專利名稱：一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種提高農作物胚胎出生率的培養方法，尤其是一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，屬于植物培養技術領域。
背景技術：
結球甘藍(B rassica oleracea L. var. Capitata)是十字花科、蕓薹屬的植物， 為甘藍(Brassica oleracea L.)的變種。又名卷心菜、洋白菜、包菜等。結球甘藍具有耐寒、抗病、適應性強、易儲耐運、產量高、品質好等特點，在我國各地普遍栽培，在蔬菜栽培和供應中占有重要地位。對蔬菜的周年供應起很大的作用。并且大量的出口到國外，在蔬菜出口貿易中也占有相當重要地位。目前，我國結球甘藍主栽品種大部分被日本、韓國等國外的公司所壟斷，具有自主知識產權的品種較少，究其原因是因為我國結球甘藍育種資源很少、 開發利用不夠，未配制出良好的品種。傳統的育種方法主要是對市場上表現好的結球甘藍品種進行多代自交分離，來獲得其親本，然后用于育種實踐當中，然而，傳統的多代自交分離的方法一般需要5-6年的時間才能選育到一個純合的親本材料，但其表現是否優良、能否與其它材料組配，以及配制出來的雜交種表現能否得到認可還需要3-4年的時間。近年來，針對傳統方法出現的游離小孢子培養方法可以在1-2年內快速獲得雙單倍體純系，比傳統的方法縮短了 3-4年的時間，從而大大縮短育種進程，同時，隱性性狀也易于表達，豐富了育種資源。因此，結球甘藍小孢子培養技術在優良自交系的創制和提高新品種選育的效率等方面具有重要作用。在蕓薹屬作物中，自從Lichter (1982)首次報道油菜游離小孢子培養成功獲得再生植株以來，很多國內外學者對此小孢子培養技術進行了大量深入的研究應用，并取得了一些成果。關于結球甘藍游離小孢子培養最早見于Lichter (1989)和Takahata (1990) 的報道，隨后國內外學者在這一培養技術上開展了一系列的研究和改進，在提高結球甘藍小孢子胚胎發生頻率方面的研究也做了大量深入的研究，取得了一些成果。隨后，嚴準等 (1999，)、唐青林等(2000)、劉艷玲等(2006)、袁素霞(2009)等人也有報道，但結球甘藍小孢子胚胎發生的效率普遍不高，對難出胚的品種來說，培養效果很不理想。有關蕓薹屬游離小孢子培養的大量研究表明，供體植株的基因型對小孢子胚胎發生的影響極為重要，它不僅影響產胚率，而且也影響胚的質量(Chuong et al.，1988),限制了小孢子培養技術在結球甘藍遺傳育種和基礎研究中的進一步應用。雖然人們在提高結球甘藍游離小孢子出胚率的影響因素方面做了一些研究工作，但是結球甘藍游離小孢子出胚率仍舊不高，且在一些基因型中很難獲得胚狀體(方淑桂等，2005a，2005b ;劉艷玲等，2006 ;陸瑞菊等，2006)，嚴重妨礙了游離小孢子培養技術的實際應用，因此，尋找一種簡便有效的提高結球甘藍難出胚基因型品種出胚率的方法具有重要的實踐意義。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術存在的缺陷，提出一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，采用難出胚的結球甘藍與易出胚的油菜花蕾按一定數目配比共培養，從而促進結球甘藍小孢子出胚，提高小孢子培養的出胚率。一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，包括以下步驟
步驟一，取結球甘藍和油菜花序上的花蕾進行混合，得到甘藍和油菜的混合花蕾，進行滅菌處理；
步驟二，在滅菌后的混合花蕾中加入B5洗滌培養基后研磨
成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入35 45ml的 NLN-13誘導培養基、8 12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下32 33 1熱激處理I 3天后，移至黑暗、溫度為25±2 °C的條件下培養20 30天，得到子葉型胚狀體；
步驟四，將子葉期胚狀體接種至胚狀體固體分化培養基中，每天光照15±3小時、溫度 23±3°C下培養，直至分化，得到再生芽；
步驟五，切取所述再生芽轉接至生根培養基培養出苗后，按常規方法進行煉苗和移栽， 得到再生植株；
