專利名稱：富硒土鱉蟲飼養方法、凍干粉膠囊、蛋白質水解液及藥用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種富硒土鱉蟲飼養方法、凍干粉膠囊、蛋白質水解液及藥用。
背景技術：
作為傳統中藥的土鱉蟲又名地鱉蟲、土元、地烏龜、螗蟲，為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體。其性寒，味苦，有小毒，歸肝經，又破淤血，續筋骨之功效，主要用于筋骨折傷，淤血經閉，癥瘕痞塊。研究表明土鱉蟲具有許多藥理活性，如抗凝血、抗血栓作用，促纖溶作用，抗肝纖維化作用，抗腫瘤作用，紅細胞免疫作用和保護血管內皮作用等。土鱉蟲在醫藥、保健及健康食品等方面具有許多獨特的功能，正越來越受到國內外專業人士和消費者的關注。土鱉蟲含有氨基酸、蛋白質、生物堿、脂肪酸、酚類、糖類、留體及多種微量元素等。其中氨基酸為土鱉蟲的主要成分，總量約占土鱉蟲的40%，在17種游離及水解氨基酸中，有7種是人體必需氨基酸。有實驗研究證明土鱉蟲蛋白提取物對S180肉瘤荷瘤小鼠有顯著的抑制作用，純化得到的活性蛋白對雞胚尿囊膜新生血管的生成有明顯的抑制作用，且對雞胚生長發育的影響較小，這說明土鱉蟲蛋白提取物有良好的體內抑制腫瘤作用及血管生成抑制活性。通過噻唑藍(MTT)法和流式細胞術檢測土鱉蟲纖溶活性蛋白對2種腫瘤細胞(人食管癌細胞株Ecal09和人宮頸癌細胞株HeLa)的增殖抑制及周期的影響，結果發現土鱉蟲纖溶活性蛋白對腫瘤細胞的增殖抑制率與劑量和時間密切相關，隨著土鱉蟲纖溶活性蛋白濃度的增加，Gl期細胞數量明顯減少，G2/M期的細胞數量有所增加，說明土鱉蟲纖溶活性蛋白具有體外抑制腫瘤細胞的作用。為了進一步開發土鱉蟲作為藥物的應用，人們進行了長期的探索，提出了各種各樣的方案。例如，中國專利文獻公開了一種從中藥土鱉蟲中分離、提取抗腫瘤的有效部位脂肪酸的方法[申請號200510040664. I]，該方案采用將土鱉蟲經有機溶劑提取得粗脂肪酸，再經柱層析法分離得有效部位脂肪酸，主要包括7-十八碳烯酸、十六烷酸、9-十六碳烯酸、十八酸。上述方案能夠提取到土鱉蟲中真正具有抗腫瘤作用和療效的脂肪酸成分，并經實驗證實單味中藥土鱉蟲有機溶劑提物具有廣譜殺瘤作用，可用于治療多種惡性腫瘤。解決了過去無法確定土鱉蟲中哪一具體成分具有抗腫瘤功效以及無法提取有效部位的缺陷。 還有人發明了一種土鱉蟲的仿生酶解產物及其用途[申請號200810118148.X]，其技術方案是采用仿生酶解的方法，取土鱉蟲，加水勻漿后，在適當的條件下，先以胃蛋白酶保溫酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保溫酶解，所得的酶解物按不同的制劑要求制成制劑。該方案的產物在治療心腦血管疾病及跌打損傷等方面具有良好效果。上述方案雖然在一定程度上改善了土鱉蟲作為藥物的應用，提升了土鱉蟲的藥用價值，但是所采用的土鱉蟲均為人工普通養殖或野生土鱉蟲，土鱉蟲藥材的營養價值、微量元素含量、有害重金屬含量等方面存在著技術瓶頸。
發明內容
本發明的目的是針對上述問題，提供一種易于實施，成本較低，能夠獲得高品質的富硒土鱉蟲的飼養方法。本發明的另一目的是提供一種富硒土鱉蟲凍干粉膠囊。本發明的還有一目的是提供一種富硒土鱉蟲蛋白質水解液。本發明的再有一目的是提供一種富硒土鱉蟲作為抗腫瘤藥物的應用或者作為抗氧化藥物的應用。