一種巨大芽孢桿菌t482及其菌劑和菌劑制備方法

一種巨大芽孢桿菌t482及其菌劑和菌劑制備方法
【專利摘要】本發明涉及微生物菌劑技術領域，具體涉及一種巨大芽孢桿菌T482及其菌劑和菌劑制備方法，所述巨大芽孢桿菌T482保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCM 2015754。所述的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選；（2）純化、保存；（3）固體發酵培養；（4）菌劑制備，即得到巨大芽孢桿菌T482菌劑。本發明的巨大芽孢桿菌T482具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力，其固氮酶活性為1000～1200 nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中吲哚乙酸的分泌量為200～300 mg/L，其作為一種新的微生物菌劑，在農業生產中，具有良好的應用前景。CCTCCM 201575420151215
【專利說明】
-種巨大芽抱桿菌T482及其菌劑和菌劑制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及微生物菌劑技術領域，具體設及一種巨大芽抱桿菌T482及其菌劑和菌 劑制備方法。
【背景技術】
[0002] 化肥的有效供應是農業可持續發展的基本保證之一，但伴隨著化肥特別是氮肥的 大量使用，在滿足作物高產需要的同時，帶來的化肥報酬率遞減、±壤物理性狀惡化和水資 源污染等負面效應已不容忽視。由于傳統化肥應用伴隨著種種弊端，因此研制出一種可W 降低其用量而且符合農業可持續發展要求的新型肥料就顯得十分必要了。當前，作為一項 新的農業措施，施用微生物肥料在發展高產、高效、優質農業和生產綠色食品、保護農業生 態環境中的作用已引起國內外學者的高度重視。生物固定的氮量在整個自然界的固氮量中 占有很高的比例已經被大量的研究證實，一般是非生物固氮的兩倍多，利用生物固氮運一 重要途徑來提供氮肥給農業生產帶來了良好的經濟效益、無污染等好處。
[0003] 巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)是一種好氧產抱革蘭氏陽性細菌，至今已 有一百多年的研究歷史。近年來，隨著微生物肥料的研究，巨大芽抱桿菌作為解憐菌被廣泛 應用于解憐細菌肥料生產。目前，國內對巨大芽抱桿菌在微生物肥料上的研究主要集中在 菌株選育、解憐效果、發酵條件優化及與解鐘菌相互作用等方面，而對巨大芽抱桿菌的固氮 作用卻不多見。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種巨大芽抱桿菌T482,其具 有固氮酶活性和分泌生長素嗎I噪乙酸的功能。
[0005] 本發明的另一目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種巨大芽抱桿菌T482菌 劑，其具有較高的固氮酶活性且能分泌生長素，農業應用范圍廣，經濟效益高。
[0006] 本發明的另一目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種巨大芽抱桿菌T482菌 劑制備方法，工藝簡單成熟，可規模化生產。
[0007] 本發明的目的通過W下技術方案實現。
[000引一種巨大芽抱桿菌T482，所述巨大芽抱桿菌T482保藏于中國典型培養物保藏中屯、 (畑ina Center for Type Collection),地址為中國武漢大學，分類號為巨大芽抱桿菌 T482 Bacillus megateriumT482保藏號為CCTCCM 2015754,保藏日期為2015年 12月 15日。
[0009] 所述巨大芽抱桿菌T482具有序列表NO. 1的DNA序列。
[0010] 所述巨大芽抱桿菌T482的固氮酶活性為1000~1200皿〇1/(血· h)，其在生長代謝 過程中可W產生嗎I噪乙酸，嗎I噪乙酸的分泌量為200~300mg/L。
[0011] -種巨大芽抱桿菌T482的菌劑制備方法，包括W下步驟：
[001^ (1)分離、篩選
[0013]選取含有巨大芽抱桿菌T482的固氮菌菌落的±樣，經分離篩選培養基培養得到固 氮菌菌落；
[0014] (2)純化、保存
[0015] 在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行劃線純化，培養分離得 到巨大芽抱桿菌T482單菌落，保存該單菌落備用；巨大芽抱桿菌T482單菌落如圖1所示。
