專利名稱：耐輻射異常球菌R1 lea-like基因培育抗干旱植物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及耐福射異常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) lea-like基因的新功能，具體涉及該基因在增強植物對干旱脅迫抗性方面的應用。
背景技術：
農作物最常遭受的非生物環境脅迫是缺水，干旱對農作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位(Dracup et al. , 1998)。耐福射異常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因對長期的干燥和強氧化脅迫具有極強的抗性，而成為研究微生物非生物脅迫適應機制的理想菌株，也可作為一個研究高等植物抗干旱的模式物種(Battista et al. ,2001)。 D. radiodurans Rl含有4個與植物干旱抗性相關的蛋白，其中Iea-Iike基因DR1172編碼的蛋白屬于LEA 3家族成員，與植物耐脫水性密切相關(Makarova, et al. ,2001)。盡管耐輻射菌株與干旱脅迫抗性在進化上可能具有協同性，但目前未見耐輻射異球菌 Deinococcus radiodurans Rl 中的 lea-like 基因(DR1172,GeneID :1797273)在增強植物干旱抗性方面的功能的研究報道。
發明內容
本發明的目的是從D. radiodurans Rl基因組中發現能夠增強植物對干旱的抗性基因。并將該基因轉入植物，使轉入該基因的植物獲得抗干旱的能力。本發明通過如下研究發現，Deinococcus radiodurans Rl的lea-like基因 (DRl 172)具有抗干旱脅迫的功能，可用于培育抗旱性狀的植物I、獲得含有D. radiodurans Rllea-Iike基因(DR1172)的重組工程菌株I)通過 PCR 從 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因組擴增出 D. radiodurans Rllea-Iike基因(DR1172)，基因序列號為GeneID :1797273。其大小為897bp，該基因編碼一個27. SkDa的蛋白(為類胚胎發育晚期豐富蛋白)，含298個氨基酸，，將其克隆于載體 pGEMT-easy上，構建了含有完整lea-like基因的重組質粒pGEMT_lea ；2)將基因(DR1172)連接于pRADZ3穿梭質粒上，該質粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動子，構建含有groEL啟動子的完整I ea_l ike基因 (DRl 172)重組質粒 pRADZ3-lea G ；3)將導入lea-like基因(DRl 172)的重組質粒pRADZ3_lea G轉入受體大腸桿菌 JM109中，獲得工程菌株JM-Iea (詳見實施例I)；2、含有D. radiodurans Rllea-like基因工程菌株的干旱抗性實驗實驗證實，經3M 山梨醇(Sorbitol)沖擊后，含有 D. radiodurans Rllea-Iike 基因(DRl 172)的JM-Iea重組菌株生長狀況良好，菌落數高于只含空質粒的JM-Z3菌株(見實施例2及圖4)。該工程菌株具有耐受3M山梨醇沖擊的能力(因Sorbitol具有吸濕性， 高濃度的Sorbitol溶液可以模擬干旱的環境)。此實驗表明D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)具有增強原核生物抗干
3旱的能力。3、lea-like基因(DR1172)在油菜中表達及轉基因植株的干旱抗性鑒定I)將 D. radiodurans Rllea-like 基因(DRl 172)連接到植物表達載體pBI121 中， 構建具有lea-like基因(DRl 172)的重組質粒pBI121_lea ;2)將pBI121_lea重組質粒轉化油菜中，獲得了能夠抗干旱脅迫的轉基因油菜植株;此實驗表明D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)具有培育抗干旱植物的用途(見實施例3及圖5-8)。