為達到上述目的，本發明采用了下列技術方案本富硒土鱉蟲飼養方法，其特征在于，本飼養方法包括下述內容A、飼養場地建設建立多層飼養槽,每層間隔45cm-55cm,相鄰的兩飼養槽之間間隔80cm-120cm，在飼養槽內壁進行粉刷，并在飼養槽內壁上緣周邊設置防止土鱉蟲逃逸的阻擋體，在飼養槽底部鋪設10cm-15cm飼養土 ；B、飼養土配制取土后用3mm-5_的篩子過篩，然后摻入草木灰混合均勻后形成飼養土，飼養土的濕度為含水量55% -65% ；C、飼料配制飼料包括下述重量份數的成分干的青飼料28-32wt%、豆餅 28-32wt %、富硒酵母O. 8-1. 2wt %、蝦粉4_6wt %，麥麩32_36wt %，然后加入占上述所有成分總重量10-20%的水，并混合均勻；D、放養及放養密度以每一次蛻皮按齡計算，選用9-11齡的雌性土鱉蟲在飼養場地進行養殖，放養密度為每平方米I. 5 2萬只，每天傍晚5 6時或2 3天投喂上述飼料，每次飼料投放量為土鱉蟲總重量的8-12% ；E、病蟲害預防①在飼養前，將備好的飼養土先經陽光曝曬消毒；將曝曬消毒好的飼養土在未放入飼養槽之前，用消毒液勻噴灑飼養土，經I周后將飼養土放進飼養槽飼養土鱉蟲；飼養期間每隔20 30天更換I次飼養土，長期保持飼養土清潔無霉敗；②嚴格控制飼料不帶螨類入池，飼料先用微火炒熟殺滅螨類；③注意飼養槽清潔衛生，及時除去壞死卵鞘和死蟲，喂料不過量。在上述的富硒土鱉蟲飼養方法中，所述的富硒酵母為啤酒酵母；所述的阻擋體由玻璃制成；所述的飼料還包括磷酸氫鈣、大麥、油下腳料、魚粉、玉米、米糠和南瓜和青飼料中的任意一種或多種。這里的青飼料通常為蔬菜等綠葉植物。在上述的富硒土鱉蟲飼養方法中，本飼養方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一種或多種的組合①將飼養槽的剩余飼料連同飼養土表層刮出I. 5 3. Ocm, 清除初發生的螨類用炒熟的糠麩、豆粉誘餌在白天誘除螨類；傍晚取出誘餌滅殺處理； ③在螨類成災時，徹底更換全部飼養土；先將土鱉蟲從飼養土中篩出，移入裝有干燥細沙容器中，讓土鱉蟲在沙中爬行至少半小時,摩擦掉寄生在土鱉蟲體上的螨類，同時燒烤飼養槽，燒死飼養槽內殘留螨后，再換入經檢查無螨的飼養土飼養；④藥劑噴治先將飼養槽土鱉蟲從飼養土中篩出，取30%三氯殺螨砜用I : 400倍稀釋液拌入飼養槽內飼養土，每立方米飼養土用藥45-55g。在上述的富硒土鱉蟲飼養方法中，所述的消毒液由下述方式制得取生石灰 O. 5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分鐘，過濾后即得消毒液。
在上述的富硒土鱉蟲飼養方法中，本飼養方法養殖而成的土鱉蟲經干燥成藥材后包括下述成分粗蛋白含量65-68wt%、Se含量6-80. 5058 μ g/g'Zn含量320-360 μ g/g' 不飽和脂肪酸含量占總脂肪油的73-75wt%、油酸含量占總脂肪油的40-42wt%、亞油酸含量占總脂肪油的21-23wt%。上述富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲制得的富硒土鱉蟲凍干粉膠囊。本凍干粉膠囊通過下述方式制得本凍干粉膠囊通過下述方式制得取富硒土鱉蟲藥材，粉碎并過75-85目篩，冷凍干燥，低溫間歇滅菌后，得土鱉蟲凍干粉粉末，然后按凍干粉乳糖為75 85 25 15的比例混勻后，直接裝膠囊，即得。上述富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲制得的富硒土鱉蟲蛋白質水解液。本富硒土鱉蟲蛋白質水解液通過下述方式制得①取凈制的富硒土鱉蟲碾碎，用石油醚在70°C脫脂4h，其中土鱉蟲和石油醚的重量比為I : 3，得到經過預處理的土鱉蟲備用；②稱取經過預處理的土鱉蟲，加入緩沖液，固液比為I : 7，pH為5，冷浸過夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶與土鱉蟲比250U71，在60°C水浴中加熱酶解一小時后，滅酶、抽濾、精密吸取濾液，將濾液置于容器中，即得富硒土鱉蟲蛋白質水解液。