[0016] 具體地，在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的菌落進行劃線純化，3(TC恒溫培 養36-48小時分離得到巨大芽抱桿菌T482單菌落，將平板上出現的單菌落保存在試管中，30 °。直溫培養36-48小時，置于4°C冰箱中保存。
[0017] (3)固體發酵培養
[0018] 選取上述巨大芽抱桿菌T482單菌落，用固體培養基進行培養，發酵環境pH為7.1- 7.4，接種量0.5-1.0%，培養溫度為30-37°C，培養時間為48-60小時；
[0019] (4)菌劑制備
[0020] 將固體發酵培養后的產物于30-5(TC烘干后用小型粉碎機打碎，設定最終產品活 菌數為5億/g，進行檢測，檢測結果顯示該活菌數范圍是3-8億/g，產品活菌數完全符合國家 標準《微生物菌劑》GB20287-2006要求2億/gW上，得到巨大芽抱桿菌T482菌劑，即可包裝成 成品。
[0021] 影響微生物生長繁殖的環境因素有很多，對發酵影響較大的有抑、接種量、培養溫 度和培養時間。
[0022] pH是微生物生長和產物合成的非常重要的影響參數，是衡量代謝活動的綜合指 標。抑的變化會影響到各種酶活、菌對基質的利用速率和細胞的構造，從而影響菌的生長和 產物的合成。在巨大芽抱桿菌T482發酵過程中，通過補酸或者補堿的方法調節pH為7.1- 7.4。
[0023] 適當的接種量可調節培養液黏度和溶解氧含量，縮短生長達到高峰的時間、使產 物提前合成。巨大芽抱桿菌T482的接種量設定為0.5-1.0 %。
[0024] 微生物的生長和產物的合成均需要在其各自最合適的溫度下進行。溫度是保證酶 活的重要條件，故在發酵過程中必須保證最適的溫度環境。巨大芽抱桿菌T482的固體發酵 溫度最佳為30-37 °C。
[0025] 根據巨大芽抱桿菌T482在搖瓶中的生長情況，設定培養時間48-60小時為發酵終 點。
[0026] 所述步驟(3)固體發酵培養中，培養基由W下重量份的原料組成:教皮65-72份，豆 巧22-28份，化(：13-4份，〔曰(：03 1.5-2.5份，]\111504*此0 0.01-0.04份，]\%504*7此0 0.01- 0.05份，調節培養基的pH為7.1-7.4。
[0027] 優選地，所述步驟(3)固體發酵培養中，培養基由W下重量份的原料組成:教皮69 份，豆巧25份，化C1 3.6份，CaC〇3 2.0份，MnS〇4·出0 0.02份，MgS〇4.7出0 0.02份，培養基 的抑為7.1-7.4。該固體發酵培養有利于提高產抱量，促進作物的生長，降低生產成本。 [00%]所述步驟（1)分離、篩選的具體方法為:選取±樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩， 靜置，取上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，再加入含吐溫80的無菌水懸浮，離屯、，去沉淀， 再將上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用憐酸緩沖液懸浮，得到樣品液;取上述 樣品液與憐酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋菌懸液;將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸 取涂布于無氮培養基，培養獲得固氮菌菌落。
[0029] 更具體地，分離、篩選的方法為：
[0030] 從廣東省東競市常平鎮黃泥塘農場采取500肖±樣，加入化含0.01 %吐溫80的無菌 水，震蕩lOmin，靜置半個小時，取上清液于20°C下SOOOrpm離屯、20min。棄上清液，保留沉淀 物，加入30-50血含0.01 %吐溫80的無菌水懸浮，液體于20 °C下5000rpm離屯、5秒鐘，去沉淀， 將上清液倒入一個干燥無菌的離屯、管中于20°C下4820rpm離屯、lOmin，棄上清液，保留沉淀 物，將沉淀物用lOmL的抑7.0憐酸緩沖液懸浮，得到樣品液;取ImL上述樣品液與9mL憐酸緩 沖液懸浮混合，即為10倍稀釋菌懸液。將稀釋的菌懸液置于75°C水浴加熱15min，自然冷卻 后吸取1(Κ)化涂布于無氮培養基，30 °C培養36-48小時獲得含巨大芽抱桿菌T482的固氮菌菌 落。
[0031] 所述步驟（1)中，分離篩選培養基由W下質量的原料制成：CaC〇3 1.0-1.4g， MgS〇4*7H2〇 0.6-1.2g，K2HP〇4 1.0-2. Og，化 Cl 0.1-0.4g，FeS〇4*7H2〇 0.001-0.005g， NaM〇4 · 2出0 0.05-0.1 g，薦糖5-lOg，瓊脂 18-20g，蒸饋水 1000ml，抑7.1-7.4。本發明的分離 篩選培養基屬于改良無氮培養基，培養效果好。