步驟六，根據植株形態，按照田間觀察的方法區分結球甘藍和油菜的再生植株，即得結球甘藍植株。其中，所述步驟一，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾，結球甘藍花蕾的花瓣和花藥長度比為O. 8 I. 2，油菜花蕾的花瓣和花藥長度比為O. 5 O. 75。所述的結球甘藍和油菜共培養花蕾中結球甘藍花蕾與油菜花蕾的用量一般不作特別的限定，為了達到更好的效果，優選油菜花蕾的數量大于結球甘藍花蕾的數量。滅菌采用本領域常規的滅菌方法， 可采用滅菌液將混合花蕾滅菌10 20分鐘，無菌水沖洗干凈后得到無菌的混合花蕾。所采用的滅菌液為0.1% (質量百分濃度)升汞溶液。以IL升汞溶液計，組成為Ig的升汞和 IL無菌水。所述的B5洗滌培養基為B5液體培養基IL和蔗糖30 g組成，pH 6. O 6.2 ;高溫高壓滅菌，備用。所述的NLN-13誘導培養基由NLN液體培養基IL和蔗糖130 g組成，pH 6. O 6. 2，微孔濾膜過濾滅菌，備用；所述的活性炭混合液由NLN液體培養基1L、瓊脂糖 2 5g和Ig活性炭組成，高溫高壓滅菌，備用。進一步地，所述的B5液體培養基，以IL計，組成為NaH2PO4CH2O 169. 5mg, KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg,MgS04*7H20 500mg，MnSO4·4Η20 IOmg, H3BO3 3mg, ZnSO4*7H20 2mg, KI 0. 75mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuSO4*5H20 0. 025mg, CoC12*6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37. 3mg, FeS04*7H20 27. 8mg, CaCl2. 2H20 150mg, VB1 IOmg, VB6 lmg, VPP lmg,肌醇IOOmg和余量的蒸懼水；所述的NLN液體培養基，以 IL 計，由 KNO3 125mg，Ca (NO3) 2·4Η20 500mg，MgSO4.7H20 125mg, KH2PO4 125mg, H3BO3
6.2mg, MnSO4lH2O 18. 95mg, ZnS04*7H20 8. 6mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuS04*5H20 0. 025mg, CoC12WH2O 0. 025mg，維生素 BI 0. 5mg，維生素 B6 0. 5mg，生物素 0. 05mg，葉酸 0. 5mg， Na2EDTA 37. 3mg, FeS04*7H20 27. 8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，煙酸 5mg，L-谷氨酰胺 800mg， 谷胱甘肽30mg, VB5 5mg,絲氨酸IOOmg和余量的無菌水組成。所述的沉淀重復以下操作I 2次在沉淀中加入B5洗滌培養基，研磨成懸浮液， 過濾所得濾液經離心、棄上清液。重復操作后所得的沉淀中依次加入NLN-13誘導培養基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。所述過濾得沉淀步驟進行I 2次，所述小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為O. 8 X IO5 I. 2 X IO5個/mL ;采用45Mm無菌濾網，離心的條件為500 900 rpm/min 離心 3 5min。所述步驟三中，熱激處理后小孢子混合懸浮液移至避光、溫度為25±2 °C的條件下培養20 30天期間，當肉眼可見胚狀體時，再于相同條件下進行振蕩培養，使小孢子胚生長健壯。所述步驟四中，所述胚狀體固體分化培養基由B5培養基1L、蔗糖20g和瓊脂10 12g組成，pH5. 8 6.1，高溫高壓滅菌。當所述的胚狀體較大時可切成多塊后接種。所述步驟五中生根培養基由MS培養基IL、蔗糖或白砂糖20 30g和瓊脂7 9g組成，pH 5. 8 6. O。其中，所述的MS培養基，以IL計，由NH4HO3 1650 mg, KNO3 1900 mg, CaCl2·2Η20 440 mg, KH2PO4 170 mg, MgSO4*7H20 370 mg, FeSO4*7H20 27. 8 mg, Na2EDTA 37. 3 mg, H3BO3 6. 2 mg, MnSO4lH2O 16. 9 mg, ZnSO4*7H20 8. 6 mg, Na2MoO4*2H20 0. 25 mg, CuSO4*5H20 0.025 mg, CoC12.6H20 0.025 mg, KI 0. 83 mg，肌醇 100 mg，甘氨酸 2 mg，煙酸 0.5 mg,維生素BI 0.1 mg,維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水組成。