富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲作為抗腫瘤藥物的應用或者作為抗氧化藥物的應用。與現有的技術相比，本富硒土鱉蟲飼養方法、凍干粉、蛋白質水解液及藥用的優點在于易于實施，培養所得的土鱉蟲富含人體所需的有益成分，特別是富含硒和鋅，藥用價值高，用于保護臟器少受自由基的傷害，可預防由衰老引起的多種慢性疾病等癥；通過增強機體免疫力，提高抗腫瘤功效。
具體實施例方式一、本富硒土鱉蟲飼養方法包括下述內容A、飼養場地建設建立多層飼養槽,每層間隔45cm-55cm,相鄰的兩飼養槽之間間隔80cm-120cm，在飼養槽內壁進行粉刷，并在飼養槽內壁上緣周邊設置防止土鱉蟲逃逸的阻擋體，在飼養槽底部鋪設10cm-15cm飼養土 ；B、飼養土配制取土后用3mm-5_的篩子過篩，然后摻入草木灰混合均勻后形成飼養土，飼養土的濕度為含水量55% -65% ；C、飼料配制飼料包括下述重量份數的成分干的青飼料28-32wt%、豆餅 28-32wt %、富硒酵母O. 8-1. 2wt %、蝦粉4_6wt %，麥麩32_36wt %，然后加入占上述所有成分總重量10-20%的水，并混合均勻；D、放養及放養密度以每一次蛻皮按齡計算，選用9-11齡的雌性土鱉蟲在飼養場地進行養殖，放養密度為每平方米I. 5 2萬只，每天傍晚5 6時或2 3天投喂上述飼料，每次飼料投放量為土鱉蟲總重量的8-12% ；E、病蟲害預防①在飼養前，將備好的飼養土先經陽光曝曬消毒；將曝曬消毒好的飼養土在未放入飼養槽之前，用消毒液勻噴灑飼養土，經I周后將飼養土放進飼養槽飼養土鱉蟲；飼養期間每隔20 30天更換I次飼養土，長期保持飼養土清潔無霉敗；
②嚴格控制飼料不帶螨類入池，飼料先用微火炒熟殺滅螨類；③注意飼養槽清潔衛生，及時除去壞死卵鞘和死蟲，喂料不過量。這里的富硒酵母為啤酒酵母；阻擋體由玻璃制成；飼料還包括磷酸氫鈣、大麥、油下腳料、魚粉、玉米、米糠和南瓜和青飼料中的任意一種或多種。本飼養方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一種或多種的組合① 將飼養槽的剩余飼料連同飼養土表層刮出I. 5 3. 0cm，清除初發生的螨類；②用炒熟的糠麩、豆粉誘餌在白天誘除螨類；傍晚取出誘餌滅殺處理在螨類成災時，徹底更換全部飼養土；先將土鱉蟲從飼養土中篩出，移入裝有干燥細沙容器中，讓土鱉蟲在沙中爬行至少半小時,摩擦掉寄生在土鱉蟲體上的螨類，同時燒烤飼養槽,燒死飼養槽內殘留螨后,再換入經檢查無螨的飼養土飼養；④藥劑噴治先將飼養槽土鱉蟲從飼養土中篩出，取30%三氯殺螨砜用I : 400倍稀釋液拌入飼養槽內飼養土,每立方米飼養土用藥45-55g。本實施例中的消毒液由下述方式制得取生石灰O. 5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70 分鐘，過濾后既得消毒液。通過本飼養方法養殖而成的土鱉蟲經干燥成藥材后包括下述成分粗蛋白含量 65-68wt%、Se含量6-80. 5058 μ g/g'Zn含量320-360 μ g/g—1、不飽和脂肪酸含量占總脂肪油的73-75wt%、油酸含量占總脂肪油的40-42wt%、亞油酸含量占總脂肪油的21_23wt%。具體實施例如下直接取土，用4_的篩子過篩，摻上適當草木灰即可。