[0032] 所述純化保存的具體方法為:在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的菌落進行 劃線純化，3(TC恒溫培養36-48小時分離得到枯草芽抱桿菌T482單菌落。將平板上出現的單 菌落保存在試管中繼續30°C恒溫培養36-48小時，置于4°C冰箱中保存。巨大芽抱桿菌T482 保藏于中國典型培養物保藏中屯、，保藏號碼為:CCTCCM 2015754。
[0033] (2)純化保存培養基的配方為：牛肉膏3. Og，蛋白腺10.0 g，氯化鋼5. Og，瓊脂 18. Og，蒸饋水1000ml，培養基抑為7.0-7.4。
[0034] 所述步驟(2)和步驟(3)之間還包括有W下步驟：
[0035] (S1)革蘭氏染色:將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；
[0036] (S2)芽抱染色:將陽性菌進行芽抱染色，篩選得到含有芽抱的革蘭氏陽性菌單菌 落。
[0037] 芽抱染色及其革蘭氏染色
[0038] 革蘭氏染色和芽抱染色是兩種細菌鑒定的常規方法，染色可W縮小鑒定范圍。未 經染色的細菌與周圍環境折光率差別甚小，在顯微鏡下極難觀察。革蘭氏染色后細菌與環 境形成鮮明對比，可W清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些菌種屬于革蘭氏陽性(G+)或 者革蘭氏陰性菌(G1，用W分類鑒定。革蘭氏陰性菌普遍存在安全隱患，在農業微生物應用 過程中直接高溫滅菌后舍棄結構特征。芽抱染色將菌體內的芽抱進行染色，可W直觀觀察 芽抱的大小、位置、形狀等特點，有利于進一步縮小其鑒定范圍。芽抱桿菌具有保質期長，易 于存放的特點，在農業微生物產品具有廣泛的應用基礎。
[0039] 1、革蘭氏染色
[0040] (1)涂片:在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除載玻片上的雜 質。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將 樣品載玻片在火燈上方來回過3次，W固定細胞。
[0041] (2)初染:滴加2-5滴草酸錠結晶紫染液，染Imin，傾去染液，流水沖洗至無紫色。
[0042] (3)媒染:先用新配的艦液(艦l.Og、艦化鐘2.Og、蒸饋水300.OmU沖去殘水，再用 艦液覆蓋涂面Imin，后水洗。
[0043] (4)脫色:除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15-20秒后，立即用流水沖洗。
[0044] (5)復染:滴加1滴番紅染色液，染3-5min，水洗后用吸水紙吸干。
[0045] (6)鏡檢:將載玻片置于光學顯微鏡下觀察染色結果。
[0046] 2、芽抱染色
[0047] 在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除載玻片上的雜質。在載 玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將樣品載玻片 在火燈上方來回過3次，W固定細胞。在涂布菌體的區域滴加1~2滴石碳酸堿性復紅染液， 染色3min。用蒸饋水沖洗掉染液，風干后，將載玻片置于光學顯微鏡下觀察。
[004引如圖2和圖3所示，通過革蘭氏染色和芽抱染色結果可W看出，巨大芽抱桿菌T482 為革蘭氏陽性菌，桿狀，含有芽抱。
[0049] 一種巨大芽抱桿菌T482的菌劑，由上述的一種巨大芽抱桿菌T482的菌劑制備方法 制備而成。
[0050] 固氮酶活性測定
[0化1] 1、試驗方法
[0052] 采用乙烘還原法對各菌株的固氮酶活性進行測定。將保存的各菌株用VM-Ethanol 固體培養基活化，用接種環挑取1環菌體于1.5mL的無菌離屯、管中，用無菌水稀釋，按相同接 種量接入裝有5mL半固體培養基的lOmL試管中，用反口橡膠塞密封。37°C培養24h后，注入1/ 10體積的10%乙烘氣體，繼續培養2地，從試管中抽取0.5mL氣體注入氣相色譜儀(北京天普 分析儀器廠SP-2100)中，測定乙烘、乙締的含量。按下列公式計算固氮酶活性大小(北京農 業大學微生物專業編，1986):
[0053] C=化 xXcXV)/(24.9XhsXt) (2.1)
[0054] 其中，hx為樣品峰面積值;hs為標準C2H4峰面積值;C為標準C2H4濃度(nmol/mU ;
[0055] V為培養容器體積(mL); t為樣品培養時間化）；C為產生的C2出濃度[nmo 1 /(mL · h)]。
