專利名稱：一株對美國白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物殺蟲劑技術領域，涉及一株對美國白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其制備方法，更具體的說是國際重要檢疫性害蟲一美國白蛾篩選到一株對其具有高致病力的球孢白僵菌菌株采集、菌種鑒定和篩選過程。
背景技術：
長期以來，白僵菌作為害蟲生物防治的重要因子受到廣泛關注和研究。我國從上個世紀50年代開始白僵菌的研究和應用，其中應用球孢白僵菌防治松毛蟲、玉米螟是世界上殺蟲真菌應用面積最大、最為成功的事例之一，目前仍保持每年應用面積50萬公頃，應用面積最高年份超過133萬公頃。據不完全統計，1996年我國白僵菌生產廠多達64個。利用白僵菌能夠成功防治的害蟲種類在40種以上(周鍈等人，北京化學工業出版社，2006)。美國白蛾是一種重要的國際性檢疫害蟲。自從1979年首次在我國丹東發現至今的30余年已傳至河北、天津、山東、陜西、北京等諸多省市，給我國林業生產以及生態安全造成了重大損失和潛在威脅。趙鐵珍等人(2004年全國美國白蛾疫區的非經濟損失評估[J].林業經濟問題，2006，26 (4):321-326)評估美國白蛾造成的全國非經濟損失總量合計為140. 35億元。優先利用各種生物技術與其它非化學防控技術控制美國白蛾是確保我國林業有害生物實現可持續發展的重要保證。如，眾所周知的利用周氏嚙小蜂防控美國白蛾得到大面積推廣應用，效果顯著。利用白僵菌防控美國白蛾在山東也有應用的報道，但是以美國白蛾為防控對象取得農藥登記的白僵菌制劑在我國目前為空白。但是針對美國白蛾篩選高致病力球孢白僵菌菌株的研究在我國才剛剛起步。陸秀君等人(美國白蛾高毒白僵菌菌株篩選及其與高效氯氰菊酯的相容性[J].植物保護學報，2008，35 (6) :575-576)報道了美國白蛾高毒白僵菌菌株的篩選結果，在6個球孢白僵菌中各菌株的毒力與致死時間上差異顯著；劉寶生等人(白僵菌Bb08-12菌株生物學研究及其對美國白蛾的致病力[J].植物保護，2011，37 (4) :146-149)報道了 Bb08_12菌株對美國白蛾的致病性。因此，篩選對美國白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株是一項重要的基礎研究工作。
發明內容
本發明涉及的菌株是發明人從感染白僵菌的美國白蛾越冬蛹上分離純化獲得，經過和其它10株不同來源的球孢白僵菌在相同的條件對美國白蛾的室內毒力測定(測定方法相同)，篩選出4株高致病力的菌株，對這4菌株再經過田間對美國白蛾的防效試驗，確認發明人自己分離的一株球孢白僵菌Bbl0331菌株具有進一步研發潛力和生產使用價值，特此將該菌株申請發明專利。本發明的一個目的是公開了一種球孢白僵菌菌株，其保藏號為CGMCC No. 5739。本發明的另一個目的是公開了 CGMCC No. 5739菌株的制備方法。
本發明的再一個目的是公開了孢白僵菌菌株在制備作為微生物殺蟲劑防治害蟲方面的應用。特別是作為微生物殺蟲劑防治農林園藝害蟲方面的應用。優選是在防治美國白蛾害蟲方面的應用。為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案
一種球孢白僵菌菌株，特別是對美國白蛾幼蟲具有高致病力的球孢白僵菌菌株(球孢白僵菌菌株(ifeawreria代號Bb 10331,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普
通微生物中心的保藏號為=CGMCC No. 5739。本發明公開的球抱白僵菌菌株iBeauveria Aa1S1Siafla),代號Bbl0331,于2012年2月I日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌株保藏號為CGMCCNo. 5739。保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。本發明公開的球抱白僵菌菌株iBeauveria如)代號Bb 10331, CGMCC No.5739所具有的形態、DNA-ITS序列、生物學特征如下
(I)菌落形態特征(沙氏培養基上培養)白色，較平坦，中央2/3面積為乳白色孢子粉層有較為明顯的放射狀脊溝；外呈白色的毛氈狀，放射狀脊溝不明顯或無。菌落初期側面觀為乳突型。(2)產孢結構及分生孢子特征分生孢子梗多數為瓶狀，也見有絲狀，單生或簇生；分生孢子梗頂端產孢小梗呈“之”字形；分生孢子著生在產孢梗的折點處。分生孢子多為球形，也有卵圓形，平均大小為2. 95 (2. 16 4.78) X2. 10 (I. 82 2. 92)微米。(3)該菌株特異性DNA-ITS序列堿基數569bp。(4)生物學特性該菌株營養生長適宜的溫度范圍26 29攝氏度，PH值5. 5
6.0 ;產孢最適溫度為26攝氏度，適宜的PH值范圍在6. 5 7. 0，分生孢子萌發的適宜溫度為26 29攝氏度，適宜的PH值范圍在6. 5 7. O。球孢白僵菌菌株(ifeawreria bassiana )CGMCC No. 5739的制備方法,其特征在于按如下步驟進行
(1)球孢白僵菌菌株(ifeawreriaAa1S1Siafla),代號Bb10331的分離從天津市武清區霍屯采集的感染白僵菌的美國白蛾越冬蛹體上分離獲得；
(2)純化方法