土的干濕度都要求含水量在60%左右(“手捏成團，輕按即散”)。飼養土厚度10-15cm，每隔1-2周可用細篩將飼養土過篩一遍，去掉食物殘渣消毒后即可再次使用。根據土鱉蟲生長過程中能量消耗需求，確定基礎飼料配方(每IOOg干飼料為單位)干的青飼料(蔬菜葉)30g、豆餅30g、富硒酵母lg、奸粉5g、麥麩34g。加水10-20ml,拌勻,用手抓成團,松手即散為適宜。 制成塊狀食料。每kg飼料含硒量20mg，碳氮比均衡在48 50 (產卵期提高到55)，以促進土鱉蟲的生長發育。土鱉蟲習性晝伏夜出。每天18 24時為活動、吃食高峰期。一次吃食后2 3天潛伏在土中不動，人工飼養需每天傍晚5 6時或2 3天投喂飼料。喂食方法分為三種①把飼料團成小團，分點喂食(適用于幼蟲)。②把飼料撒在飼養土表面(適用于中蟲)。③用15X 15cm的塑料薄膜做成食臺，飼料放在食臺上(適用于成蟲)。根據實際需要，選擇喂食方法。與普通飼養方法相比，本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材的水分含量、總灰分、酸不溶性灰分、水浸出物含量沒有很大差異，符合《中國藥典》中土鱉蟲質量檢查項規定，但兩者在粗蛋白含量有所差異。普通飼養方法獲得的土鱉蟲藥材粗蛋白含量約為61. 69%，而本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材的粗蛋白含量為67. 19%，可見本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材營養價值略高于普通飼養方法獲得的土鱉蟲藥材。元素的測定結果看，兩者均含有豐富的微量元素且存在明顯的差異。其中Fe、Zn、Mn、Cu、Mg為兩者主要的微量元素。這些元素對人體有直接的影響作用，并參與許多新陳代謝的過程。此外，兩者尚含有Pb、As、Hg 等重金屬元素。參照藥用植物及制劑外經貿綠色行業標準(WM/T2-2004)，有害重金屬Pb、 As、Hg的含量符合標準。更為重要的是本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材中尚含有較高的Zn、Cu、Se等元素。Zn對生物體內的免疫功能起調節作用，并能通過酶系統發揮對機體代謝的調節和控制，硒具有延緩衰老、抑癌抗癌、抗輻射等作用。腫瘤病人血清銅/鋅比值升高，血清銅、硒含量顯著下降，腫瘤患者免疫功能下降與缺鋅有關，補鋅可調節腫瘤患者免疫功能，本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材Zn、Se等微量元素含量明顯升高，可能與其抑制肝癌、胃癌等癌細胞的功能有一定的相關性。經本發明人試驗分析普通飼養土鱉蟲藥材飽和脂肪酸占25 %，不飽和脂肪酸占72. 11 %;本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材飽和脂肪酸占23. 37%，不飽和脂肪酸占74. 19%，本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材不飽和脂肪酸的含量高于普通飼養土鱉蟲藥材。不飽和脂肪酸對人體有降血壓、降血脂、抗血栓、抗動脈硬化、預防心血管病、增強記憶力、預防老年癡呆、防癌等多種功效。表1-1 :本實施例中普通飼養方法與本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材微量元素
測定結果
元素含量/pg.g-1 As Cd Cu Fe Hg Mn Mg Pb SeZn