[0化6] 2、試驗結果
[0057]結合公式(2.1)和固氮酶活性測定圖4得知，固氮酶活性為1000~1200nmol/(mL · h)。由此可W說明，巨大芽抱桿菌T482在代謝過程中可W產生特定的固氮酶，可W自生固定 大氣中的氮氣。
[005引生長素定性含量測定
[0059] (1)挑取菌株分別接種(〇〇6日日=1.0，0.5mL菌懸液)到盛有50mL King液體培養基的 250mLS角瓶中，每組3個重復。
[0060] (2)接種完畢后，將Ξ角瓶置于搖床上，28°C，12虹pm，培養3d，待測。
[0061] (3)從上述在King液體培養基上生長3d的菌懸液取SOiiL置于透明離屯、管中，同時 加 5化L比色液。
[0062] (4)設陽性對照和陰性對照，陽性對照中加入50化濃度為lOmg/L的植物生長激素 (IAA)，同時加 SOiiL比色液。陰性對照中加50yLKing液體培養基，同時加 SOiiL比色液。
[0063] (5)將陽性對照液、陰形對照液和測定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min，觀察 其顏色變化，顏色變紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，且顏色越深表示分泌IAA的能力越強； 若不變色則為陰性，表示該菌株不能分泌IAA，由此作為判斷依據進行判斷分析。
[0064] 培養基為:King培養基（1L);試劑配方為蛋白腺20g，K2HP〇4 1.725g，MgS〇4 · 7此0 1.5g，丙Ξ醇15mL，色氨酸0.1 g，蒸饋水lOOOmL。
[0065] 生長素定量測定
[0066] 參照Riberio等的方法略加改動。菌株T482接種到含有Ig/L色氨酸的LB液體培養 基中，30°C，180r/min，振蕩培養4她。將培養液lOOOOr/min離屯、5min，取100血上清液加到96 孔板中，與100血Salkowski's試劑（ImL 0.5mol/L FeCb和49mL 35%高氯酸）混勻，室溫 靜置30min，在波長530nm下用酶標儀測定吸光度。用不同濃度的ΙΑΑ標準品制作標準曲線， 測定結果見表1。
[0067] 表1菌株Τ482 ΙΑΑ測定結果 [006引
[0069] 從表1和圖5可W看出，巨大芽抱桿菌Τ482的生長素濃度為241.37mg/L，因此，可W 判斷巨大芽抱桿菌T482在生長代謝過程中可W產生IAA，具有促進作物生長的功能。
[0070] 本發明的有益效果：
[0071] (1)本發明W巨大芽抱桿菌T482為出發菌株，對其固氮酶活性W及分泌生長素能 力進行測定，發現菌株T482具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力，其固氮酶活性為1000~ 1200皿olAmL · h)，其在生長代謝過程中嗎I噪乙酸的分泌量為200~300mg/L。巨大芽抱桿 菌T482,作為一種新的微生物菌劑，在農業生產中，具有良好的應用前景。
[0072] (2)本發明的巨大芽抱桿菌T482菌劑制備方法，工藝簡單，可規模化生產。
[0073] (3)本發明W巨大芽抱桿菌T482為出發菌株進行玉米、西紅柿的植物生長試驗，能 夠顯著地促進植物的生長。
【附圖說明】
[0074] 利用附圖對發明作進一步說明，但附圖中的實施例不構成對本發明的任何限制， 對于本領域的普通技術人員，在不付出創造性勞動的前提下，還可W根據W下附圖獲得其 它的附圖。
[0075] 圖1為分離得到的巨大芽抱桿菌T482單菌落在顯微鏡下放大10X100倍的菌落圖。
[0076] 圖2為巨大芽抱桿菌T482革蘭氏染色結果圖。
[0077] 圖3為巨大芽抱桿菌T482芽抱染色結果圖。
[0078] 圖4為巨大芽抱桿菌T482固氮酶活性測定結果圖。
[00巧]圖5為巨大芽抱桿菌T482IAA比色效果圖。
[0080]圖6為巨大芽抱桿菌T482微生物菌劑玉米盆栽效果圖。
[0081 ]圖7為巨大芽抱桿菌T482微生物菌劑西紅柿盆栽效果圖。
【具體實施方式】
[0082] 結合W下實施例對本發明作進一步描述。
[0083] 實施例1
[0084] 本實施例的一種巨大芽抱桿菌T482,所述巨大芽抱桿菌T482保藏于中國典型培養 物保藏中屯、，保藏號為CCTCCM 2015754。所述巨大芽抱桿菌T482具有序列表N0.1的DNA序 列。
[0085] 所述巨大芽抱桿菌T482的固氮酶活性為llOOnmol/(血· h)，其在生長代謝過程中 嗎I噪乙酸的分泌量為250mg/L。
[0086] 一種巨大芽抱桿菌T482的菌劑制備方法，包括W下步驟：