將感染白僵菌的美國白蛾蛹體上的白粉狀物輕輕抖落到盛有0. 05%吐溫滅菌水(加入適量的直徑達2-3mm的滅菌的玻璃砂粒)的50毫升的三角瓶中充分震蕩使白僵菌分生孢子單個分散開，取配好的孢子懸浮液逐一稀釋100倍、500倍、1000倍液，用滅菌的三角形玻璃涂抹棒分別蘸取不同稀釋倍數的白僵菌孢子液涂抹于培養皿中沙氏瓊脂培養基平板(已滅菌)上，置于恒溫26攝氏度的培養箱中培養；
在培養第2 5天過程中，當有純白色的單個菌落長出后，及時挑取單個純白菌落轉接到一個培養皿的沙氏瓊脂培養基平板上單獨培養，觀察確無(青霉、黑根霉等)雜菌后，純化培養完成；將得到的白僵菌菌株轉入盛有沙氏斜面培養基的試管，按照上述培養溫度培養15天左右待有大量分生孢子長出后，將試管貼好菌株標簽轉入4攝氏度冷藏箱中保藏6個 月左右，再活化轉管培養、繼續保藏；
薩氏瓊脂培養基配方(注下列培養基各成分，有市售)蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母膏2g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，PH5. 6);制備過程、方法按照配方比例，根據制備培養基總量稱取各成份的質量。將蛋白胨用少量常溫蒸餾水(含在總量內)潤濕化開再倒入鍋內，然后加入葡萄糖、酵母膏充分混勻，最后加入潤濕呈粥狀的瓊脂粉，直到培養基煮成透明狀，補足蒸餾水至100%，用PH值試紙測量調節培養基的PH值使其至5. 6-6. 0即可；分裝到250毫升或500毫升的三角瓶內，高壓蒸汽滅菌，在0. IMPa的壓力下121. 3攝氏度滅菌40 45分鐘；
(3)該菌株在薩氏瓊脂試管斜面培養基恒溫26攝氏度培養15天后4攝氏度下保藏。本發明進一步公開了球孢白僵菌菌株(ifeawreria如)在制備作為微生物殺蟲劑防治害蟲方面的應用。特別是在防治農林園藝害蟲方面的應用。典型的是作為微生物殺蟲劑防治美國白蛾害蟲方面的應用。
本發明制備的球孢白僵菌菌株(ifeawreria bassiana) Bb 10331的特點
檢驗項目小鼠急性經口毒性試驗
檢測結果動物染毒后，未見明顯中毒表現，觀察期內無死亡，尸檢中各主要臟器未見明顯異常。檢測結論本品的小鼠急性經口毒性LD5tl > 20. 0 / g / kg. BW。按《食品安全性毒理學評價療程和方法》(GB15193. 3-2003)，本品屬于無毒。
具體實施例方式 下面結合實施例說明本發明，這里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定，下面通過實例來進一步闡明本發明球孢白僵菌菌株的制備方法及應用，本發明所用到的試劑除特別指出外均有市售。實施例I
I白僵菌Bbl0331及另外10株白僵菌的采集、分離和純化
利用黃粉蟲(市售)誘集法、白僵菌選擇性培養基分離法從土壤中篩選白僵菌；利用稀釋分離法從感染白僵菌的美國白蛾蛹上分離、純化。從白僵菌制劑生產商與科研單位索取白僵菌制劑及菌種。從制劑中純化白僵菌菌株方法采用稀釋分離法。結果見表I:
黃粉蟲誘集法首先把土壤樣品過細篩后加入適量的水，使其含水量達到潮濕狀態(手攥成團，輕觸散開)，在90mm直徑的培養皿中裝入三分之二的潮濕細土樣品，把黃粉蟲幼蟲接入培養皿的土壤樣品中。最后把接蟲的培養皿置于26攝氏度培養I周左右，檢查黃粉蟲是否被白僵菌感染。白僵菌選擇性培養基篩選法
白僵菌選擇性培養基(各組份，市售)配方葡萄糖40g，蛋白胨10g，孟加拉紅(虎紅)
0.330g,瓊脂粉17g，蒸餾水IOOOmL,培養基制成后高壓濕熱滅菌，使用前等培養基溫度降到40°C左右后加入IOOOmL加入CuS04 Ig,放線菌酮0. 500g,氯霉素0. 500g。將土壤樣品或白僵菌制劑樣品進行逐級稀釋(100倍、500倍、1000倍)，直至能夠在白僵菌選擇性培養基平板上長出單個白色白僵菌菌落，密度較小，便于轉接培養觀察。表I白僵菌菌株采集、收集結果
權利要求
1.一種球孢白僵菌菌株iBeauveriabassiana),代號Bb 10331，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 5739。
2.權利要求I所述球孢白僵菌菌株如Miwa)在制備作為微生物殺蟲劑防治害蟲方面的應用。
3.權利要求I所述球孢白僵菌菌株如Miwa)在制備作為微生物殺蟲劑防治農林園藝害蟲方面的應用。
4.權利要求I所述球孢白僵菌菌株如Miwa)在制備作為微生物殺蟲劑防治美國白蛾害蟲方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一株對美國白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其制備方法。包括對白僵菌高毒力菌株采集、菌種鑒定和篩選過程。本發明篩選出的Bb10331菌株,保藏號CGMCCNo.5739,是發明人從天津市武清區霍屯采集的感染白僵菌的美國白蛾越冬蛹體上利用稀釋分離法純化獲得的菌株。通過對該菌株菌落、產孢結構、分生孢子形態觀察以及DNA-ITS序列測定鑒定出該菌株為球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。通過實驗室毒力測定和對田間楊樹上發生的美國白蛾的防治試驗以及防治保護地黃瓜作物上蚜蟲試驗，這些結果都顯示了該菌株具有良好的開發潛力和生產應用價值。
文檔編號A01N63/04GK102634459SQ20121004792
公開日2012年8月15日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者劉寶生, 孫淑琴, 徐維紅, 白義川, 胡霞, 許靜楊, 谷希樹 申請人:天津市植物保護研究所