普通飼養方法 1.54460.1805 34.804354.960.7322 54.774 1947.8 1.50450.7623205.20
本發明飼養方
0.50580.1618 37.507 449.62 0.5159 62.0472096.93.6106 7.1212 347.30
) _表1-2 :本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材脂肪酸含量
相對
編保留時間
化合物分子式含量
號/min/%I5.830豆蔻酸CH3(CH2)12COOH1.6726.890十六烷酸(棕櫚酸)CH3(CH2)uCOOH21.7036.9439-十六碳烯酸(棕櫚烯酸)C6H13CH=CH C7HmCOOH9.8647.8719-十八碳烯酸(油酸)C8H17CH=CH C7H ,I4cooh40.7857.9649,12-十八碳二烯酸(亞油酸)CsH1iCH=CHCH2CH=CH C7H mCOOH21.8668J039,12,15-十八碳三烯酸(亞麻酸)C2H5CH = CHCH2CH = C H CH2CH=CHC7H uCOOH1.69共鑒定出6種化合物，占總量的97. 56%，其中飽和脂肪酸占23. 37%，不飽和脂肪酸占 74. 19%。普通飼養方法獲得的土鱉蟲藥材分離出的油酸含量為38. 84%，亞油酸含量為 22. 10%。本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材分離出的油酸的含量為40. 78%，亞油酸含量為21. 86%，油酸、亞油酸是人體的必需脂肪酸，是組織細胞的組成成分，它在體內參與磷脂的合成，并以磷脂的形式存在于線粒體和細胞膜中。必需脂肪酸還可以保護皮膚免受射線損傷，可降低血中膽固醇，防止動脈粥樣硬化及減小血小板豁附性作用；缺乏必需脂肪酸會出現皮炎，抵抗力減弱，生長停滯。綜合上述分析，本發明飼養方法獲得的土鱉蟲藥材的營養價值較高，相較于普通飼養方法獲得的土鱉蟲藥材具有較大的開發利用潛力。
二、富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲制得的富硒土鱉蟲凍干粉膠囊。本凍干粉膠囊通過下述方式制得取富硒土鱉蟲藥材，粉碎并過75-85目篩，冷凍干燥，低溫間歇滅菌后，得土鱉蟲凍干粉粉末，然后按凍干粉乳糖為75 85 25 15 的比例混勻后，直接裝膠囊，即得。更具體地說，將養成的土鱉蟲用20目篩過濾，去除泥土和食物殘渣，90-100°C沸水燙死后，迅速撈出，流沖洗3次以上，去除附著在蟲體表面的沙土，浙干。挑選大小均一， 個體飽滿，無病害的土鱉蟲個體，置-10至-20°冰箱預冷凍12h以上。將凍干箱-40°預冷凍I至2h，再將樣品置于凍干箱中冷凍2至4h，使水分充分凍結。冷阱溫度達到_50°C左右，設定真空冷凍干燥機的各種參數，進行真空冷凍干燥。冷凍干燥分兩個階段，凍干開始時，隔板不加熱，通過外界輻射為升華過程提供熱量，凍干IOh左右；升華干燥階段基本完結后，進入解析干燥階段，啟動加熱程序，使隔板溫度達到40°C，當物料中心溫度接近加熱溫度時，結束凍干操作。將凍干藥材置中藥粉碎機粉碎，過80目篩，即得土鱉蟲凍干粉。間歇低溫滅菌是指將土鱉蟲凍干粉置流通蒸汽滅菌器或滅菌蒸鍋內，平鋪厚度不超過1cm， 加熱至70-80°C后維持60min，將其中的細菌繁殖體殺死，取出置恒溫培養箱37°C培養24h， 讓其中的芽胞發育成為繁殖體，再次同法滅菌，共加熱滅菌3次。將滅菌后的凍干粉置恒溫干燥箱中，平鋪厚度不超過1cm，60-70°C干燥，至水分含量小于8%，分裝。整個操作在無菌環境中完成。