專利名稱：奶山羊泌乳相關miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于奶山羊選育技術領域，涉及奶山羊泌乳量相關miR-196a基因的單核苷酸多態性及其檢測和其作為輔助選擇標記在奶山羊育種中的應用。
背景技術：
我國山羊品種資源豐富，養羊業的歷史悠久，羊的存欄數量占世界前列。在廣大的農村、牧區及城市郊區發展養羊業有巨大的潛力。山羊業為我們的生活提供了奶、肉、羊毛、絨及皮革等多種生活產品。其中，奶山羊業，投資小，易飼養，見效快，被稱為“農家的奶牛”(趙有璋2002)。羊奶具有很高的營養價值，不含過敏原，營養成分均衡，易消化吸收，與人乳蛋白質組成相似，特別適宜于病人、嬰幼兒及老年人飲用，因此山羊奶是最符合人類需求的 功能性保健食品(Haenlein，2004)。然而，在我國與其它養殖業相比，奶山羊養殖規模和方式相對落后。近年來，我國奶山羊存欄總數為580萬只左右，發展非常緩慢，年產商品奶約占全國總奶量的3%。因此，利用分子育種技術加快良種選育從而發展和提高奶山羊業，這是我國未來奶業發展的重點內容之一，尤其是在“三聚氰胺事件”后對牛奶產業的發展產生嚴重的負面影響，山羊奶則越來越受到人們的重視。應用分子標記的現代育種技術是加快良種選育和提高種群遺傳品質，從而增加奶山羊的泌乳量和改善乳品質的先進的有效的方法。應用分子標記育種首先是在DNA水平上篩查和檢測與奶山羊泌乳性狀密切相關的遺傳標記；其次是建立其基因多態性的快速檢測方法；然后實現遺傳標記輔助選擇和實現早期診斷選擇。近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術等，但SSCP操作繁瑣、耗時長，結果易造成誤判；普通的PCR-RFLP方法要求待測多態性位點是某ー特定酶切位點，應用范圍局限；直接測序技術成本較高。MicroRNA(miRNA)在轉錄后水平對基因表達扮演著極其重要的角色。miRNA是ー類小的單鏈內源性非編碼RNA，能夠與靶mRNA的特定序列結合，通過降解靶mRNA或抑制翻譯發揮其重要調控作用(Bartel，2004)。目前研究已經發現miRNA在細胞分化與凋亡、生長發育、糖脂代謝、炎癥、免疫應答以及腫瘤發生等多個生理和病理過程中均扮演著關鍵角色，己有實驗證據表明ー些miRNAs在乳腺上皮細胞的分化增殖過程中發揮重要的調控作用。Stefanie等(Stefanie et al.，2009)應用高能量測序的方法研究產后母小鼠乳腺發育相關的miRNA表達變化規律，結果顯示miR-196a參考了小鼠產后腺發育的調控。但miR-196a在奶山羊上的研究目前還未見報道
發明內容
本發明解決的問題在于提供ー種奶山羊泌乳相關miR_196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法及其應用，該基因的單核苷酸多態性其檢測方便，可以作為輔助選擇標記在奶山羊育種中應用，加快良種選育速度和提高種群品質。本發明是通過以下技術方案來實現ー種奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性，其基因單核苷酸多態性包括在如SEQ ID No. I所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位為C或T的單核苷酸多態性。ー種奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟I)以包含miR_196a基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊miR-196a基因；
所述的引物對P為正向引物CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA；反向引物GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT；2)用限制性內切酶HinfI消化PCR擴增產物，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的單核苷酸多態性CC基因型表現為265bp條帶；CT基因型表現為265，241和24bp條帶；TT基因型表現為241和24bp條帶。所述的PCR擴增的反應程序為94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環;72°C延伸IOmin0所述瓊脂糖凝膠電泳為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。所述將奶山羊miR_196a基因第340位SNP位點的CT基因型作為有效DNA標記。所述的有效DNA標記為CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標記。所述的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性在奶山羊標記輔助選擇中的應用。所述奶山羊miR_196a基因第340位的單核苷酸多態性中的CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標記。所述的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性在區分絨山羊與奶山羊的分子遺傳標記中的應用。所述的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性在區分絨山羊與奶山羊的分子遺傳標記中的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性，利用DNA池測序的方法篩查奶山羊miR-196a基因的多態性位點，結果表明該基因第340位為C或T的堿基多態性，而且進一歩表明該基因與奶山羊的泌乳量相關，多態性可作為輔助選擇標記在奶山羊育種中應用，從而加快良種選育速度和提聞種群品質。本發明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，針對其多態性的特性，設計了特定的PCR引物擴增，用限制性內切酶HinfI消化PCR擴增產物，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定SNP多態性，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態性。本發明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性，對2個奶山羊品種和2個絨山羊樣品的上述SNP進行了基因分型和基因頻率分析，結果表明這個位點檢測能夠成為絨山羊與奶山羊的區分特征；同時也對HinfI多態位點與莎能奶山羊各胎年泌乳量之間進行了關聯分析。方差分析結果表明，HinfI多態位點能夠成為提高奶山羊第二胎和第三胎泌乳量的分子標記。本發明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態性，提供了ー種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與奶山羊泌乳性狀密切相關的遺傳標記，可用于奶山羊的輔助選擇和分子育種。
圖I是本發明的流程示意圖；圖2是本發明中PCR克隆篩查到的奶山羊miR_196a第340位C-T突變的SNP多態性測序結果圖；圖3是本發明用來檢測SNP多態性的PCR引物設計和擴增產物中SNP位點突變的示意圖，其中方框中表示突變位點、帶下劃線為內切酶識別序列，小寫“g”是引入的錯配堿基;圖4是本發明多態性檢測的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中瓊脂糖凝膠濃度為 I. 5% ；圖5是本發明中奶山羊miR-196a基因第340位的HinfI-RFLP的三種基因型電泳結果，瓊脂糖凝膠濃度為2. 5% ;其中，TT基因型表現為355bp條帶，TC基因型表現為355，334和2Ibp條帶，CC基因型表現為334和2Ibp條帶；由于2Ibp較小，故在瓊脂糖電泳中看不到，但不影響判別基因型。
具體實施例方式本發明首先根據miR_196a基因的保守序列設計引物，分別以4種山羊品種的基因組DNA池為模板，進行PCR擴增，并對PCR產物純化，測序。然后，進行測序圖的分析和序列的比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的HinfI-RFLP檢測；最后，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和泌乳量的關聯分析，篩選出與奶山羊泌乳性狀密切相關的分子標記。下面對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。a、山羊miR_196a基因DNA序列的克隆及其多態性的檢測I、山羊血樣的采集及處理取山羊血樣10mL，加入O. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，_80°C保存備用。本發明采用了 4種山羊品種，包括2中奶山羊和絨山羊，具體為I)關中奶山羊血樣440份采自陜西省西安市三原塔南保種場；