[0087] (1)分離、篩選
[0088] 選取含有巨大芽抱桿菌T482的固氮菌菌落的±樣，經分離篩選培養基培養得到固 氮菌菌落；
[00例 （2)純化、保存
[0090] 在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行純化，培養分離得到巨 大芽抱桿菌T482單菌落，保存該單菌落備用；
[0091] (3)固體發酵培養
[0092] 選取上述巨大芽抱桿菌T482單菌落，用固體培養基進行培養，發酵環境pH為7.2， 接種量0.8%，培養溫度為32°C，培養時間為52小時；
[0093] (4)菌劑制備
[0094] 將固體發酵培養后的產物烘干后打碎，活菌數檢測的檢測結果顯示該活菌數范圍 是3-8億/g，即得到巨大芽抱桿菌T482菌劑。
[00M]所述步驟（1)分離、篩選的具體方法為:選取±樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩， 靜置，取上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無菌水懸浮，離屯、，去沉淀，將 上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用憐酸緩沖液懸浮，得到樣品液;取上述樣品 液與憐酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋菌懸液;將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂 布于無氮培養基，培養獲得固氮菌菌落。
[0096] 所述步驟（1)中，分離篩選培養基由W下質量的原料制成：Ca(X)3 1.2g，MgS化· 7出0 0.8邑，1(2冊04 1.5邑，船(：10.2邑，尸6504.7此0 0.003邑，胞]\104.2出0 0.08邑，薦糖8邑，瓊 脂18g，蒸饋水1000ml，抑7.2。
[0097] 所述步驟(2)純化、保存的具體方法為:在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的 菌落進行劃線純化，3(TC恒溫培養36小時分離得到巨大芽抱桿菌T482單菌落，將平板上出 現的單菌落保存在試管中，30°C恒溫培養36小時，置于4°C冰箱中保存。
[0098] 優選地，所述步驟(3)固體發酵培養中，培養基由W下重量份的原料組成:教皮69 份，豆巧25份，NaCl 3.6份，CaC〇3 2.0份，MnS〇4·出0 0.02份，MgS〇4*7出0 0.02份，pH 7.2。
[0099] 一種巨大芽抱桿菌T482的菌劑，由所述的一種巨大芽抱桿菌T482的菌劑制備方法 制備而成。
[0100] 實施例2
[0101] 本實施例與實施例1的不同之處在于，本實施例的所述步驟(2)和步驟(3)之間還 包括有W下步驟：
[0102] (S1)革蘭氏染色:將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；
[0103] (S2)芽抱染色:將陽性菌進行芽抱染色，篩選得到含有芽抱的革蘭氏陽性菌單菌 落。
[0104] 具體地，革蘭氏染色方法為：
[0105] (1)涂片：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜 質。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將 樣品載玻片在火燈上方來回過3次，W固定細胞。
[0106] (2)初染:滴加2-5滴草酸錠結晶紫染液，染Imin，傾去染液，流水沖洗至無紫色。
[0107] (3)媒染:先用新配的艦液(艦l.Og、艦化鐘2.Og、蒸饋水300.OmL)沖去殘水，再用 艦液覆蓋涂面Imin，后水洗。
[0108] (4)脫色:除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15-20秒后，立即用流水沖洗。
[0109] (5)復染:滴加1滴番紅染色液，染3-5min，水洗后用吸水紙吸干。
[0110] (6)鏡檢:將載玻片置于光學顯微鏡下觀察染色結果。
[0111] 具體地，芽抱染色方法為：
[0112] 在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質。在載玻 片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將樣品載玻片在 火燈上方來回過3次，W固定細胞。在涂布菌體的區域滴加1~2滴石碳酸堿性復紅染液，染 色3min。
