYN-1-2的濃度為4X 109cfu/mL的發酵液100升勻漿打碎，加入M千克硅藻土充分混勻后，加入到步驟1配制的100升海藻酸鈉水溶液中，充分攪拌混勻，得到懸浮液；3、配制CaCl2溶液用自來水配制摩爾濃度為0. 2M的氯化鈣溶液100升，備用；4、將步驟2得到的懸浮液通過0. 2毫米孔徑的篩孔，滴加到步驟3得到的100升 0. 2M的氯化鈣溶液中，篩孔和氯化鈣液面相距50厘米左右。海藻酸鈉微球與氯化鈣溶液反應后，生成海藻酸鈣微球。5、將步驟4得到的海藻酸鈣微球淬水攪拌10分鐘，然后將海藻酸鈣微球濾出，用清水沖洗2次，濾出微球40°C吹干，得到微球劑型的綠僵菌HYN-1-2制劑(圖1)。經檢測， 該制劑的單粒微球重0. 032-0. 034克，直徑4. 5 士0. 3mm,每克微球含5 X IO8CFU/克綠僵菌 (M. anisopliae)HYN-1-2。實施例 4、綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制劑的制備1、微球海藻酸鈉凝膠液的配制(100升)將2. 6千克海藻酸鈉緩緩加入到100升 80°C的自來水中，不斷攪拌使其溶化，得到海藻酸鈉水溶液，冷卻至約30°C，備用；2、取實例2得到綠僵菌HYN-1-2的濃度為7X 109cfu/mL的發酵液100升勻漿打碎，加入20千克硅藻土充分混勻后，加入到步驟1配制的100升海藻酸鈉水溶液中，充分攪拌混勻，得到懸浮液；3、配制CaCl2溶液用自來水配制摩爾濃度為0. 2M的氯化鈣溶液100升，備用；
4、將步驟2得到的懸浮液通過0. 2毫米孔徑的篩孔，滴加到步驟3得到的100升 0. 2M的氯化鈣溶液中，篩孔和氯化鈣液面相距50厘米左右。海藻酸鈉微球與氯化鈣溶液反應后，生成海藻酸鈣微球。5、將步驟4得到的海藻酸鈣微球淬水攪拌10分鐘，然后將海藻酸鈣微球濾出，用清水沖洗2次，濾出微球40°C吹干，得到微球劑型的綠僵菌HYN-1-2制劑(圖1)。經檢測， 該制劑的單粒微球重0. 032-0. 034克，直徑4. 5 士 0. 3mm,每克微球含5. 5 X IO8CFU/克綠僵菌 HYN-1-2。實施例 5、綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制劑的制備1、微球海藻酸鈉凝膠液的配制(100升)將4. 0千克海藻酸鈉緩緩加入到100升 80°C的自來水中，不斷攪拌使其溶化，得到海藻酸鈉水溶液，冷卻至約30°C，備用；2、取實例2得到綠僵菌HYN-1-2的濃度為4X 109cfu/mL的發酵液100升勻漿打碎，加入20千克硅藻充分混勻后，加入到步驟1配制的100升海藻酸鈉水溶液中，充分攪拌混勻，得到懸浮液；3、配制CaCl2溶液用自來水配制摩爾濃度為0. IM的氯化鈣溶液100升，備用；4、將步驟2得到的懸浮液通過0. 2毫米孔徑的篩孔，滴加到步驟3得到的100升 0. 2M的氯化鈣溶液中，篩孔和氯化鈣液面相距50厘米左右。海藻酸鈉微球與氯化鈣溶液反應后，生成海藻酸鈣微球。5、將步驟4得到的海藻酸鈣微球淬水攪拌10分鐘，然后將海藻酸鈣微球濾出，用清水沖洗2次，濾出微球40°C吹干，得到微球劑型的綠僵菌HYN-1-2制劑(圖1。經檢測， 該制劑的單粒微球重0. 032-0. 034克，直徑4. 5士0. 3mm,每克微球含5 X IO8CFU/克綠僵菌 HYN-1-2。實施例 6、綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制劑的制備1、微球海藻酸鈉凝膠液的配制(100升)將4. 0千克海藻酸鈉緩緩加入到100升 80°C的自來水中，不斷攪拌使其溶化，得到海藻酸鈉水溶液，冷卻至約30°C，備用；2、取實例2得到綠僵菌HYN-1-2的濃度為4X 109cfu/mL的發酵液100升勻漿打碎，加入M千克硅藻土充分混勻后，加入到步驟1配制的100升海藻酸鈉水溶液中，充分攪拌混勻，得到懸浮液；3、配制CaCl2溶液用自來水配制摩爾濃度為0. 2M的氯化鈣溶液100升，備用；4、將步驟2得到的懸浮液通過0. 2毫米孔徑的篩孔，滴加到步驟3得到的100升 0. 2M的氯化鈣溶液中，篩孔和氯化鈣液面相距50厘米左右。海藻酸鈉微球與氯化鈣溶液反應后，生成海藻酸鈣微球。5、將步驟4得到的海藻酸鈣微球淬水攪拌10分鐘，然后將海藻酸鈣微球濾出，用清水沖洗2次，濾出微球40°C吹干，得到微球劑型的綠僵菌HYN-1-2制劑(圖1)。經檢測， 該制劑的單粒微球重0. 032-0. 034克，直徑4. 5 士0. 3mm,每克微球含3 X IO8CFU/克綠僵菌 HYN-1-2。將上述實例3得到的綠僵菌HYN-1-2微球制劑于室溫20_25°C，濕度20-30%條件下放置6個月，每克微球中含綠僵菌HYN-1-2變為1 X IO8CFU,防治效果如實施例7_9。
實施例 7、綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 制劑對黃瓜根結線蟲的生防效果檢測選擇根結線蟲病發病嚴重的北京市門頭溝碧琨種植中心蔬菜溫室大棚，種植品種為迷你型小黃瓜(北京金土地農業技術研究所)。實驗采用隨機區組試驗，共設三個區組 (重復)，每個區組設6個小區(處理)，每個小區的面積為20平方米。在黃瓜苗移栽時，將供試藥劑采用穴施的方法，施于作物根下，實驗期間按常規方法管理，黃瓜移栽的株距和行距分別是30cm和50cm。作物收獲后，挖出黃瓜根，統計每個處理各重復中各級(0-10級)病株的數目，計算病情指數及防治效果，結果見表1，同時采集空白對照中黃瓜根上的根結線蟲，用立式顯微鏡通過形態方法鑒定根結線蟲的種類。各處理及藥劑如下處理1 不施任何藥劑(空白對照)；處理2 :1千克/畝穴施本發明的微球劑型綠僵菌HYN-1-2制劑；處理3 :4千克/畝穴施本發明的微球劑型綠僵菌HYN-1-2制劑；處理4 :8千克/畝穴施本發明的微球劑型綠僵菌HYN-1-2制劑；處理5 :1升/畝穴施1. 