2)薩能奶山羊血樣268份采自陜西省寶雞市千陽縣薩能奶山羊繁育中心(201份)和西北農林科技大學奶山羊場(67份)；3)南疆白絨山羊血樣230份采自新疆維吾爾自治區烏魯木齊地區；4)新疆白絨山羊血樣119份采自新疆維吾爾自治區烏魯木齊地區；2、血樣基因組DNA的提取I)將冷凍血樣室溫解凍，轉移500 μ L至I. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin(4°C ),棄去上清液,重復上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA 和2. 5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調pH至8. 0，4°C保存備用。3)加蛋白酶K3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加I μ L蛋白酶K混勻繼續消化至澄清。4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中，重復一次。5)加氯仿500 μ L,充分混勻20min,4°C, 12000r/min離心IOmin,將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中。6)加O. I倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水こ醇，混合轉動離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20°C保存30 60min。7) 4°C,12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%的冰冷こ醇漂洗DNA沉淀2次。8) 4°C, 12000r/min離心IOmin,棄上清液,室溫下使こ醇揮發干凈。9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全溶解，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80°C保存。3、DNA池的構建用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如OD26(i/OD28(i比值小于I. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；若比值大于I. 8，則應該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(ng ) =50 X OD260 值 X 稀釋倍數DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/ U L，然后從關中奶山羊品種30個濃度為50ng/ μ L DNA樣品中取10 μ L混合構建成品種DNA池；按照同樣的方法也構建薩能奶山羊、南疆絨山羊、新疆絨山羊品種DNA池。4、擴增引物設計由于山羊pri-miR_196a序列至今未知，故從NCBI數據庫中(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/)獲得同源動物牛的GenBank登錄號為AC_000162. I 的pri_miR-196a DNA序列，以該基因序列同源保守區序列為參考用Primer5. O設計山羊pri_miR-196a的測序PCR引物對，擴增片段總長度為578bp。其測序引物對序列如下正向引物5’-GGTTTGGCGGCTTGAGGT-3’ 18bp ；
反向引物5’-GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT-3’22bp ；5、PCR 克隆山羊的 pri-miRNA_196a DNA 序列分別以4個山羊品種的DNA池為模版，用相應的引物對進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μ L，見表I ;PCR反應程序，見表2。表IPCR反應體系
權利要求
1.一種奶山羊rniR-196a基因的單核苷酸多態性，其特征在于，其基因單核苷酸多態性包括 在如SEQ ID No. I所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位為C或T的單核苷酸多態性。
2.一種奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 O以包含miR-196a基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊miR-196a基因； 所述的引物對P為 正向引物CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA ； 反向引物GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT ； 2)用限制性內切酶HinfI消化PCR擴增產物，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的單核苷酸多態性CC基因型表現為265bp條帶；CT基因型表現為265，241和24bp條帶；TT基因型表現為241和24bp條帶。
3.如權利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述的PCR擴增的反應程序為94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環;72°C延伸IOmin0
4.如權利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。
5.如權利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，將奶山羊miR-196a基因第340位SNP位點的CT基因型作為有效DNA標記。
6.如權利要求5所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述的有效DNA標記為 CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標記。
7.權利要求I所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性在奶山羊標記輔助選擇中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，奶山羊miR-196a基因第340位的單核苷酸多態性中的CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標記。
9.權利要求I所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態性在區分絨山羊與奶山羊的分子遺傳標記中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種奶山羊泌乳相關miR-196a基因的單核苷酸多態性的檢測方法及其應用，其基因單核苷酸多態性包括在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位為C或T的單核苷酸多態性。RFLP多態性與泌乳量關聯分析證實HinfI多態位點與泌乳量之間有顯著相關，基因型為CT的第二胎和第三胎泌乳量顯著高于基因型為CC和TT個體的，此外TT個體的體高顯著高于基因型CC和CT個體的。本發明提供的檢測方法可以用于西農薩能奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的奶山羊種群。
文檔編號C12N15/11GK102839171SQ20121037198
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者陳宏 , 李轉見, 郭文嬌, 藍賢勇, 黃永震, 孫加節, 王璟 申請人:西北農林科技大學