[0113] 本實施例的其余內容與實施例1相同，運里不再寶述。
[0114] 實施例3
[0115] 本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述步驟(3)固體發酵培養 中，選取上述巨大芽抱桿菌T482單菌落，用固體培養基進行培養，發酵環境抑為7.1，接種量 0.5%，培養溫度為30°C，培養時間為60小時。
[0116] 所述步驟(4)菌劑制備:將固體發酵培養后的產物烘干后打碎，活菌數檢測的檢測 結果顯示該活菌數范圍是3億/g，即得到巨大芽抱桿菌T482菌劑。
[0117]所述步驟（1)中，分離篩選培養基由W下質量的原料制成：Ca(X)3 1.0g，MgS化· 7此0 0.6g，K2HP04l.0g，NaC10.1g，FeS04·7此0 0.001g，NaM04·2出0 0.05g，薦糖5g，瓊 脂18g，蒸饋水1000ml，抑7.1。
[0118] 所述步驟(2)純化、保存的具體方法為:在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的 菌落進行劃線純化，3(TC恒溫培養42小時分離得到巨大芽抱桿菌T482單菌落，將平板上出 現的單菌落保存在試管中，30°C恒溫培養42小時，置于4°C冰箱中保存。
[0119] 所述步驟(3)固體發酵培養中，培養基由W下重量份的原料組成:教皮65份，豆巧 28份，NaCl 3份，CaC〇3 1.5份，MnS〇4·出0 0.01 份，MgS〇4*7出0 0.01 份，pH 7.1。
[0120] 本實施例的其余內容與實施例1或2相同，運里不再寶述。
[0121] 實施例4
[0122] 本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述步驟(3)固體發酵培養 中，選取上述巨大芽抱桿菌T482單菌落，用固體培養基進行培養，發酵環境抑為7.2，接種量 0.8%，培養溫度為32°C，培養時間為54小時。
[0123] 所述步驟(4)菌劑制備:將固體發酵培養后的產物烘干后打碎，活菌數檢測的檢測 結果顯示該活菌數范圍是5.5億/g，即得到巨大芽抱桿菌T482菌劑。
[0124] 所述步驟（1)中，分離篩選培養基由W下質量的原料制成：Ca(X)3 1.3g，MgS化· 7此0 1.0g，K2HP04l.8g，NaC10.3g，FeS04·7此0 0.003g，NaM04·2出0 0.08g，薦糖7g，瓊 脂19g，蒸饋水1000ml，抑7.2。
[0125] 所述步驟(2)純化、保存的具體方法為:在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的 菌落進行劃線純化，3(TC恒溫培養40小時分離得到巨大芽抱桿菌T482單菌落，將平板上出 現的單菌落保存在試管中，30°C恒溫培養40小時，置于4°C冰箱中保存。
[0126] 所述步驟(3)固體發酵培養中，培養基由W下重量份的原料組成:教皮70份，豆巧 25份，NaCl 3.5份，CaC〇3 2份，MnS〇4·出0 0.03份，MgS〇4*7出0 0.04份，pH 7.2。
[0127] 本實施例的其余內容與實施例1或2相同，運里不再寶述。
[012引實施例5
[0129] 本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述步驟(3)固體發酵培養 中，選取上述巨大芽抱桿菌T482單菌落，用固體培養基進行培養，發酵環境抑為7.3，接種量 1.0%，培養溫度為37°C，培養時間為48小時。
[0130] 所述步驟(4)菌劑制備:將固體發酵培養后的產物烘干后打碎，活菌數檢測的檢測 結果顯示該活菌數范圍是8億/g，即得到巨大芽抱桿菌T482菌劑。
[0131] 所述步驟（1)中，分離篩選培養基由W下質量的原料制成：Ca(X)3 1.4g，MgS化· 7此0 1.2g，K2HP04 2.0g，NaC10.4g，FeS04·7此0 0.005g，NaM04·2出0 0.1g，薦糖10g，瓊 脂20g，蒸饋水1000ml，抑7.3。
[0132] 所述步驟(2)純化、保存的具體方法為:在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的 菌落進行劃線純化，3(TC恒溫培養48小時分離得到巨大芽抱桿菌T482單菌落，將平板上出 現的單菌落保存在試管中，30°C恒溫培養48小時，置于4°C冰箱中保存。
[0133] 所述步驟(3)固體發酵培養中，培養基由W下重量份的原料組成:教皮72份，豆巧 22份，NaCl 4份，CaC〇3 2.5份，MnS〇4·出0 0.04份，MgS〇4.7出0 0.05份，pH 7.3。