圖I是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)序列的PCR產物驗證電泳圖譜；圖2 是含有 D. radiodurans Rllea-like 基因(DR1172)及 groEL 啟動子的原核表達載體的構建驗證電泳圖譜；圖3是在高濃度(3M)山梨醇沖擊前的含有空載體和含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)序列的原核表達載體的大腸桿菌的生長狀況的菌落照片，其中a是含有空表達載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)表達載體的大腸桿菌重組菌株;圖4是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)的原核表達載體及空載體的大腸桿菌(E. coli)在含3M山梨醇培養基中的生長情況的菌落照片，圖中的菌株如下a是含有空表達載體的大腸桿菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)表達載體的大腸桿菌重組菌株。圖5是干早脅迫16天時轉lea-like基因(DR1172)油菜的生長狀態照片。圖6是干早脅迫16天時非轉基因油菜的生長狀態照片。圖7是非轉基因油菜和轉lea-like基因(DR1172)油菜干旱處理28天復水前的生長情況的照片；盆中左邊是轉lea-like基因(DR1172)油菜植株；右邊是非轉基因油菜植株。圖8是非轉基因油菜和轉lea-like基因(DR1172)油菜干旱處理28天復水后的生長情況的照片；盆中左邊是轉lea-like基因(DR1172)油菜植株；右邊是非轉基因油菜植株。
具體實施例方式以下實施例中所舉的質粒、菌株只用于對本發明作進一步詳細說明，并不對本發明的實質內容加以限制。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如 Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所舉的質粒、菌株來源如下
克隆載體pGEMT-easy :為Promrga公司市售產品；穿梭質粒pRADZ3 :為本實驗室保存；植物表達載體pBI121 :為Clontech公司市售產品；大腸桿菌JM 109 :為北京全式金公司市售產品。根癌農桿菌EHA 105由本實驗室保存。實施例ID. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)序列在大腸桿菌中的表達根據已公布的D. radiodurans Rl基因組中的lea-like基因(DR1172)序列設計 I對PCR特異性引物Up 5' ATTAACTAGT CGCAGCGTAGGCTCCTGACA 3Down 5' ACGCCATATG ACTCAGTTCTTGCGGGTGTT 3通過PCR方法從D. radiodurans Rl基因組DNA中擴增出目的基因序列。反應條件94°C IOmin, [94°C 60sec,55°C 30sec,72°C 60sec] 30 個循環，72°C IOmin0 PCR 產物經膠回收后，克隆于載體pGEMT-easy上，命名為pGEMT_lea，并測序驗證；然后通過Spel/Ndel 雙酶切獲得含有粘性末端的lea-like基因(DR1172)及含有啟動子groEL的pRADZ3載體， 將lea-like基因(DR1172)連接于pRAD Z3載體上，構建大腸桿菌表達載體pRADZ3_lea G， 將該表達載體轉化大腸桿菌JM109，經PCR、酶切，測序驗證插入序列正確(見圖1，2)，將該菌株命名為JM-Iea。將含有pRADZ3空質粒的E. coli JM109命名為JM-Z3。實施例2含D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)重組菌株的干旱抗性實驗一、實驗方法I、將實施例I中獲得的2個重組的大腸桿菌分別接種于20mL LB液體培養基(含 Amp抗生素)中，搖瓶過夜培養后(37°C )，再轉接于IOOmL的LB液體培養基中，盡量保持接種量的一致，培養至0D600約0. 5左右(盡量保持0D600值一致)。2、取IOmL的菌液離心后，在等體積的3M山梨醇溶液中沖擊此，每個樣品立即用無菌去離子水倍比稀釋至10_4，取IOii L點在LB固體培養基表面，經37°C培養16h，觀察菌落形成情況并照相(3M山梨醇為高滲溶液，可模擬干旱脅迫)。二、實驗結果圖3顯示，3M山梨醇溶液沖擊前，含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172) 的JM-Iea菌株與含空質粒的JM-Z3菌株生長狀態基本一致；3M山梨醇溶液沖擊后，含有
