專利名稱：：一種刀孢蠟蚧菌菌株的制作方法
技術領域：
：本發明涉及農作物病害的生物防治，具體說是一株高效產生幾丁質酶且對根結線蟲具有寄生作用的刀孢蠟蚧菌，屬于微生物及微生物應用領域。
背景技術：
：根結線蟲病是世界范圍內發生的一種重要的植物寄生線蟲病害(KeryBR.Anassessmentofprogresstowardmicrobialcontrolofplantparasiticnematode.JournalofNematology，1990，22(4S):621-631.StirlingGR.Biologicalcontrolofplantparasiticnematodes:progress，problemsandprospects.Wallingford:CABI，1991:106-108.)。近年來，我國由于根結線蟲的為害給農業生產造成了嚴重損失，特別是北方保護地種植的茄科和葫蘆科蔬菜(沈鏑，李錫香，馮蘭香，王海平，宋江萍，楊翠榮，龔會芝.葫蘆科蔬菜種質資源對南方根結線蟲的抗性評價.植物遺傳資源學報，2007，8(3):340-342.)。根結線蟲寄主范圍廣，目前尚缺少抗根結線蟲的商品化作物品種而且與非寄主植物輪作的措施在保護地難以施^smenjaudD，VoisinR，VanGC，BosselutN,LafargueB,DiVitoΜ,DirlewangerΕ,PoesselJL,KleinhentzΜ.Geneticdissectionofresistancetoroot-knotnomatodesMeloidogynespp.inplum,peach,almondandapricotfromvarioussegregatinginterspecificPrunusprogenies.TreeGeneticsandGenomes,2009,5:279-289.DubeB,SmartGC.BiologicalcontrolofMeloidogyneincognitabyPaecilomyceslilacinusandPasteuriaPenetrans.JournalofNematology,1987,19(2):222-227.)。采用傳統熏蒸性或非熏蒸性的化學殺線劑防治根結線蟲病，由于土壤殘留和環境破壞等原因，已經或即將被禁用，迄今為止生產上尚無安全有效防治根結線蟲病害措施。尋找和探索根結線蟲可持續治理措施的有效途徑，解決目前根結線蟲控制問題，除加強抗線育種和抗線砧木的研究和利用外，土壤微生態調控和生物防治微生物的釋放是國內外研究和應用的熱點。生物防治是根結線蟲可持續治理的核心內容之一(KeryBR.Anassessmentofprogresstowardmicrobialcontrolofplantparasiticnematode.JournalofNematology，1990，22(4S):621-631.StirlingGR.Biologicalcontrolofplantparasiticnematodesprogress,problemsandprospects.Wallingford:CABI，1991:106-108.AtkinsSD，Hidalgo-DiazL，KaliszH，MauchlineTH，HirschPR，KerryBR.Developmentofanewmanagementstrategyforthecontrolofroot-knotnematodes(Meloidogynespp)inorganicvegetableproduction.PestManagementScience，2003，59:183-189.)。Jl^^^tMLecanicilliumpsalliotae(syn.Verticilliumpsalliotae)MM結或胞囊類線蟲的生物防治具有重要的應用潛力。Gams&Zare根據形態學特征及ITS序列比較分析，將刀孢蠟蚧菌從輪枝菌屬中分離出來，定名為刀孢蠟蚧菌(ZareR，GamsW.ArevisionofVerticilliumsectionProstrata.IV.ThegeneraLecanicilliumandSimpliciumgen.nov.NovaHedwigia，2001，73(1):1-50.)。