[0134] 本實施例的其余內容與實施例1或2相同，運里不再寶述。
[0135] 本發明的巨大芽抱桿菌T482的16S rDNA序列菌種鑒定
[0136] 細菌的個體微小，形態簡單，傳統方法鑒定細菌常根據它們在生理生化上的不同 反應作為分類鑒定的主要依據。20世紀70年代后期W來，國際上通用的"正式的"或"官方 的"細菌分類方法是W《伯杰氏鑒定細菌學手冊》為依據。在生理生化鑒定中，通常會出現一 個或者幾個生理指標不符合該菌種所具有的獨特性質，難W明確對該菌株進行鑒定。目前， 細菌鑒定的方法通常將菌株的生理生化指標與分子生物學特性相結合，得出較為可靠地結 論。其中DNA序列分析的16S rRNA基因進化發育系統已經成為目前國際上細菌多相分類鑒 定常用的技術手段化im et al，2004;Prap et al，1997)。
[0137] 核糖體16S rDNA基因序列全長約1550bp，是由交替的保守區和可變區組成。利用 保守區域設計的通用引物，可W擴增出所有細菌的16S rDNA片段。16S rDNA序列分析技術 的基本原理是從微生物樣本中提取16S rDNA片段，通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得 16S rDNA的序列信息，再與16S rDNA數據庫的序列數據或者其他數據進行比較，確定其在 進化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。利用16S rDNA片段保守區域設 計的通用引物，不會對非細菌的DNA互補，而細菌的16S rDNA可變區的差異可W用來區分不 同的菌。因此通過對某菌株16S rDNA序列測定來獲得最終鑒定證明的做法是被普遍認可 的。
[013引 1、方法：
[0139] (1化0?反應體系（2化1^: lOxPCR BulTcr 2.5.uL dNT'P(2.5mM) 2.0liL 引物巧Ρ(10μΜ> 0卻山
[0140] 引物 1492反 ΠΟμΜ) 0.5.uL DNA 模板 lOOng Taq巧!於11/1止） 化5!止 ddH：0 巧 μL。
[0141] (2化〇?反應條件：95°(：預變性5111111，95°(：變性303,58°(：退火303,72°(：延伸803,35 個循環，72°C延伸lOmin。使用ΑΒΙ 3730x1 DNA分析儀(應用生物系統公司）進行DNA測序。
[0142] 2、測序結果
[0143]
[0144]
[0145] 3、同源性分析
[0146] 鑒定本細菌為Bacillus megaterium，巨大芽抱桿菌。
[0147] 應用例:盆栽試驗
[0148] 對玉米和西紅柿的促生效果
[0149] (1)玉米和西紅柿育苗:將玉米種子和西紅柿種子溫水中浸泡過夜，分別播種于裝 有±壤的塑料杯，自然條件育苗12-14天，選擇長勢均勻的玉米和西紅柿分別移栽到花盆 中。
[0150] (2) ±壤預處理:±壤風干后，過1mm篩。每個處理設置3個重復。每個花盆分別裝有 ±壤4.01^，尿素407111肖、過憐酸巧162111肖和硫酸鐘418111邑。
[0151] (3)試驗設置:選用具有自生固氮及促進作物生長功能的T482微生物菌劑進行盆 栽效果對比試驗，向每盆栽有玉米或西紅柿的花盆中添加菌劑Ig。設置膨潤±添加為對照 實驗，每盆添加膨潤± 1 g。每天誘水適量，每盆的水量要相同、播灑均勻，不要使水流出盆底 W免肥料損失而產生誤差。
[0152] (4)試驗結果
[0153] 在移苗第64天后，測定玉米和西紅柿株高、葉片數及其單株鮮重，可W得出接種 T482巨大芽抱桿菌菌劑可W明顯促進玉米和西紅柿生長，結果見表2-3，圖6-7所示。
[0154] 表2 T482微生物菌劑玉米盆栽效果對比試驗
[0155]
[0158]最后應當說明的是，W上實施例僅用W說明本發明的技術方案，而非對本發明保~ 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細地說明，本領域的普通技術人員應 當理解，可W對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實 質和范圍。
【主權項】