D.radiodurans Rllea-like基因(DR1172)的JM-Iea重組菌株生長狀況良好，菌落數多于只含空質粒的JM-Z3菌株(見圖4)。三、實驗結論D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)增強了原核生物抗干旱的能力。實施例31ea_like基因(DR1172)在油菜中表達及轉基因植株的干旱抗性鑒定(一 )農桿菌介導轉化油菜實驗I.根癌農桿菌EHA105感受態的制備I)挑取單菌落，接種于5mL YEB液體培養基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm 振蕩培養過夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液體培養基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振蕩培養至OD6tltl約0. 6左右；3)將菌液轉至50mL無菌離心管中，冰浴30min,5000Xg離心5min ；4)棄上清，沉淀用2mL 20mM CaCl2重懸，每份100 y L分裝到I. 5mL離心管中，液
氣中保存備用。2.重組質粒DNA轉入農桿菌I)將約I ii g的pBI 121-lea質粒DNA分別加入到100 U LEHA105感受態細胞中，混勻，冰浴5min ；2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉至37°C水浴中溫浴5min ；3)加入ImL YEB液體培養基，在28°C搖床上250rpm復蘇4 5h ;4)取適量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固體培養基上，置28 °C培養24 48h。3.農桿菌質粒DNA的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液體培養基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0. 5g/L)，28°C，250rpm振蕩培養20h ；2)取 I. 5mL 菌液離心后，棄上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH8. 0，NaCl IOmM, EDTA IOmM pH 8. 0)洗滌2次，棄上清，加入預冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. 0, IOmM EDTA pH 8.0，RNase A 100 y g/mL) 300 y L，用移液器反復抽吸混勻， 室溫靜置IOmin ；3)加入新鮮配置的溶液II (0. 2M NaOH, I % SDS) 600 U L，上下顛倒幾次混勻；4)加入預冷的溶液III (5M乙酸鉀pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 y L， 充分混勻，冰浴5min，4°C 12000 Xg離心5min，上清加入0. 6倍體積的異丙醇沉淀；5)沉淀加 50 ii L TE (Tris-HCI 10mmol/L, lmmol/L EDTA，pH 8.0)溶解后，經 PCR、 Bam HI、Sac I雙酶切驗證。4.油菜無菌苗的準備及農桿菌介導的lea-like基因(DR1172)遺傳轉化I)油菜無菌苗的培養甘藍型油菜(Brassica napus L. ) (84100-18)種子在超凈工作臺上用滅菌水浸泡 IOmin, 10 %的NaClO滅菌12min，再用0. I %的升汞溶液消毒7_8min，用滅菌水洗3_5遍，并把滅菌的油菜種子均勻地擺放在無激素的預培養基上(7.5%瓊脂)。光照培養，4-5d齡油菜幼苗最適于遺傳轉化。2)預培養用75%的酒精和高溫消毒滅菌的剪刀剪掉子葉和生長點，剪取油菜無菌苗緊鄰生長點下約0. 5cm長的下胚軸，置于預培養基(MS+6-BA 2mg/L+2,4_D lmg/L+AgN032. 5mg/ L+AS 19. 62mg/L)上，光照預培養2d。3)農桿菌的培養在50mL LB液體培養基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入0. ImL Iea-EHA 105菌液，28°C下220rpm振蕩培養16h左右，室溫下4000 Xg離心lOmin，棄上清液，菌體用滅菌的MS液體培養基(含AS 100 u mol/L)懸浮，稀釋到原體積的5_20倍，在 28°C下220rpm振蕩培養lh，使菌液的OD6tltl達0. 5左右。
