專利名稱：一種微生物飼料添加劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于飼料添加劑領域，特別涉及含有多種活菌制劑的高效微生物飼料添加劑產品及其生產方法和應用。
背景技術：
目前我國奶牛存欄數約1000多萬頭，奶產量900多萬噸，奶牛養殖業的迅速發展也促進和推動了我國飼料及添加劑行業的發展；但我國奶牛飼料仍停留在三大料 (即玉米、麩皮、餅粕)的簡單混合上，造成配方中蛋白質飼料單一、氨基酸搭配不當，奶的產量和質量與歐美國家相比都有很大差距。研究開發高效生物活性飼料添加劑，對于提高我國奶牛生產的水平，改善牛奶的質量，減少奶牛胃腸疾病和乳房炎的發病率，降低糞尿的不良氣味和糞尿氮的排除量，減少環境污染和充分提高飼料資源的有效利用(即提高廉價粗飼料的利用率，提高飼料中營養物質的利用率等)具有重要的實際應用價值。目場上流行的活菌制劑大多都是單一菌，而且主要應用在單胃動物飼料中，由于反芻動物(如奶牛) 的產品目前只有美國和法國的2-3家的單一菌種制劑在我國宣傳和做養殖推廣實驗。枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌都是可以應用于飼料添加劑行業的益生菌，益生菌代謝產生的各種酶制劑及其有益代謝成分在促進消化、穩定腸道菌群環境、提高飼料利用率方面具有較好的效果；泡盛曲霉可以代謝產生包括葡聚糖酶在內的多種酶制劑，其培養物作為飼料添加劑可以有效提高飼料的消化吸收效果。研制開發具有科學配比，且效果明顯的的含有多種有益微生物且酶活力強的復合飼料添加劑對于促進養殖業，特別是奶牛養殖業具有非常重要的意義。
發明內容
本發明解決的技術問題是提供一種高效生物活性飼料添加劑產品，本發明解決的另一技術問題是提供高效生物活性飼料添加劑產品生產方法及其應用。微生物飼料添加劑組成為黑曲霉孢子濃度1.0 9. OX IO8個/克、綠色木霉孢子濃度1.0 9.0父108個/ 克、枯草芽孢桿菌為1. 0 9. 0X IO8個/克、釀酒酵母1. 0 8. 5X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌1.3 8. 5X IO8個/克。本發明產品的具體生產方法步驟如下1.微生物菌劑的培養制備分別培并干燥得到黑曲霉孢子、綠色木霉孢子、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和鼠李糖乳桿菌。(1)黑曲霉孢子制備斜面孢子懸浮液液接種到10° Brix麥芽汁固態培養基上， 30°C培養2天半至長滿孢子，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。(2)綠色木霉孢子制備斜面孢子懸浮液液接種到10° Brix麥芽汁固態培養基上，30°C培養2天半至長滿孢子，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。(3)枯草芽孢桿菌的制備斜面菌株經活化后，接入液體種子培養基，在37°C、 180rpm的搖床培養24h后接種至發酵罐中，在37°C、通風比1 1 (ν/ν)，400rpm培養2天至對數后期。發酵結束后，加入助濾劑輕質碳酸鈣，經板框過濾，流化床干燥。(4)釀酒酵母的制備斜面菌種接入三角瓶，培養至對數期后轉接入發酵罐中，控制溫度為觀°0，通風比為1 1.5 (ν/ν)，培養20小時左右至對數期。發酵結束后，加入助濾劑輕質碳酸鈣，經板框過濾，流化床干燥。(5)鼠李糖乳桿菌的制備斜面菌種接入三角瓶，培養至對數期后轉接入發酵罐中，控制溫度為45°C，通風比為1 0.1 (ν/ν)，培養18小時左右至對數期。發酵完畢經板框過濾分離獲得濕菌體，加入組成為10%脫脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保護劑，通過冷凍干燥獲得菌劑，水分含量低于10%。2、菌劑復配將上述各種菌按照比例進行復配，菌劑復配比例如下黑曲霉孢子 15-25份、綠色木霉孢子10-25份、枯草芽孢桿菌10-25份、釀酒酵母15-25份和鼠李糖乳桿菌25-40份。本發明采用的菌種如下黑曲霉(Aspergillusniger)CGMC No. 3. 5269、綠色木霉(Trichoderma viride) CGMCC No. 3. 2942、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC No. 1. 210、釀酒酵母 (Saccharomyces cervisiac) CGMCC No. 4429、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) CGMCC No. 4430。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC No. 44 菌種同專利申請名稱為一株耐高滲酵母菌的應用中保藏菌種，專利申請號201110105966，