移栽時用清水洗凈組培苗根部的培養基，后植于育苗專用基質穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養5 10天后移栽。通過給予一定的緩沖環境，以更好地使在生長環境較好的實驗室里生長的組培苗適應較嚴酷的自然環境。鑒定采用本領域常用的植株形態鑒定法鑒定區分結球甘藍和油菜植株，并利用流式細胞儀對小孢子植株進行倍性分析、鑒定。本發明采用難出胚的結球甘藍與易出胚的油菜花蕾按一定數目比例共培養的方法，以易出胚的材料帶動難出胚的材料出胚，使結球甘藍的出胚率顯著提高，所共培養結球甘藍出胚率最高達27. 7個/蕾，而對照結球甘藍出胚率最高僅為2. 4個/蕾，經植株形態鑒定及流式細胞儀檢測發現，在相同的條件下混合培養最后得到15株結球甘藍小孢子苗， 而單獨培養的對照株數為I株。其有益效果是解決了結球甘藍小孢子培養胚胎發生頻率低的問題，提高了小孢子培養技術的利用效率。
具體實施例方式結球甘藍和油菜共培養花蕾中結球甘藍花蕾與油菜花蕾的用量一般不作特別的限定，為了達到更好的效果，優選油菜花蕾的數量大于結球甘藍花蕾的數量，詳見以下實施例。實施例一
(I)本實施例中結球甘藍和油菜花序采摘自鎮江農科所試驗田，品種不限。(2)培養基配制包括小孢子不同培養階段的培養基，其組分與各組分在每升培養基中所含的重量為
B5洗滌培養基B5液體培養基IL+蔗糖30 g/L, pH 6. 0，高溫高壓滅菌；其中， B5 液體培養基，以 IL 計，組成為=NaH2PO4·2Η20 169. 5mg, KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7Η20 500mg，MnSO4·4Η20 IOmgj H3BO3 3mg，ZnSO4·7Η20 2mg，KI 0. 75mg， Na2MoO4*2H20 0. 25mg，CuSO4·5Η20 0. 025mg，CoC12*6H20 0. 025mg，Na2-EDTA 37. 3mg， FeS04*7H20 27.8mg，CaCl2. 2H20 150mg，VB1 IOmgj VB6 lmg, VPP lmg,肌醇 IOOmg 和余量的蒸餾水。
NLN-13誘導培養基NLN液體培養基IL+蔗糖130 g/L, pH 6. O,過濾滅菌；
其中，NLN 液體培養基，以 IL 計，由 KNO3 125mg, Ca (NO3) 2·4Η20
500mg, MgSO4·7Η20 125mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4lH2O 18. 95mg, ZnS04*7H20 8. 6mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuSO4*5H20 0. 025mg, CoC12*6H20 0. 025mg,維生素 BI 0. 5mg, 維生素 B6 0. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4·7Η20 27. 8mg,肌醇 lOOmg,甘氨酸2mg,煙酸5mg, L-谷氨酰胺800mg,谷胱甘肽30mg,維生素B5 5mg,絲氨酸 IOOmg和余量的無菌水組成。胚狀體固體分化培養基B5培養基+蔗糖20 g/L,瓊脂10 g/L, pH 6. O,高溫高壓滅菌；
生根培養基MS培養基+蔗糖30 g/L,瓊脂6 g/L, pH 5. 8，高溫高壓滅菌；
其中，MS 培養基，以 IL 計，由 NH4H03 1650 mg, KN03 1900 mg, CaC12*2H20 440 mg, KH2P04 170 mg, MgS04*7H20 370 mg, FeS04*7H20 27. 8 mg, Na2EDTA 37. 3 mg, H3BO3 6. 2 mg, MnSO4eH2O 16. 9 mg, ZnSO4·7Η20 8. 6 mg, Na2MoO4·2Η20 O. 25 mg, CuSO4·5Η20 O. 025 mg, CoC12.6H20 O. 025 mg，KI O. 83 mg，肌醇 100 mg，甘氨酸 2 mg，煙酸 0. 5 mg，維生素 BI 0. I mg,維生素B6 O. 5 mg和余量的無菌水組成。本實施例按以下方法培養結球甘藍