4)共培養把預培養2d的下胚軸放入菌液中浸染lmin，用藥勺撈出下胚軸，放在滅菌的吸水紙上，吸干下胚軸上的多余菌液，再放到覆蓋有滅菌濾紙的預培養基上，用封口膜封好培養皿，25 °C左右，于暗處共培養約2d(暗培養)。5)誘導培養把共培養2d的下胚軸放到誘導培養基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L)上，用封口膜封好培養皿，25°C左右光照培養，每2周繼代I次，直至長出膨大的愈傷組織。6)選擇培養 把膨大的愈傷組織轉移到篩選培養基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培養皿，25°C左右光照培養，每2周繼代I次，直至長出苗。7)生根培養當幼芽長到l-2cm高時，把它們從愈傷組織上分離，轉移到生根培養基上 (1/2MS+NAA 0. 5mg/L+Kan 25mg/L)進行生根培養。在抗生素篩選條件下，約87%的芽在2 周后形成根。8)煉苗和移栽生根后的幼苗長到5-6cm高時，半敞開培養瓶蓋子，進行煉苗；待幼苗適應外界環境以后，轉移到室內滅菌的蛭石中栽種培養，并用1/2MS培養液澆灌。當幼苗生長至7-9cm 時，將幼苗移植到泥土中生長，然后再進行下一步實驗。(二)含lea-like基因(DR1172)序列轉基因油菜的抗旱性鑒定I、實驗目的鑒于該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對干旱脅迫具有抗性，進一步對轉基因植株進行抗旱性鑒定。2、實驗方法對苗期的轉基因油菜植株和非轉基因油菜植株均分別一次性澆足營養液后不再澆水，并進行以下實驗對比I)觀察油菜植株的生長情況從澆足營養液后的當天開始起算，28天內不再澆水及營養液；第28天起恢復澆水，并在第28天當日澆足營養液，之后僅酌情澆水。2)測定葉片含水量從停止澆水第二天起，每隔一天測定葉片相對含水量 (ReIativewatercontent,)；含水量的測定方法從植株上取下約0. Ig葉片后，立即稱取鮮重(FW)，然后將葉片浸入去離子水中4h，取出用濾紙吸去表面水分，稱取飽和鮮重(TW)，然后將葉片放入烘箱于70°C烘干至恒重，稱取干重(DW)。相對含水量(RWC)按下式計算RffC(% ) = (Fff-Dff) / (Tff-Dff) X 100%。3、實驗結果I)油菜植株的生長情況對比結果干早脅迫第4天時，非轉基因油菜在葉片已經開始萎蔫；轉基因油菜葉片飽滿，生長正常；干旱脅迫第10天時，非轉基因油菜失水嚴重，葉片萎蔫；轉基因油菜依然正常生長;干旱脅迫第16天時，非轉基因油菜葉片萎蔫、變黃(見圖5);轉基因油菜的葉片才開始萎蔫(見圖6);干旱脅迫第28天時，非轉基因油菜及轉基因油菜葉片均萎蔫(見圖7);28天恢復澆水后，非轉基因油菜葉片枯黃、萎蔫，不能正常生長；而轉lea-like基因(DR1172)的油菜迅速恢復生長，葉片變綠(見圖8)。表I轉基因油菜和非轉基因油菜對干旱脅迫的比較
權利要求
1.Deinococcus radiodurans Rllea-Iike 基因(DR1172，GeneID :1797273)培育抗干旱植物的用途。
2.含Deinococcus radiodurans Rllea-Iike 基因的重組質粒。
3.含Deinococcus radiodurans Rllea-Iike 基因的重組工程菌株。
4.含Deinococcusradiodurans Rllea-Iike基因的重組質粒培育抗干旱植物的用途。
5.權利要求4所述的用途，所述重組質粒是能在大腸桿菌表達的質粒。
6.權利要求4所述的用途，所述重組質粒是能在植物中表達的質粒。
7.權利要求4所述的用途，所述重組質粒轉化的宿主細胞培育抗干旱植物的用途。
8.權利要求7所述的用途，所述宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。
9.權利要求I或4所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本發明發現耐輻射異球菌Deinococcus radiodurans R1中的lea-like基因(DR1172)具有增強原核生物及植物的抗逆能力。本發明構建了包含上述基因的重組載體，把它們分別導入原核及真核宿主細胞。實驗證明，lea-like基因(DR1172)在原核宿主細胞和油菜中表達后，均能增強其干旱抗性。
文檔編號A01H5/00GK102586282SQ20121004623
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者張維, 林敏 , 江世杰, 王勁, 郝艷華, 陳明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所