該菌寄主范圍很廣，既能寄生根結線蟲卵(ZareR,GamsW.ArevisionofVerticilliumsectionProstrata.IV.ThegeneraLecanicilliumandSimpliciumgen.nov.NovaHedwigia,2001,73(1)1-50.NicoleMV,GeorgeSA.FungiParasiticonJuvenilesandEggMassesofMeloidogynehaplainOrganicSoilsfromNewYork.SupplementtotheJournalofNematology,1998,30(4S):632-638.甘中偉，楊金奎，陶南，黃靜文，張克勤.刀孢輪枝菌胞外幾丁質酶的基因克隆及系統發育分析.菌物學報，2008，27(3):368-376.)、胞囊類線蟲(ZareR，GamsW.ArevisionofVerticilliumsectionProstrata.IV.ThegeneraLecanicilliumandSimpliciumgen.nov.NovaHedwigia,2001，73(1):1-50.)和腐生線蟲(YangJK，HuangXW，TianBY，WangM，NiuQH，ZhangKQ.Isolationandcharacterizationofaserineproteasefromthenematophagousfungus,Lecanicilliumpsalliotae，displayingnematicidalactivity.BiotechnologyLetters，2005，27:1123-1128.),也能寄生大豆銹病等多種病原真菌(SaksiriraW，HoppeH.SecretionofExtracellularEnzymesbyVerticilliumpsalliotaeTreschowandVerticilliumlecanii(Zimm.)ViegasDuringGrowthonUredosporesoftheSoybeanRustFungus(PhakopsorapachyrhiziSyd.)inLiquidCultures.JournalofPhytopathology，1991，131(1):161-173.ToshinoriN，KengoN，KenjiK，TadaoA.AntifungalActivityofOosporeinfromanAntagonisticFungusagainstPhytohthorainfestans.VerlagderZeitschriftfiirNaturforschung,2004，59c302-304.LiaoYM，XiongY，LuoDP，WangZW，YuanGQ,ZhouCM.AHyperparasitismofPucciniasp·AndIdentificationoftheMycoparasite.ChineseJournalofBiologicalControl，2008，24:85-89.)和商品蘑菇(TreschowC.TheVerticilliumdiseasesofcultivatedmushrooms.DanskBotanyArkiv，1941，11:1-31.)，以及多禾中農業害蟲(ToveS，RichardAH.EntomopathogenicPotentialofVerticilliumandAcremoniumSpecies(Deuteromycotina:Hyphomycetes).JournalofInvertebratePathology，1999，73:309-314.KuriharaY，KuriharaY，MachidaR，FukuiM，OkudaT，HarayamaS.Entomopathogenicfungiisolatedfromlaboratory-rearedBaculentulusdensus(Acerentomidae，Protura)·Edaphologia，2006，80P:25-28.DaleP，IrenaN，VaidiluteDV，VincasB.PinedefoliatorBupaluspiniariaL.(LepidopteraGeometridae)anditsentomopathogenicfungi[J].EKOLOGIJA,2010，56(1-2):34-40.KuriharaY，SukarnoN，IlyasM，YuniartiE，MangunwardoyoW,SaraswatiR，ParkJY，InabaS，WidyastutiY，AndoK.Entomopathogenicfungiisolatedfromsuspended-soil-inhabitingarthropodsinEastKalimantan，Indonesia.Mycoscience，2008,49:241-249.)。