輔料的篩選輔料對制劑成型有著舉足輕重的作用，它直接影響著制劑的質量優劣。恰當的輔料方可制出外觀良好、質量穩定、釋放性能好、患者容易接受的制劑。中藥制劑常用的輔料有淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、羥丙甲纖維素(HPMC)、微晶纖維素(MC)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，但山梨醇、PVP、HPMC等價格較貴，病人難以承受這種高消費的藥品，所以擬選用淀粉、糊精、微晶纖維素和乳糖、蔗糖等作為輔料進行篩選，得最佳輔料種類及用量。經本發明人試驗，淀粉、糊精對土鱉蟲凍干粉的吸濕性無明顯改善；而微晶纖維素雖然能明顯改善其的吸濕性，但價格昂貴；蔗糖的吸濕速率和平衡吸濕率均較小，但卻顯著增加了平衡吸濕的時間，并且蔗糖長時間在空氣中易出現變硬結塊，導致藥材的流動性減低，有效成分活性下降，甚至產生霉變現象；而乳糖能夠顯著減緩土鱉蟲凍干粉的吸濕速率，減少平衡吸濕時間和平衡吸濕率，且吸濕后能夠保持土鱉蟲凍干粉的固體粉末狀，休止角也較小，且吸濕性和流動性均明顯優于其它輔料，可考慮作為土鱉蟲凍干粉膠囊的單一輔料的最佳選擇。添加乳糖輔料后土鱉蟲凍干粉的吸濕性隨著輔料所占比例的的增加而顯著降低。 分別以吸濕加速度和平衡吸濕率為考察指標，吸濕擬合曲線的可靠性得到進一步驗證。同時土鱉蟲凍干粉中加入20%的乳糖輔料的吸濕率較低，且不同比例乳糖和土鱉蟲凍干粉混合所制粉末的外觀變化也不大，吸濕后仍能保持其粉末狀，休止角小于40°，可以滿足生產過程中流動性的需求。根據吸濕效果和生產成本綜合考慮土鱉蟲凍干粉中加入20%的乳糖輔料較為適宜。因此，取富硒土鱉蟲藥材，粉碎，過80目篩，冷凍干燥，低溫間歇滅菌后，得土鱉蟲凍干粉粉末，按凍干粉乳糖為80 20的比例加入乳糖，混勻后，直接裝膠囊，即得。功能主治抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力。用于保護臟器少受自由基的傷害，可預防由衰老引起的多種慢性疾病等癥；通過增強機體免疫力，提高抗腫瘤功效。用法用量口服，一次3粒，一日2次。土鱉蟲凍干粉與乳糖(80 20)所制土鱉蟲凍干粉膠囊，其粉末混合均勻、流動性佳、質量穩定，且其吸濕率遠低于藥典規定的9%的限度，因此根據吸濕效果和生產成本，考慮土鱉蟲凍干粉中加入20%的乳糖輔料較為適宜。土鱉蟲凍干粉膠囊的成型工藝取富硒土鱉蟲藥材，粉碎，過80目篩，冷凍干燥后，紫外滅菌，得土鱉蟲凍干粉粉末，按凍干粉乳糖=80 20的比例加入乳糖，混勻后， 直接裝膠囊，即得。經測定，土鱉蟲凍干粉膠囊粉末的臨界相對濕度約為67%，結果表明 土鱉蟲凍干粉膠囊生產和貯存環境的相對濕度應控制在RH < 70%，藥材不容易吸濕。富硒土鱉蟲凍干粉膠囊急性毒性試驗研究。急性毒性試驗是測試新藥對人體毒性強弱的一種重要手段，且可為長期毒性試驗、生殖毒性試驗和致突變試驗等試驗設計提供劑量選擇依據和有關毒性信息，因此急性毒性試驗對藥物開發和應用是非常必要的。為了對富硒土鱉蟲凍干粉膠囊的安全性作出評價，根據衛生部藥政管理局《中藥新藥研究指南》，本研究對小鼠灌胃給予富硒土鱉蟲凍干粉膠囊的急性毒性進行評價，以期為富硒土鱉蟲凍干粉膠囊臨床安全用藥提供依據。現將研究結果報告如下。①實驗動物昆明種小鼠，140只，雄雌各半，體重20±2g，由中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供，清潔級。動物合格證號SCXK (滬)2007-0005。 實驗前適應環境飼養I晚上，自由攝食、飲水，室內溫度18°C _28°C，相對濕度45% -60%。