8%阿維菌素乳油(北京中農大生物技術有限公司奇克農藥廠生產)(對照1)；處理6 :30-40克/畝98%大掃滅粉劑(有效成分為二硫代氨基甲酸鉀和二甲基噻二嗪，上海金山實驗化工廠)熏蒸(對照2)。根結線蟲分級調查指標0級代表沒有根結，1級代表1-10%的根上有根結，2級代表11-20%的根上有根結，3級代表21-30%的根上有根結，4級代表31-40%的根上有根結，5級代表41-50%的根上有根結，6級代表51-60%的根上有根結，7級代表61-70%的根上有根結，8級代表71-80%的根上有根結，9級代表81-90%的根上有根結，10級代表 91-100%的根上有根結；病情指數=100X Σ (各級病株數X各級代表值)/調查總株數X最高代表值；防治效果=100% X (空白對照的病情指數-處理后的病情指數)/空白對照的病情指數。結果空白對照中黃瓜根上的根結線蟲主要是南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)禾口北方牛艮結線蟲(Meloidogyne hap la)。表1本發明的綠僵菌制劑對黃瓜根結線蟲的防治效果檢測結果
處理病情指數防治效果(％)處理1(空白對照)90. 38 ±4. 2處理2 (綠僵菌制劑1千克/畝)55. 14±6. 038. 98處理3 (綠僵菌制劑4千克/畝)29. 31±6. 767. 57處理4 (綠僵菌制劑8千克/畝)27. 82±4. 169. 22
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權利要求
1.綠僵菌(Metarhiziumanisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. M33。
2.—種綠僵菌制劑，其特征在于所述制劑的活性成分為權利要求1所述的綠僵菌 (Metarhizium anisopliae var· anisopliae)HYN-1-2。
3.根據權利要求2所述的制劑，其特征在于權利要求1所述的綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 在所述制劑中的含量為 IO7-IO9Cfu/克。
4.根據權利要求2或3所述的制劑，其特征在于所述制劑為微球型制劑。
5.權利要求1 所述的綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 或權利要求2-4中任一所述制劑在防治植物根結線蟲病害中的應用。
6.一種防治植物根結線蟲病害的方法，包括如下步驟將權利要求1所述的綠僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2 或權利要求2-4 中任一所述制劑施于植物的根下防治植物根結線蟲，所述防治植物根結線蟲為降低所述植物根結線蟲的病情指數。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于權利要求1所述的綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2或權利要求2-4中任一所述制劑按照如下用量施于所述植物的根下每畝Axioll-Sxio12Cfu權利要求1所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. Bnisopliae) ΥΝ_1_20
8.根據權利要求5-7中任一所述的應用或方法，其特征在于所述植物為黃瓜、青椒或西紅柿。
9.根據權利要求5-8中任一所述的應用或方法，其特征在于所述根結線蟲為南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)禾口 / 或北方牛艮結線蟲(Meloidogyne hap la)。
10.權利要求2-4中任一所述制劑的制備方法，包括如下步驟1)將硅藻土、權利要求1 所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2和海藻酸鈉水溶液按照20- 克硅藻土、4X 10"-7X IO11Cfu權利要求1所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae)HYN-1-2和2. 6-4. O克海藻酸鈉的配比混合均勻，得到懸浮液；2)將步驟1)得到的懸浮液按2.6-4. O克海藻酸鈉與1. 11-2. 22克氯化鈣的配比加入氯化鈣水溶液中，獲得權利要求1所述綠僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2的微球型制劑。
全文摘要
本發明公開了一株殺線蟲的綠僵菌及其應用。該綠僵菌為綠僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2，2011年10月31日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記入冊編號為CGMCC No.5433。本發明的綠僵菌及綠僵菌制劑用于防治植物根結線蟲，防治效果可達50％-70％，較為穩定，其活性成分在土壤中的定植效果好，無毒無污染、性價比高、施用方便，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01P5/00GK102382775SQ20111036999
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者劉建斌, 劉杏忠, 向梅春, 李鋒, 段維軍 申請人:中國科學院微生物研究所