刀孢蠟蚧菌能夠產生一種絲氨酸蛋白酶Verll2和幾丁質酶LPCHIl對于線蟲體壁和卵殼具有明顯的消解作用，這兩種酶在根結線蟲的生物防治過程中發揮重要作用(甘中偉，楊金奎，陶南，黃靜文，張克勤.刀孢輪枝菌胞外幾丁質酶的基因克隆及系統發育分析.菌物學報，2008，27(3):368-376.YangJK，HuangXW，TianBY，WangM，NiuQH，ZhangKQ.Isolationandcharacterizationofaserineproteasefromthenematophagousfungus，Lecanicilliumpsalliotae,displayingnematicidalactivity.BiotechnologyLetters,2005,27:1123-1128.GanZW,YangJK,TaoN,LiangLM，MiQL，LiJ，ZhangKQ.CloningofthegeneLecanicilliumpsalliotaechitinaseLpchilandidentificationofitspotentialroleinthebiocontrolofroot-knotnematodeMeloidogyneincognita.ApplMicrobiolBiotechnol，2007，76:1309-1317.)。研究表明刀孢蠟蚧菌在PDA或WA上生長3d后能產生粉紅或紫紅色素。這種色素被認為是一種微毒物質，命名為卵孢霉素。這種毒素可能對線蟲也有一定的毒害作用(ZareR,GamsW.ArevisionofVerticilliumsectionProstrata.IV.ThegeneraLecanicilliumandSimpliciumgen.nov.NovaHedwigia，2001，73(1):1-50.)。刀孢蠟蚧菌不僅能寄生根結線蟲生活史中定居態的雌蟲和卵，還能寄生侵染態2齡幼蟲。該菌對根結線蟲具有高效生物防治效能，其產生的幾丁質酶和蛋白酶酶系是防治根結線病的關鍵因素。
發明內容本發明的目的在于提供一種刀孢蠟蚧菌菌株，該菌株對根結線蟲具有高效生物防治功能。為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種刀孢蠟蚧菌菌株，分類命名Lecanicilliumpsalliotae，于2011年10月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號CGMCCNO:5329。本發明的基本技術方案為從采自青島市城陽區感染根結線蟲病害的絲瓜根分離出蟲卵，置培養皿上培養，待長出菌絲后，經菌落形狀形態學觀察及分子生物學鑒定、ITS序列比對、系統發育分析，確定該菌為刀孢蠟蚧菌。通過大量的生物學實驗證明，本發明的刀孢蠟蚧菌不僅能寄生根結線蟲生活史中定居態的雌蟲和卵，還能寄生侵染態2齡幼蟲，且能產生幾丁質酶，對根結線蟲控制效果達85%以上，具體包括下列步驟1、刀孢蠟蚧菌菌株的分離將采自青島市城陽區感染根結線蟲病害的絲瓜根用水沖洗去泥沙，在NikonSMZ1000解剖鏡下挑取新鮮的卵塊，在2%NaClO震蕩解離，在500目篩子上收集卵，再經2%NaClO表面消毒后，將卵懸液涂于備好的WA培養基上，每皿含卵約50個。然后將培養皿置于27V的恒溫培養箱內培養，定期觀察，將長出的菌絲挑至PDA培養基上，菌絲長滿后-4°C保存待以后觀察鑒定；2、菌株的菌落性狀培養和形態學鑒定(1)菌落性狀培養將保存于4°C冰箱中的菌株移入直徑9cm的PDA平板上，27°C活化5d，用直徑6mm的打孔器在菌落邊緣切去菌塊，轉接到新的PDA平板上，27°C暗箱培養，3次重復。從第2d開始記錄菌落形態、顏色和菌落生長情況，直至菌落長滿平板。(2)形態學鑒定采用玻片培養法，PDA培養基分成5mmX5mm的薄薄的小片，挑于載玻片上，再將已活化的該菌菌絲挑于培養基上。置于27°C恒溫培養箱保濕培養，在Nikon80i顯微鏡系統連續觀察該菌的分生孢子、瓶梗、晶體等的形成情況，測量并照相；3、菌株的分子生物學鑒定、rDNA-ITS序列比對、系統發育分析；4、刀孢蠟蚧菌菌株對根結線蟲不同生活階段的定殖挑取PDA平板上27°C、6d的該菌菌落邊緣直徑6mm菌塊，置于WA培養基上，將卵、卵塊、2齡幼蟲、雌蟲接于該菌上，3d-7d觀察其寄生情況；5、刀孢蠟蚧菌菌株產生的幾丁質酶活性測定應用N-乙酰葡萄糖胺(NAG)法和對硝基苯(pNP)法分別測定該菌株產生的幾丁質降解酶系和外切酶活性；6、刀孢蠟蚧菌菌株的幾丁質酶粗提液離體條件下對根結線蟲卵的影響刀孢蠟蚧菌產生的幾丁質酶粗提液對南方根結線蟲卵孵化具有抑制和破壞作用，根結線蟲卵在幾丁質酶粗提液(菌培養濾液)25%、50%、75%、100%濃度下28V孵化觀察。