公開日為2011.09. 14。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430 菌株特點如下在顯微鏡下觀察，該菌株為桿狀，寬度小于1 μ m，2到3個桿菌易于連成連接在一起；在固體培養基上，該菌菌落為乳白色，表面光滑，濕潤，粘稠，邊緣較整齊。與原始菌相比，該誘變菌株在形態上明顯小于出發菌株。出發菌株鼠李糖乳桿菌CGMCCNo. 1.2134購于中國微生物菌種保藏理委員會普通微生物中心。本發明鼠李糖乳桿菌采用下述流程進行選育原始出發菌種一試管活化一高溫馴化一硫酸二乙酯(DEQ誘變一高糖平板篩選一亞硝基胍(NTG)誘變篩選一高溫菌篩選一搖瓶復篩一傳代穩定性實驗一5L發酵罐試驗。將目的菌株CGMCC No. 4430做5L乳酸發酵罐實驗，結果表明與出發菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受濃度可以達到270g/L，與原始菌相比提高了 95% ；發酵結束后，乳酸含量為60g/L，與原始菌相比提高了 158%。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。本發明中黑曲霉孢子、綠色木霉孢子采用血球板計數法，其它菌種采用微生物平板計數方法檢測活菌數。本發明中菌劑復配的較優比例為黑曲霉孢子15-20份、綠色木霉孢子10-20份、 枯草芽孢桿菌10-20份、釀酒酵母15-20份和鼠李糖乳桿菌25-35份。發明產品采用科學研究的菌劑復配比例技術有效確保產品中各種微生物菌劑的合理組成和比例，使得產品中微生物產生的酶在奶牛飼喂中可以有效促進飼料的消化吸收；復配技術使得產品在奶牛飼料的消化吸收率大幅提高，單位用量飼料的產出比例比對照有了顯著提高，奶牛的產量和質量得以提高和保障。發明產品的性能穩定，使用安全，與其它飼料添加劑均無配合禁忌。本發明產品在質量穩定可控，無環境污染，面目可以提免疫力能夠提高養殖效益。產品完全符合綠色飼料
4添加劑的要求。有明顯提高目增重和飼料轉化率效果。本發明產品中鼠李糖乳桿菌和釀酒酵母對動物胃腸道的消化有輔助作用，釀酒酵母在瘤胃中為瘤胃微生物的生長繁殖提供了有益的氨在酸、B族維生素和其它微量元素，增加瘤胃微生物蛋質的合成量。鼠李糖乳桿菌在奶牛的小腸釋放，可以消耗動物腸道內的氧氣，使腸道內有害的致病菌如好氧菌(主要是大腸桿菌、沙門氏菌等)受到抑制，還能抑制氨和胺的合成，益增強免疫力，達到改善奶牛胃腸道微生物生態平衡，有利于健康和提高生產性能的目的；枯草芽孢桿菌在腸道代謝產生的酶類和黑曲霉、綠色木霉發酵培養物中含有的有效劑量的纖維素酶、葡聚糖酶、木質素分解酶和淀粉酶有利于奶牛等反芻動物飼料中纖維類飼料的消化吸收，改善反芻動物腸道的微生態平衡，提高飼料利用率，提高奶牛產奶量，提高牛奶的品質，提高奶牛肌體免疫力，減少腸道疾病，凈化飼養環境。該飼料添加劑可應用于奶牛養殖業，可以顯著提高牛奶產量和質量。本發明產品能夠提高奶牛肌體免疫力，減少隱性乳房炎、腸道疾病的發病率。目前，我國奶牛群中隱性乳房炎發病率是比較高的，奶牛一旦患有乳房炎就必須注射抗生素治療，注射了抗生素的奶牛7天之內所產出的牛奶都不能出售(牛奶中會殘留抗生素對人體有危害)。使用本發明產品可以降低奶牛隱性乳房炎發病率，飼喂試驗表明本發明產品降低乳房炎發病率70% (與對照組比較)，明顯減少奶牛乳房炎的發生，減少抗生素的使用和含抗生素奶的產出，間接提高了養殖者的效益。本發明產品對提高我國奶牛生產的水平，充分提高飼料資源的有效利用(即提高廉價相飼料的利用率，提高飼料中營養物質的利用率等)等方面都具有很高的價值。本發明也適合其他反芻動物如肉牛、羊的飼喂。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1 高效活性飼料添加劑產品產品組成如下黑曲霉孢子濃度1. 0 3. OX IO8個/克、綠色木霉孢子濃度1. 0 3. 0 X IO8個/克、枯草芽孢桿菌為1. 0 3. 0 X IO8個/克、釀酒酵母1. 0 3. 5 X IO8個/ 克、鼠李糖乳桿菌1. 3 4. 5X IO8個/克。菌劑復配將上述各種菌劑按照如下比例進行復配黑曲霉15份、綠色本霉孢子15份、枯草芽孢桿菌15份、釀酒酵母25份、鼠李糖乳桿菌30份。實施例2 高效活性飼料添加劑產品產品組成如下黑曲霉孢子濃度5X IO8個/克、綠色木霉孢子濃度5. OX IO8個/ 克、枯草芽孢桿菌為5X IO8個/克、釀酒酵母6X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌6X IO8個/克。菌劑復配將上述各種菌劑按照如下比例進行復配黑曲霉20價、綠色木霉孢子10份、枯草芽孢桿菌20份、釀酒酵母18份、鼠李糖乳桿菌32份。實施例3 例1和2中所述高效活性飼料添加劑產品生產方法產品生產方法主要包括微生物菌劑的生產和復配工藝。