1. 一種巨大芽孢桿菌T482,其特征在于:所述巨大芽孢桿菌T482保藏于中國典型培養 物保藏中心，保藏號為CCTCCM 2015754。2. 根據權利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌T482,其特征在于:所述巨大芽孢桿菌T482 具有序列表NO. 1的DNA序列。3. 根據權利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌T482,其特征在于:所述巨大芽孢桿菌T482 的固氮酶活性為1000~1200 nmol/(mL · h)，其在生長代謝過程中吲哚乙酸的分泌量為200 ~300 mg/L。4. 權利要求1-3任意一項所述的一種巨大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法，其特征在于： 包括以下步驟： (1) 分離、篩選 選取含有巨大芽孢桿菌T482的固氮菌菌落的土樣，經分離篩選培養基培養得到固氮菌 菌落； (2) 純化、保存 在培養基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行純化，培養分離得到巨大芽孢桿菌 T482單菌落，保存該單菌落備用； (3) 固體發酵培養 選取上述巨大芽孢桿菌T482單菌落，用固體培養基進行培養，發酵環境pH為7.1-7.4， 接種量0.5-1.0%，培養溫度為30-37°C，培養時間為48-60小時； (4) 菌劑制備 將固體發酵培養后的產物烘干后打碎，活菌數檢測的檢測結果顯示該活菌數范圍是3-8億/g，即得到巨大芽孢桿菌T482菌劑。5. 根據權利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(2)純化、保存的具體方法為:在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的菌落進行劃線純 化，30°C恒溫培養36-48小時分離得到巨大芽孢桿菌T482單菌落，將平板上出現的單菌落保 存在試管中，30 °C恒溫培養36-48小時，置于4 °C冰箱中保存。6. 根據權利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(3)固體發酵培養中，培養基由以下重量份的原料組成:麩皮65-72份，豆柏22-28份，NaCl 3-4份，CaC03 1.5-2.5份，MnS〇4*H20 0.01-0.04份，MgS〇4*7H20 0.01-0.05份，培養基的pH 為7.1-7.4。7. 根據權利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(1)分離、篩選的具體方法為:選取土樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩，靜置，取上清液離 心，棄上清液，保留沉淀物;加入含吐溫80的無菌水懸浮，離心，去沉淀，將上清液離心，棄上 清液，保留沉淀物;將沉淀物用磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液;取上述樣品液與磷酸緩沖液 懸浮混合，得到稀釋菌懸液;將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂布于無氮培養 基，培養獲得固氮菌菌落。8. 根據權利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟（1)中，分離篩選培養基由以下質量的原料制成< &(：031.0-1.48，1^304.7!120 0.6-1.2g，K2HP〇4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeS〇4· 7H20 0.001-0.005g，NaM〇4· 2H20 0· 05-〇.1&，蔗糖5-1(^，瓊脂18-2(^，蒸餾水100〇1111，培養基?!1為7.1-7.4。9. 根據權利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(2)和步驟(3)之間還包括有以下步驟： (51) 革蘭氏染色:將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌； (52) 芽孢染色:將陽性菌進行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽性菌單菌落。10. -種巨大芽孢桿菌T482的菌劑，其特征在于：由權利要求4-9任一項所述的一種巨 大芽孢桿菌T482的菌劑制備方法制備而成。
【文檔編號】C12N1/20GK106011003SQ201610345379
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】王亞君, 楊國平, 林敏 , 孫旭生, 楊盼盼, 尹坤, 張學賢, 沈世華, 陳三鳳, 譚志遠, 燕永亮
【申請人】東莞市保得生物工程有限公司