②實驗藥品與試劑富硒土鱉蟲凍干粉膠囊(由浙江中醫藥大學制劑室提供，批號080701)，所用試劑均為分析純。③實驗方法a、半數致死量(LD50)的測定預試驗取昆明種小鼠50只，體重20±2g，實驗隨機分為5組，分別為 8. OOOg · kg'6. OOOg · kg'4. 500g · kg'3. 375g · kg—1 和 2. 531g · kg—1 劑量組，各劑量組間間距為O. 75。小鼠按劑量分別一次性灌胃給予富硒土鱉蟲凍干粉膠囊，給藥前禁食不禁水12h。在給藥后的24h內，根據《中藥、天然藥物毒性研究技術指導原則》的毒性反應指標多次觀察小鼠的毒性反應和死亡情況，以后每天觀察一次，連續觀察7天，記錄小鼠毒性反應及死亡數量，找出引起小鼠0%和100%死亡率劑量所在的范圍。b、正式試驗在預試驗所獲得的0%和100%的致死量范圍內，確定組間的比值。 取昆明小鼠50只，體重20±2g，隨機分為5組。各組小鼠按劑量分別一次性灌胃給藥，給藥前禁食不禁水12h。連續觀察7天，記錄動物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(中毒反應的癥狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆)等。對瀕死及死亡動物應及時進行尸體解剖，其他動物在觀察期結束后進行尸體解剖，當發現器官出現體積、顏色、質地等改變時，則對改變的器官進行組織病理學檢查，根據檢查結果初步判斷可能的毒性靶器官。實驗完畢后，清點各組死亡鼠數，算出死亡率，按改良寇氏法公式進行計算LD5tl = log-1 [Xm-i ( Σ P-0. 5)]Xffl :最大劑量組劑量的對數值i :相鄰兩組比值的對數(相鄰兩組對數劑量的差
值)
權利要求
1.一種富硒土鱉蟲飼養方法，其特征在于，本飼養方法包括下述內容A、飼養場地建設建立多層飼養槽,每層間隔45cm-55cm,相鄰的兩飼養槽之間間隔 80cm-120cm，在飼養槽內壁進行粉刷，并在飼養槽內壁上緣周邊設置防止土鱉蟲逃逸的阻擋體，在飼養槽底部鋪設10cm-15cm飼養土 ；B、飼養土配制取土后用的篩子過篩,然后摻入草木灰混合均勻后形成飼養土，飼養土的濕度為含水量55% -65% ；C、飼料配制飼料包括下述重量份數的成分干的青飼料28-32wt%、豆餅28-32wt%、 富硒酵母O. 8-1. 2wt %、蝦粉4-6wt %，麥麩32-36wt %，然后加入占上述所有成分總重量 10-20%的水，并混合均勻；D、放養及放養密度以每一次蛻皮按齡計算，選用9-11齡的雌性土鱉蟲在飼養場地進行養殖，放養密度為每平方米I. 5 2萬只，每天傍晚5 6時或2 3天投喂上述飼料， 每次飼料投放量為土鱉蟲總重量的8-12% ；E、病蟲害預防①在飼養前，將備好的飼養土先經陽光曝曬消毒；將曝曬消毒好的飼養土在未放入飼養槽之前，用消毒液勻噴灑飼養土，經I周后將飼養土放進飼養槽飼養土鱉蟲；飼養期間每隔20 30天更換I次飼養土，長期保持飼養土清潔無霉敗；②嚴格控制飼料不帶螨類入池，飼料先用微火炒熟殺滅螨類；③注意飼養槽清潔衛生，及時除去壞死卵鞘和死蟲，喂料不過量。
2.根據權利要求I所述的富硒土鱉蟲飼養方法，其特征在于，所述的富硒酵母為啤酒酵母；所述的阻擋體由玻璃制成；所述的飼料還包括磷酸氫鈣、大麥、油下腳料、魚粉、玉米、米糠和南瓜和青飼料中的任意一種或多種。