微生物菌劑的生產黑曲霉和綠色木霉孢子的制備方法1.斜面培養方法 斜面培養基IOmL加入試管，121°C，20min滅菌后，擺斜面，冷卻，接種。30°C培養到黑色孢子鋪滿斜面。2. K式培養瓶孢子取10° Brix麥芽汁加入2%瓊脂，裝入500mL K式培養瓶，12rC，20min滅菌后， 鋪斜面冷卻。接入孢子懸浮液lmL，保證懸浮液接種于整個培養基表面；側放入恒溫箱， 30°C培養到黑色孢子鋪滿斜面。3.固態放大培養將K式瓶孢子制成孢子懸浮液，孢子濃度大于1. OX IO8個/mL。取200kg固態培養基(麩皮140kg、10° Brix麥芽汁60L)，充分混勻后放入淺盤，在121°C下滅菌1小時。 待放涼后，接入孢子懸浮液，攪拌均勻。培養溫度控制在30°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養時間3天；待培養料長滿孢子即可結束培養干燥粉碎發酵結束后，將淺盤放在流化床干燥，干燥溫度控制在60°C，待物料水分含量將低于10%以下時，用粉碎機將固體培養料進行粉硫，物料粉碎孔徑在100目以上。枯草芽孢桿菌的制備方法培養基組成(g/L)葡萄糖60，酵母提取物20，磷酸氫二鉀0. 5，七水硫酸鎂0. 5， ρΗ6· 8。(1) 一級種子培養500mL搖瓶裝液量為lOOmL，滅菌后接入一環枯草芽孢桿菌，在搖床上，180轉/分，培養溫度37°C，培養時間M小時至對數期；(2) 二級種子培養將一級種子按照10% (ν/ν)的接種量接入30L的種子罐中，裝液量21L，培養溫度37°C，攪拌速度200轉/分，通風量(V/V)l 0. 5，罐壓0. 05Mpa，培養時間M小時至對數期。(3)發酵罐培養將種子罐中的種子以10% (ν/ν)接種量接入300L發酵罐，裝液量210L,培養溫度370C，攪拌速度200轉分，通風量(V/V) 1 0. 5.罐壓0. 05Mpa,培養時間 24小時，培養結束菌濃度在5. OX IO9個/mL。(4)離心分離采用板框過濾分離獲得菌體。(7)真空冷凍干燥添加保護劑后采用噴霧干燥工藝處理獲得干粉菌劑；保護劑組成為脫脂奶10<%、乳糖5%、甘油5(%。釀酒酵母菌的制備方法從斜面轉接酵母菌到液體搖瓶，液體搖瓶經三級擴培后轉接入發酵罐進行擴大培養，培養完畢低溫濃縮、載體混合，流體床干燥工藝獲得活性酵母菌劑。酵母細胞的培養采用斜面菌種逐級擴培獲得酵母細胞；(1) 一級種子培養將酵母斜面菌種接入500mL搖瓶中，培養基裝量lOOmL，旋轉式搖床120轉分，培養溫度30°C，培養時間18小時；(2) 二級種子培養將一級種子按照10%的接種量接入500mL 二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；(3)三級種子培養將二級種子以10%接種量接入5000mL三級種子搖瓶中，培養基裝量IOOOmL,旋轉式搖床100轉分，培養溫度30°C，培養時間18小時；(4) 一級種子罐培養將三級種子以5%接種量接入總容積為150L的一級種子罐， 發酵培養基裝量100L，培養溫度30°C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V)l 0.5，罐壓 0. 05Mpa，培養時間16小時；(5)發酵罐培養將一級種子罐菌種以5%接種量(ν/ν)接入總容積為3噸二級種子罐，發酵培養基裝量2噸，培養條件培養溫度30°C，攪拌速度100轉/分，前期通風量(V/ V )1 05，罐壓0.05Mpa，前期培養時間12小時；后期罐壓0.05Mpa，攪拌速度50轉分，培養時間8小時，培養末期的酵母濃度達到3. OX IO9個/mL。(6)濃縮發酵液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到酵母菌濃縮液。(7)添加載體向酵母菌濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0. 5-0. 7 1，載體組成為=CaCO3 40份，糊精20份，玉米蛋白粉20份。( 干燥流化床干燥，干燥溫度50°C。