步驟一，摘取結球甘藍花序和油菜花序上生長健康、無病蟲害、單核晚期至雙核早期的花蕾作為小孢子培養的供體植株，其中，結球甘藍的花瓣和花藥長度比為O. 8、油菜的花瓣和花藥比為O. 5、將兩種花蕾進行混合，得到甘藍和油菜的混合花蕾，進行滅菌處理用Ig 升汞+IL無菌水配制成滅菌液；把油菜和結球甘藍混合花蕾放入無菌培養皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒10分鐘，再在超凈工作臺上用無菌水蕩洗3次后，備用； 步驟二，在超凈工作臺上將15個(混合花蕾總數，其中油菜花蕾10個)滅菌后的結球甘藍和油菜混合花蕾一并置于無菌燒杯中，加入10mlB5洗滌培養基，用平頭玻璃棒擠碎后研磨成懸浮液，將懸浮液用45Mm無菌濾網過濾到50ml離心管中，蓋緊,600rpm/min離心 3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入IOml B5洗滌培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13誘導培養基40ml、再加入由NLN-13液體培養基+ 瓊脂糖5g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃度為 I X IO5個/mL的小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子懸浮液分裝到60mm塑料無菌培養皿中，每60mm培養皿加4ml小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，后置于32. 5°C恒溫生化培養箱里、黑暗條件下熱激處理I天；后取出置于25°C恒溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養；至肉眼可見胚狀體時， 置于25°C搖床上、黑暗條件下搖動培養20天，得到子葉型胚狀體并發育成熟；
步驟四，將子葉型胚狀體接種至胚狀體分化培養基中，在每天16小時光照、25°C下培養3周至形成胚狀體，將胚狀體切成3塊大小一致的塊，接種至分化培養基中在相同條件下繼續培養至分化，得到再生芽；
步驟五，切取生長健康的再生芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、25°C下進行生根培養；3周后將根生長健壯的苗進行煉苗3天；移栽時用清水洗凈組培苗根部培養基，把植株植于蔬菜育苗專用基質穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養10天后移栽，得到再生植株；
7步驟六，根據植株形態，按照田間觀察的方法區分結球甘藍和油菜的再生植株，即得結球甘藍植株。對比實驗
采用結球甘藍生長健康、無病蟲害的花序作為小孢子培養的供體植株，其余方法與上述步驟相同，得到的結球甘藍植株作為對照植株。分析檢測
取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCalibur流式細胞儀進行倍性分析，檢測實施例植株與對照植株倍性。結果混合培養結球甘藍出胚率為18. 3個/蕾，而對照結球甘藍出胚率僅為2. 4 個/蕾；經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，混合培養最后得到13株結球甘藍小孢子苗，而對照結球甘藍花蕾單獨培養的對照株數為I株。實施例二
本實施例中培養基與實施例一的培養基差別如下，B5液體培養基IL+蔗糖30g/L， pH6. O,高溫高壓滅菌；NLN-13誘導培養基NLN_13液體培養基IL+蔗糖130g/L，pH 6. 1，過濾滅菌；胚狀體固體分化培養基B5培養基+蔗糖20g/L，瓊脂11 g/L, pH 6. 0，高溫高壓滅菌；生根培養基MS培養基+白糖20g/L，瓊脂7g/L，pH 5.9,高溫高壓滅菌；
本實施例按以下方法培養結球甘藍
步驟一，摘取結球甘藍花序和油菜花序上生長健康、無病蟲害、單核晚期至雙核早期的花蕾作為小孢子培養的供體植株，結球甘藍花序的花瓣和花藥長度比為I. 2、油菜花序的花瓣和花藥長度比為為O. 75、將兩種花蕾進行混合，得到甘藍和油菜的混合花蕾，進行滅菌處理用Ig升汞+IL無菌水配制成滅菌液；把油菜和結球甘藍混合花蕾放入無菌培養皿中， 加入滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒11分鐘，再在超凈工作臺上用無菌水蕩洗4次后，備用;
步驟二，在超凈工作臺上將14個(混合花蕾總數，其中油菜花蕾8個)滅菌后的結球甘藍和油菜混合花蕾一并置于無菌燒杯中，加入10mlB5洗滌培養基，用平頭玻璃棒擠碎后研磨成懸浮液，將懸浮液用45Mm無菌濾網過濾到50ml離心管中，蓋緊,900rpm/min離心 3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入IOml B5洗滌培養基，按上述方法再離心I次，棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13誘導培養基40ml、再加入由NLN-13液體培養基+ 瓊脂糖2g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃度為