本發明的刀孢蠟蚧菌菌株在PDA培養基培養IOd直徑為5661mm，正面觀白色棉狀，菌落背面紅色或紫紅色，35d產生紅色或粉紅色色素，色素常常擴散到瓊脂內；瓶梗細胞著生于菌絲形成的葡匐分生孢子梗上，單生或34根輪生，大小為13.7032.03(23.24士3.75)ymXl.162.40(1.76士0.21)μm，基部較粗至尖端逐漸變細；瓶梗頂端形成與瓶梗垂直的鐮刀形大分生孢子，鐮刀形的大分生孢子彎曲，一般具有尖銳的末端，大小為4.157.53(5.87士0.83)ymXl.433.76(2.20士0.34)μm，菌絲體具有一個隔，少數具有兩個隔；還能產生卵圓形或橢圓形小分生孢子，小分生孢子大小為2.73.7μmX1.01.5μm20d后老熟菌絲形成匯聚的膨大細胞；菌絲體可產生大量八面體的晶體。本發明的刀孢蠟蚧菌菌株能夠寄生根結線蟲卵、2齡幼蟲和雌蟲。本發明的刀孢蠟蚧菌菌株具有產生幾丁質酶的特性，其所產生的幾丁質降解酶系和外切酶在溫度為27°C75°C，及pH為3.07.0的條件下均具有高水平的酶切活性。本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的rDNA內轉錄間隔區DNA序列如SEQIDNO1所示。本發明的有益效果和優點是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株對根結線蟲卵、2齡幼蟲、雌蟲具有很高的寄生能力；并具有高效產生幾丁質酶的特性，產生的幾丁質酶在不同溫度和PH條件下均有較高的酶活性；本發明的刀孢蠟蚧菌產生的幾丁質酶粗提液對根結線蟲卵孵化具有明顯的抑制和破壞作用，本發明的刀孢蠟蚧菌菌株對根結線蟲物防治具有很大的應用潛力。圖1是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的形態特征及培養性狀圖，圖中A分生孢子梗和瓶梗；B-C瓶梗和鐮刀形孢子；D卵圓形小分生孢子；E老熟菌絲形成的菌絲膨大體；F菌絲體產生的晶體；G正面觀；H背面觀；圖2是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中M泳道為DNA分子量標準；1刀孢蠟蚧菌；圖3是基于rDNA-ITS序的刀孢蠟蚧菌菌株菌株類群系統發育樹及相關類群系統發育樹；圖4是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株對南方根結線蟲卵的寄生過程圖，圖中A菌絲經過并接觸到卵表面；B；菌絲對卵形成網狀結構；C卵殼變形，卵質外滲，卵被完全破壞；D即將孵化出的2齡幼蟲的卵也被寄生；E、F對照組；圖5是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株對南方根結線蟲2齡幼蟲和雌蟲的寄生圖，圖中A2齡幼蟲被菌絲所纏繞；B2齡幼蟲體壁被破壞產生大量鐮刀形孢子；D、E雌蟲蟲體形成侵染結構，體壁皺縮變形，內容物外滲；C、F對照組；圖6是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株產生的幾丁質酶在不同溫度下的酶切活性測定；圖7是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株產生的幾丁質酶在不同PH下的酶切活性測定；圖8是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的產幾丁質降解酶系活性(37°C，pH4.5)測定；圖9是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的產幾丁質外切酶活性(37°C，pH4.5)測定；圖10是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株不同濃度的幾丁質酶粗提液對根結線蟲蟲卵的相對孵化抑制率圖11是本發明的刀孢蠟蚧菌菌株不同濃度的幾丁質酶粗提液對根結線蟲蟲卵殼的破壞率。具體實施例方式實施例1.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的分離(1)培養基采用水瓊脂培養基(WA)，加熱溶化后，冷卻至約45°C，加入鏈霉素(0.lmg/ml)，搖勻后倒至直徑9cm培養皿中，待用。