3.根據權利要求I或2所述的富硒土鱉蟲飼養方法，其特征在于，本飼養方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一種或多種的組合①將飼養槽的剩余飼料連同飼養土表層刮出I. 5 3. 0cm，清除初發生的螨類用炒熟的糠麩、豆粉誘餌在白天誘除螨類；傍晚取出誘餌滅殺處理在螨類成災時，徹底更換全部飼養土 ；先將土鱉蟲從飼養土中篩出，移入裝有干燥細沙容器中，讓土鱉蟲在沙中爬行至少半小時，摩擦掉寄生在土鱉蟲體上的螨類，同時燒烤飼養槽，燒死飼養槽內殘留螨后，再換入經檢查無螨的飼養土飼養;④藥劑噴治先將飼養槽土鱉蟲從飼養土中篩出，取30%三氯殺螨砜用I : 400倍稀釋液拌入飼養槽內飼養土，每立方米飼養土用藥45-55g。
4.根據權利要求I或2所述的富硒土鱉蟲飼養方法，其特征在于，所述的消毒液由下述方式制得取生石灰O. 5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分鐘，過濾后即得消毒液。
5.根據權利要求I或2所述的富硒土鱉蟲飼養方法，其特征在于，本飼養方法養殖而成的土鱉蟲經干燥成藥材后包括下述成分粗蛋白含量65-68wt%、Se含量6-80. 5058 μ g/ g' Zn含量320-360 μ g/V1、不飽和脂肪酸含量占總脂肪油的73-75wt%、油酸含量占總脂肪油的40-42wt%、亞油酸含量占總脂肪油的21-23wt%。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲制得的富硒土鱉蟲凍干粉膠囊。
7.根據權利要求6所述的富硒土鱉蟲凍干粉膠囊，其特征在于，本凍干粉膠囊通過述方式制得取富硒土鱉蟲藥材，粉碎并過75-85目篩，冷凍干燥，低溫間歇滅菌后，得土鱉蟲凍干粉粉末，然后按凍干粉乳糖為75 85 25 15的比例混勻后，直接裝膠囊，即得。
8.根據權利要求I 5中任意一項所述的富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲制得的富硒土鱉蟲蛋白質水解液。
9.根據權利要求8所述的富硒土鱉蟲蛋白質水解液，其特征在于，本富硒土鱉蟲蛋白質水解液通過下述方式制得①取凈制的富硒土鱉蟲碾碎，用石油醚在70°C脫脂4h，其中土鱉蟲和石油醚的重量比為I : 3，得到經過預處理的土鱉蟲備用稱取經過預處理的土鱉蟲，加入緩沖液，固液比為I : 7，pH為5，冷浸過夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶與土鱉蟲比250U μ—1，在60°C水浴中加熱酶解一小時后，滅酶、抽濾、精密吸取濾液，將濾液置于容器中，即得富硒土鱉蟲蛋白質水解液。
10.根據權利要求I 5中任意一項所述的富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲作為抗腫瘤藥物的應用或者作為抗氧化藥物的應用。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種富硒土鱉蟲飼養方法、凍干粉膠囊、蛋白質水解液及藥用。它解決了技術藥用效果不佳等技術問題。飼養方法包括下述內容A、飼養場地建設；B、飼養土配制；C、飼料配制；D、放養密度；E、病蟲害預防。上述富硒土鱉蟲飼養方法飼養所得的富硒土鱉蟲制得的富硒土鱉蟲凍干粉膠囊、富硒土鱉蟲蛋白質水解液。本富硒土鱉蟲飼養方法、凍干粉、蛋白質水解液及藥用的優點在于易于實施，培養所得的土鱉蟲富含人體所需的有益成分，特別是富含硒和鋅，藥用價值高。
文檔編號A01K67/02GK102578030SQ201210020780
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者嚴云良, 余陳歡, 吳巧鳳, 宋宵宏, 樓小紅 申請人:浙江中醫藥大學