O.8 X IO5個/mL的小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子懸浮液分裝到90mm塑料無菌培養皿中，每培養皿加IOml小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，后置于33°C恒溫生化培養箱里、黑暗條件下熱激處理2 天；取出置于25°C恒溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養；至肉眼可見胚狀體時，置于25°C搖床上、黑暗條件下搖動培養30天，得到子葉型胚狀體并發育成熟；
步驟四，將子葉型胚狀體接種至胚狀體分化培養基中，在每天16小時光照、25°C下培養2周至形成胚狀體，將胚狀體直接接種至胚狀體固體分化培養基中在相同條件下繼續培養至分化，得到再生芽；
步驟五，切取生長健康的再生芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、25°C下進行生根培養；3周后將根生長健壯的苗進行煉苗5天；移栽時用清水洗凈組培苗根部培養基，把植株植于蔬菜育苗專用基質穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養7天后移栽，得到再生植株；
步驟六，根據植株形態，按照田間觀察的方法區分結球甘藍和油菜的再生植株，即得結球甘藍植株。對比實驗
采用結球甘藍生長健康、無病蟲害的花序作為小孢子培養的供體植株，其余方法與上述步驟相同，得到的結球甘藍植株作為對照植株。分析檢測
取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCalibur流式細胞儀進行倍性分析，檢測實施例植株與對照植株倍性。結果混合培養結球甘藍出胚率為21. 3個/蕾，而對照結球甘藍出胚率僅為2. 8 個/蕾；經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，混合培養最后得到14株結球甘藍小孢子苗，而對照結球甘藍花蕾單獨培養的對照株數為O株。實施例三
本實施例中培養基與實施例一的培養基差別如下，B5液體培養基IL+蔗糖30g/L， pH6. O,高溫高壓滅菌；NLN-13培養基NLN_13液體培養基IL+蔗糖130g/L，pH 6. 1，過濾滅菌；胚狀體固體分化培養基B5培養基+蔗糖20g/L，瓊脂12 g/L, pH 6. O,高溫高壓滅菌； 生根培養基MS培養基+白糖20g/L，瓊脂7g/L，pH 5.9,高溫高壓滅菌；
本實施例按以下方法培養結球甘藍
步驟一，摘取結球甘藍花序和油菜花序上生長健康、無病蟲害、單核晚期至雙核早期的花蕾作為小孢子培養的供體植株，結球甘藍花序的花瓣和花藥長度比為I. I、油菜花序的花瓣和花藥長度比為O. 75、將兩種花蕾進行混合，得到甘藍和油菜的混合花蕾，進行滅菌處理用Ig升汞+IL無菌水配制成的滅菌液；把混合花蕾放入無菌培養皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒12分鐘，再在超凈工作臺上用無菌水蕩洗5次后，備用；
步驟二，在超凈工作臺上將16個(混合花蕾總數，其中油菜花蕾11個)滅菌后的結球甘藍和油菜混合花蕾一并置于無菌燒杯中，加入10mlB5洗滌培養基，用平頭玻璃棒擠碎后研磨成懸浮液，將懸浮液用45Mm無菌濾網過濾到50ml離心管中，蓋緊,700rpm/min離心 5min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入10mlB5洗滌培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13誘導培養基40ml、再加入由NLN-13液體培養基+瓊脂糖3. 5g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃度為
I.2 X IO5個/mL的小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子懸浮液分裝到60mm塑料無菌培養皿中，每60mm培養皿加4ml小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，置于32. 5°C恒溫生化培養箱里、黑暗條件下熱激處理3天；取出置于25°C恒溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養；至肉眼可見胚狀體時，置于 25°C搖床上、黑暗條件下搖動培養25天，得到子葉型胚狀體并發育成熟；