(2)分離方法將采自青島市城陽區感染根結線蟲病害的絲瓜根用水沖洗去泥沙，在NikonSMZ1000解剖鏡下挑取新鮮的卵塊，在2%NaClO震蕩解離，在500目篩子上收集卵，再經2%NaClO表面消毒后，將卵懸液涂于備好的WA培養基上，每皿含卵約50個，然后將培養皿置于27°C的恒溫培養箱內培養，定期觀察，將長出的菌絲挑至PDA培養基上，菌絲長滿后4°C保存待以后觀察鑒定。實施例2.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的菌落性狀培養和形態學鑒定(1)菌落性狀培養將保存于4°C冰箱中的菌株移入直徑9cm的PDA平板上，27V活化5d，用直徑6mm的打孔器在菌落邊緣切去菌塊，轉接到新的PDA平板上，27°C暗箱培養，3次重復。從第2d開始記錄菌落形態、顏色和菌落生長情況，直至菌落長滿平板。刀孢蠟蚧菌菌落生長較快，在PDA培養基培養IOd直徑為5661mm，正面觀白色棉狀(見圖1G)，菌落背面紅色或紫紅色，3-5d便可產生色素，紅色或粉紅色色素常常擴散到瓊脂內(見圖1H)。(2)菌株形態學鑒定采用玻片培養法，PDA培養基分成5mmX5mm的薄薄的小片，挑于載玻片上，再將已活化的該菌菌絲挑于培養基上；置于27°C恒溫培養箱保濕培養，在Nikon80顯微鏡系統連續觀察該菌的分生孢子、瓶梗、晶體等的形成情況，測量并照相。瓶梗細胞著生于菌絲形成的葡匐分生孢子梗上，單生或3-4根輪生(見圖1A-C)，大小為13.7032.03(23.24士3.75)ymXl.162.40(1.76士0.21)μm，基部較粗至尖端逐漸變細；瓶梗頂端形成與瓶梗垂直的鐮刀形大分生孢子(見圖1B)，鐮刀形的大分生孢子彎曲，一般具有尖銳的末端(見圖1C)，大小為4.157.53(5.87士0.83)μmX1.433.76(2.20士0.34)μm，菌絲體具有一個隔，少數具有兩個隔；還能產生卵圓形或橢圓形小分生孢子，小分生孢子大小為2.73.7μmX1.01.5μm(見圖ID)；20d后老熟菌絲形成匯聚的膨大細胞(見圖1E)；菌絲體可產生大量八面體的晶體(見圖1F)。實施例3.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的分子生物學鑒定、rDNA-ITS序列比對及系統發育分析(1)擴增引物的合成由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。通用PCR擴增引物ITSl-F:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT-3’ITS4-R5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3，(2)基因組DNA的提取采用CTAB法提取刀孢蠟蚧菌的DNA；(3)PCR反應體系QOμ1)模板DNA1μ1、PCRMasterMix(ThermoFisherScientificUOy1、上下游引物各1μ1，補充去離子水至20μ1。反應條件-MV4min預變性；940Clmin，55°C30s,72°C90s，35個循環；72°C延伸IOmin0(4)刀孢蠟蚧菌的基因測序PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2；將PCR產物送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序引物同上述PCR引物，測序結果5’端至3’序列為1GGGGTTTGGTGACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTTACAACTCCCAAA51CCCTTATGTGAACATACCAAGATGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGCGTC101CGGACGGCCTAGCGCCGCCCGCGGCCCGGACTCAGGCGGCCGCCGGAGA151CCACCAAACTCTTTTGTATCATGAGTATCTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAA201AACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT251GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA301ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCAT351GCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACTTCCCTTTGGGGAAATCGGCG401TTGGGGACCGGCAGCATACCGCCGGCCCCGAAATGGAGTGGCGGCCCGTC451CGCGGCGACCTCTGCGTAGTAATCCAACCTCGCACCGGAACCCCGACGTG501GCCACGCCGTAAAACACCCCACTTTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTA551GGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAAGCGGAGGA(5)rDNA-ITS序列比對及系統發育分析將上述步驟(4)測得的序列提交GenBank獲得登入號JN797793，并通過Blast程序與GenBank中已有的核酸序列進行比對，結果表明，該菌株的rDNA-ITS序列和Lecanicilliumpsalliotaexsd08038(EU918702)的相應序列同源性高達99%。為確定該菌株與同屬及其他種的親緣關系，選擇GenBank中已公布的代表性的7株菌的DNA序列，用ClustalX匹配排列后，通過MEGA4.1進行分析，通過鄰接法(Neigbor-joiningmethod)構建系統發育樹可見，與Lecanicilliumpsalliotae又以99%的置信度屬一類群(見圖3)。Bootstrap值大于70%就相當于統計學概率的95%，一般75%以上認為是可信(葉利芹，吳小芹，葉建仁.竹葉銹病重寄生現象及重寄生菌鑒定.菌物學報，2011，30(3):414-420)。實施例4.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株對根結線蟲不同生活階段的定殖(1)根結線蟲卵、2齡幼蟲、雌蟲的制備將感染南方根結線蟲(Meloidigyneincognita)的新鮮番茄根，經水沖去土壤后，在解剖鏡下直接解剖病根，挑出卵塊和雌蟲，卵塊置于2%NaClO中震蕩解離制成濃度為3000eggs/ml的卵懸液，將新鮮根結切成小塊置于貝曼漏斗過夜，收集底部濾液制成1500J2/ml。將制備好的卵、2齡幼蟲、雌蟲置于2%NaClO表面消毒aiiin后經滅菌水清洗待用。(2)本發明的刀孢蠟蚧菌菌株對根結線蟲不同生活階段的定殖挑取PDA平板上27°C、6d的純培養物邊緣直徑6mm菌塊，置于90X15mm2%WA(加入鏈霉素)平板培養基中央。27°C暗箱培養直至菌落長到45cm時，在菌落邊緣Imm平鋪4片經消毒的18X18mm蓋玻片并用WA埋入培養基內，分別取30μ1含有約100個卵懸液、30μ1含有約50個2齡幼蟲懸液、35個雌蟲加在對應的蓋玻片上，分別重復710次。對照組為不接菌的WA(加入鏈霉素)培養基。處理后的37d觀察卵、2齡幼蟲、雌蟲的寄生情況，并拍照記錄。結果表明刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲卵的寄生從第2d開始，隨時間的延長寄生率增加，到第6d達到高峰值85.76%。接菌的培養基上，初期菌絲與卵殼接觸形成侵入釘；然后穿透卵殼，有的卵殼皺縮凹陷甚至破裂，內容物外滲(見圖4A、B)；菌絲侵入卵內，在卵內生長，使卵內容物凝集，胚胎發育停止，卵殼變形，卵殼內充滿菌絲(見圖4B、C)，有時可發現菌絲上形成瓶梗，其上著生鐮刀形分生孢子(見圖4D)。刀孢蠟蚧菌對胚后發育期即將孵化2齡幼蟲的卵亦形成侵染釘，菌絲侵入卵內，幼蟲停止生長發育畸形。2齡幼蟲體內布滿菌絲，體壁皺縮變形(見圖4D)。未接菌的卵殼初期表面光滑，內容物均勻(見圖4E)，3d后可見明顯的胚胎發育(見圖4F)，5d后孵化出2齡幼蟲破殼而出。5d后觀察，接菌的2齡幼蟲被菌絲所纏繞(見圖5A)，在體壁上形成侵染釘并穿透體壁，體壁皺縮變形，有的2齡幼蟲被完全分解(見圖5B)，并且產生的鐮刀形孢子高于寄生卵時候產生的。5天后的寄生率高達79.23%。接菌培養基上的年輕雌蟲，菌絲接觸雌蟲體壁形成致密菌網和侵染釘(見圖5E)，穿透雌蟲體壁，體壁皺縮變形，內含物外滲(見圖5D)。未接菌培養基上的雌蟲，外殼表面光滑，內含物均勻完整(見圖5F)。實施例5.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株產生幾丁質酶的制備(1)膠體幾丁質的制備稱取IOg幾丁質(Sigma)于IOOml85%H3PO4中，充分溶解，4°C下過夜，加入500ml超純水，電動攪拌使其充分分散，用超純水洗至pH5.05.5左右，4°C下保存備用。