培養基采用10%麥芽汁培養基或采用添加硫酸銨等無機鹽的糖蜜培養基，具體培養生產工藝參見肖冬光《釀酒活性干酵母的生產與應用技術》。鼠李糖乳桿菌菌劑的制備斜面菌種接入三角瓶，培養至對數期后轉接入發酵罐中，控制溫度為45°C，通風比為1 0.1 (ν/ν)，培養18小時左右至對數期。發酵完畢經板框過濾分離獲得濕菌體，加入組成為10%脫脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保護劑，通過冷凍干燥獲得菌劑，水分含量低于 10%。產品效果實驗試驗牛的選擇與試驗設計試驗于2010年9月7日-10月7日在寧夏吳忠市金積牛場進行，本實驗采取隨機配對原則，將40頭牛隨機的分為試驗組和對照組，每組20頭牛， 在日糧中按每頭每日添加產品40g，飼喂60天，結果表明實驗組日增重972. 7g，對照組日增重746. 8g，差異極顯著(P <0.01)。飼喂5天后，其糞便干物質和飼喂前相比，減少30%。使用高效生物活性飼料添加劑1個月后，發現牛奶產量比較穩定，(不喂的組下降幅度較大，因為試驗牛已過了泌乳高峰期)，乳脂率也增加了，效果很好。從奶牛外表來看， 喂高效生物活性飼料添加劑的奶牛的毛亮，食欲好，乳房炎發病率降低。
權利要求
1.一種微生物飼料添加劑，其特征在于產品中黑曲霉孢子濃度1. 0 9. 0 X IO8個/克、 綠色木霉孢子濃度1. 0 9. OX IO8個/克、枯草芽孢桿菌為1. 0 9. OX IO8個/克、釀酒酵母1. 0 8. 5X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌1. 3 8. 5X IO8個/克。
2.根據權利要求1所述的生物活性飼料添加劑產品，其特征在于所述黑曲霉孢子濃度 1. 0 3. 0 X IO8個/克、綠色木霉孢子濃度1. 0 3. 0 X IO8個/克、枯草芽孢桿菌為1. 0 3. OX IO8個/克、釀酒酵母1. 0 3. 5X IO8個克、鼠李糖乳桿菌1. 3 4. 5X IO8個/克。
3.根據權利要求1所述的生物活飼料添加劑產品，其特征在于所述黑曲霉孢子濃度 5 X IO8個/克、綠色木霉孢子濃度5. 0 X IO8個克、枯草芽孢桿菌為5 X IO8個/克、釀酒酵母 6X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌6X IO8個/克。
4.根據權利要求1-3所述的生物活性飼料添加劑產品，其特征在于所述黑曲霉孢子、 綠色木霉孢子、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌復配比例為黑曲霉孢子15-25份、 綠色木霉孢子10-25份、枯草芽孢桿菌10-25份、釀酒酵母15-25份和鼠李糖乳桿菌25-40 份。
5.根據權利要求1-4所述的生物活性飼料添加劑產品，其特征在于所述黑曲霉孢子、 綠色木霉孢子、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌復配比例為黑曲霉孢子15-20份、 綠色木霉孢子10-20份、枯草芽孢桿菌10-20份、釀酒酵母15-20份和鼠李糖乳桿菌25-35 份。
6.根據權利要求1-5所述的生物活性飼料添加劑產品，其特征在于所述黑曲霉孢子、 綠色木霉孢子、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌復配比例為黑曲霉15份、綠色木霉孢子15份、枯草芽孢桿菌15份、釀酒酵母25份、鼠李糖乳桿菌30份。
7.根據權利要求1-6所述的生物活性飼料添加劑產品，其特征在于所述微生物菌劑中黑曲霉為CGMCC No. 3. 5269、枯草芽孢桿菌CGMCC No. 1. 210、綠色木霉CGMCC No. 3. 2942, 釀酒酵母為CGMCC No. 4429、鼠李糖乳桿菌為CGMCC No. 4430。
全文摘要
本發明公開了一種微生物飼料添加劑，屬于飼料添加劑領域，解決了含有多種活菌制劑的高效微生物飼料添加劑產品及其生產方法和應用的技術問題。涉及微生物飼料添加劑組成為黑曲霉孢子濃度10～9.0×108個克、綠色木霉孢子濃度1.0～9.0×108個/克、枯草芽孢桿菌為1.0～9.0×108個/克、釀酒酵母1.0～8.5×108個/克、鼠李糖乳桿菌1.3～8.5×108個/克。本飼料含有多種有益微生物目酶活力強，經實驗驗證本飼料對于奶牛產奶量及牛奶成分均有顯著提高作用。
文檔編號A23K1/16GK102488113SQ20111041995
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者張健飛, 李政, 李績, 王玉 申請人:天津工業大學