步驟四，將子葉型胚狀體接種至胚狀體固體分化培養基中，在每天16小時光照、25°C 下培養2. 5周至形成胚狀體，將胚狀體切成2塊大小一致的塊，再接種至分化培養基中在相同條件下繼續培養至分化，得到再生芽；
步驟五，切取生長健康的再生芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、25°C下進行生根培養；3周后將根生長健壯的苗進行煉苗4天；移栽時用清水洗凈組培苗根部培養基，然后把植株植于蔬菜育苗專用基質穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養9天后移栽， 得到再生植株；
步驟六，根據植株形態，按照田間觀察的方法區分結球甘藍和油菜的再生植株，即得結球甘藍植株。對比實驗
采用結球甘藍生長健康、無病蟲害的花序作為小孢子培養的供體植株，其余方法與上述步驟相同，得到的結球甘藍植株作為對照植株。分析檢測
取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCalibur流式細胞儀進行倍性分析，檢測實施例植株與對照植株倍性。結果混合培養結球甘藍出胚率為17. 6個/蕾，而對照結球甘藍出胚率僅為1.3 個/蕾；經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，混合培養最后得到17株結球甘藍小孢子苗，而對照結球甘藍花蕾單獨培養的對照株數為3株。發明方法共培養結球甘藍出胚率最高達21. 3個/蕾，而對照結球甘藍出胚率最高僅為2. 8個/蕾，經植株形態鑒定及流式細胞儀檢測可知，在相同的條件下混合培養最多可以得到17株結球甘藍小孢子苗，而單獨培養的對照株數為3株。用本發明的方法解決了結球甘藍小孢子培養胚胎發生頻率低的問題，提高了小孢子培養技術的利用效率。除上述實施外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
權利要求
1.一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，包括以下步驟步驟一，取結球甘藍和油菜花序上的花蕾進行混合，得到甘藍和油菜的混合花蕾，進行滅菌處理；步驟二，在滅菌后的混合花蕾中加入B5洗滌培養基后研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入35 45ml的NLN-13誘導培養基、8 12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；步驟三，將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下32 33 1熱激處理I 3天后，移至黑暗、溫度為25±2 °C的條件下培養20 30天，得到子葉型胚狀體；步驟四，將子葉期胚狀體接種至胚狀體固體分化培養基中，每天光照15±3小時、溫度 23±3°C下培養，直至分化，得到再生芽；步驟五，切取所述再生芽轉接至生根培養基培養出苗后，按常規方法進行煉苗和移栽， 得到再生植株；步驟六，根據植株形態，按照田間觀察的方法區分結球甘藍和油菜的再生植株，即得結球甘藍植株。
2.根據權利要求I所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述步驟一中，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾，結球甘藍花蕾的花瓣和花藥長度比為0.8 I.2，油菜花蕾的花瓣和花藥長度比為O. 5 O. 75。
3.根據權利要求I所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述步驟二中，所述的B5洗滌培養基由B5液體培養基IL和蔗糖30g組成；所述的NLN-13誘導培養基由NLN液體培養基IL和蔗糖130 g組成，pH 6. O 6. 2 ;所述的活性炭混合液由NLN液體培養基1L、瓊脂糖2 5g和Ig活性炭組成。