(2)產幾丁質酶培養條件250ml的錐形瓶內盛有120ml的液體培養基(0.2%膠體幾丁質，0.3%KNO3,0.2%Na2HPO4,0.1%KH2PO4,0.03%NaCl,0.05%MgSO4·7H20,0.001%FeSO4和0.3%Tryptone(Sigma))，調pH值為6.0,0.15Mpa,121°C滅菌30min備用。將活化5d的刀孢蠟蚧菌落邊緣菌塊(直徑5mm)5塊接種于裝有120mL幾丁質液體培養基的250mL錐形瓶中，27°C150rpm搖培，3次重復實驗。從第2d開始每隔2d取1.5ml培養濾液直到第16d，將培養濾液IlOOOrpm離心15min，上清液為幾丁質酶粗提液，-20°C保存，供幾丁質酶活性測定。實施例6.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株的產幾丁質酶特性及幾丁質酶活性測定(1)刀孢蠟蚧菌菌株產生的幾丁質降解酶系在不同溫度和pH下的活性幾丁降解酶系活性依據膠體幾丁質生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量測定。酶促反應體系包括0.ImL刀孢蠟蚧菌培養濾液(上述實施例5制備的幾丁質酶粗提液)、0.5mll.0%膠體幾丁質和0.4mL0.Imol·L_lpH4.5醋酸鈉緩沖液(最適pH)，以加200μLImol·L-INaOH不反應為對照。置于搖床中在不同溫度27°C、37°C、50°C、75°C，150rpm反應lh，反應后立即加200μ1Imol·L-INaOH終止反應，IlOOOrpm離心lOmin，分別取上清液500μ1于ImlSchales'液，沸水中顯色反應15min，420nm波長測其吸光度(0D值)。3次重復實驗。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0-100μg)制作標準曲線，以Ih產生1μmolNAG量計算為1個酶活單位⑶。幾丁質降解酶系活性依據膠體幾丁質生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量測定。酶促反應體系包括0.ImL刀孢蠟蚧菌第4d(酶活性最高)培養濾液(上述實施例5制備的幾丁質酶粗提液)、0.5mll.0%膠體幾丁質和0.4mL0.Imol·L—1不同pH(3.0、3.5(檸檬酸鈉緩沖溶液)4.0、4.5、5.0、5.5(醋酸鈉緩沖溶液)6.0、6.5、7.0(磷酸鈉緩沖溶液))，以加200μLImol·L^1NaOH不反應為對照。置于搖床中在37°C(最適溫度)，150rpm反應lh，反應后立即加200μ1Imol-L"1NaOH終止反應，IlOOOrpm離心lOmin，分別取上清液500μ1于ImlSchales，液，沸水中顯色反應15min，420nm波長測其吸光度(0D值)。3次重復實驗。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0100μg)制作標準曲線，以Ih產生1μmolNAG量計算為1個酶活單位⑶。結果顯示在溫度27°C、37°C、50°C、75°C和pH3.07.0下均表現出較高的幾丁質酶活性，并且在溫度為37°C、pH為4.5條件下刀孢蠟蚧菌表現的幾丁質酶活性最強為3.98ymol/hml，結果見圖6、7所示。(3)刀孢蠟蚧菌菌株產幾丁質降解酶系活性測定幾丁質降解酶系活性依據膠體幾丁質生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量測定。酶促反應體系包括0.ImL刀孢蠟蚧菌培養濾液(上述實施例5制備的幾丁質酶粗提液)、0.5mll.0%膠體幾丁質和0.4mL0.Imol·Γ1ρΗ4.5醋酸鈉緩沖液，以加200μLImol-T1NaOH不反應為對照。置于搖床中37°C，150rpm反應lh，反應后立即加200μ1Imol·L4NaOH終止反應，IlOOOrpm離心lOmin，分別取上清液500μ1TImlSchales'液，沸水中顯色反應15min，420nm波長測其吸光度(0D值)。3次重復實驗。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0100μg)制作標準曲線，以Ih產生1μmolNAG量計算為1個酶活單位⑶。結果顯示本發明的刀孢蠟蚧菌菌株從第2d就開始產生幾丁質降解酶系，表現出酶活性，且酶活性上升迅速，第4d達到酶活性高峰為3.98μmol/hml，之后緩慢下降，見圖8所示。(4)刀孢蠟蚧菌菌株產幾丁質外切酶活性測定幾丁質外切酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase)活性測定以pNP-NAG為底物，測定酶促反應生成的對硝基苯酚(pNP，p-nitrophenol)的含量。酶促反應體系包括50μ1刀孢蠟蚧菌培養濾液(上述實施例5制備的幾丁質酶粗提液)、50μ1pNP-NAG(lmg/ml)、100μ10.IMρΗ4·5醋酸緩沖液，以加ImlImol·L^1NaOH不反應為對照。置于搖床中37°C，150rpm反應2h，反應后立即加Imllmol.L-1NaOH終止反應。混勻后立即在405nm下測量其吸光度(0D值)。3次重復實驗。以已知含量對硝基苯酚(PNP)作標準曲線制作標準曲線，以Ih產生1μmolpNP需要的酶量計算為1個酶活單位(U)。結果顯示本發明的刀孢蠟蚧菌菌株從第2d開始就產生幾丁質外切酶，所產生的幾丁質外切酶的活性從第4到16d—直保持較高水平，最高為0.38μmol/hml，結果見圖9所示。實施例7.本發明的刀孢蠟蚧菌菌株產生的幾丁質酶粗提液離體條件下對根結線蟲卵的影響刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲卵孵化具有抑制和破壞作用作用，根結線蟲卵在本發明的刀孢蠟蚧菌菌株產生的幾丁質酶粗提液25%、50%、75%、100%濃度下孵化觀察，在幾丁質酶粗提液第7d的卵孵化抑制率達和破壞率分別為94.52%(見圖10)和84.32%(見圖11)。本發明的刀孢蠟蚧菌菌株不僅能寄生根結線蟲生活史中定居態的雌蟲和卵，還能寄生侵染態2齡幼蟲，還具有產生幾丁質酶的特性，其產生的幾丁質酶是防治根結線蟲病的關鍵因素，研制的菌劑已進行田間生產應用，對根結線蟲控制效果達85%以上。權利要求1.一種刀孢蠟蚧菌菌株，其特征在于該菌株是刀孢蠟蚧菌Lecanicilliumpsalliotae，于2011年10月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNO:5329。2.根據權利要求1所述的刀孢蠟蚧菌菌株，其特征在于所述的刀孢蠟蚧菌菌株在PDA培養基培養IOd直徑為5661mm，正面觀白色棉狀，菌落背面紅色或紫紅色，35d產生紅色或粉紅色色素，色素擴散到瓊脂內；瓶梗細胞著生于菌絲形成的葡匐分生孢子梗上，單生或34根輪生，大小為13.7032.03(23.對士3.75)ymXl.162.40(1.76士0.21)μm，基部較粗至尖端逐漸變細；瓶梗頂端形成與瓶梗垂直的鐮刀形大分生孢子，鐮刀形的大分生孢子彎曲，具有尖銳的末端，大小為4.157.53(5.87士0.83)ymXl.433.76(2.20士0.34)μm,菌絲體具有一個隔，少數具有兩個隔；產生卵圓形或橢圓形小分生孢子，小分生孢子大小為(2.73.7)μmX(1.01.5)μm；20d后老熟菌絲形成匯聚的膨大細胞；菌絲體產生大量八面體的晶體。3.根據權利要求1所述的刀孢蠟蚧菌菌株，其特征在于所述的刀孢蠟蚧菌菌株具有寄生根結線蟲蟲卵、2齡幼蟲和雌蟲的特性。4.根據權利要求1所述的刀孢蠟蚧菌菌株，其特征在于所述的刀孢蠟蚧菌菌株具有產生幾丁質酶的特性，其所產生的幾丁質酶在溫度為27°C75°C，及pH為3.07.0的條件下具有酶切活性。5.根據權利要求14中任一項所述的刀孢蠟蚧菌菌株，其特征在于所述的刀孢蠟蚧菌菌株的rDNA內轉錄間隔區DNA序列如SEQIDNO1所示。全文摘要本發明公開一種刀孢蠟蚧菌菌株Lecanicilliumpsalliotae，保藏編號為CGMCCNO5329。該菌株能夠定殖根結線蟲不同生活階段的卵、2齡幼蟲和雌蟲。應用N-乙酰葡萄糖胺法和對硝基苯法分別測定該菌株產生的幾丁質降解酶系和外切酶活性，其酶活可達3.98U/h·mL和0.38U/h·mL，產生的幾丁質酶在不同溫度(27℃～75℃)及不同pH(3.0～7.0)均能檢測到較高活性；離體條件下測定該菌產生的幾丁質酶粗液對根結線蟲卵孵化的影響，酶液對卵的相對孵化抑制率和破壞率分別為94.52％和84.32％。本發明的刀孢蠟蚧菌菌株應用于農作物根結線蟲病害的生物防治，為我國北方保護地瓜、果類、蔬菜，特別是嚴重為害的根結線蟲病害的控制提供了有效的途徑，具有顯著的生態效益、經濟價值和社會價值。文檔編號A01N63/04GK102417886SQ20111038170公開日2012年4月18日申請日期2011年11月18日優先權日2011年11月18日發明者劉愛華,曹君正,武俠,王鳳龍申請人:青島農業大學