4.根據權利要求3所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述的 B5 液體培養基以 IL 計，組成為NaH2PO4·2Η20 169. 5mg, KNO3 2500mg, (NH4) 2S04 134mg, MgSO4·7Η20 500mg, MnSO4·4Η20 IOmg, H3BO3 3mg, ZnSO4·7Η20 2mg, KI 0. 75mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuSO4*5H20 0. 025mg, CoC12*6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37. 3mg, FeSO4*7H20 27.8mg, CaCl2. 2H20 150mg, VB1 IOmg, VB6 lmg, VPP lmg,肌醇 IOOmg 和余量的蒸餾水；所述的NLN液體培養基，以IL計，由KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4Η20 500mg， MgSO4*7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6. 2mg，MnSO4eH2O 18. 95mg，ZnSO4·7Η20 8. 6mg， Na2MoO4CH2O 0. 25mg, CuSO4AH2O 0. 025mg, CoC12WH2O 0. 025mg，維生素 BI 0. 5mg，維生素 B6 0. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4·7Η20 27. 8mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸2mg,煙酸5mg, L-谷氨酰胺800mg,谷胱甘肽30mg, VB5 5mg,絲氨酸IOOmg和余量的無菌水組成。
5.根據權利要求3所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述過濾得沉淀步驟進行I 2次，所述小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為O. 8X IO5 I. 2X IO5 個 /mL。
6.根據權利要求I所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述步驟三中，熱激處理后小孢子混合懸浮液移至避光、溫度為25±2 °C的條件下培養20 30天期間，當肉眼可見胚狀體時，再于相同條件下進行振蕩培養。
7.根據權利要求I所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述步驟四中，所述胚狀體固體分化培養基由B5培養基1L、蔗糖20g和瓊脂10 12g組成，pH5. 8 ·6.1。
8.根據權利要求I所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述步驟五中生根培養基由MS培養基IL、蔗糖或白砂糖20 30g和瓊脂7 9g組成，pH 5. 8 6.O。
9.根據權利要求8所述提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，其特征在于所述的MS 培養基，以 IL 計，由 NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2Η20 440 mg，KH2PO4 170 mg, MgSO4*7H20 370 mg，FeS04.7H20 27. 8 mg, Na2EDTA 37. 3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4.H2O 16. 9 mg, ZnSO4*7H20 8. 6 mg, Na2MoO4*2H20 0. 25 mg, CuSO4*5H20 0. 025 mg, CoC12*6H20 0. 025 mg,KI 0. 83 mg,肌醇 100 mg,甘氨酸 2 mg,煙酸 0. 5 mg,維生素 BI O. I mg,維生素 B6 0.5 mg和余量的無菌水組成。
全文摘要
本發明涉及一種提高農作物胚胎出生率的培養方法，尤其是一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，屬于植物培養技術領域。本發明利用小孢子培養技術將結球甘藍和油菜小孢子共同培養，使結球甘藍的出胚率顯著提高，解決了結球甘藍小孢子培養胚胎發生頻率低的問題。
文檔編號A01H4/00GK102577962SQ20121004724
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者姚悅梅, 張振超, 戴忠良, 潘永飛, 潘躍平, 秦文斌, 肖燕 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所, 鎮江瑞繁農藝有限公司