專利名稱：一種堆肥發酵濾液對土壤線蟲多樣性的防控方法
技術領域：
本發明屬于環境保護技術領域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種的應用。更具體的說是一種堆肥發酵濾液對土壤線蟲多樣性的防控方法。
背景技術：
堆肥化(Composting)是指在有控制的條件下，使有機廢棄物在微生物(主要為細菌)作用下，發生降解，并同時使有機物向穩定的腐殖質方向轉化的過程。堆肥化后的產物稱之為堆肥(Compost)。堆肥過程可以將混合物的體積有效地減少40%-50%，并且可以依靠在高溫階段中代謝產生的熱量殺死垃圾中的病原物質。堆肥不是一項新的技術，但用這種方法處理城市固體垃圾，符合環境的利益，因為在堆肥過程中清除或者減少了城市固體垃圾中的毒性并使得最終的產物可以被用來進行再利用。堆肥的程序包括原料的預處理、原料發酵和后處理，堆肥過程受水分、氧含量、C/N比、溫度、pH和通風情況等因素的影響。微生物種類繁多，自然界中僅有極少數的微生物得到鑒定，能夠存活、培養的種類更是少之又少，至多為微生物總量的1%。目前，國內外對于堆肥中的微生物進行了一系列理論和實踐的研究。對于應用堆肥可能出現的環境問題也已經引起了人們的重視，但如何解決這些問題還缺少細致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的質量，解決堆肥應用過程中可能產生的環境問題一直是相關科研人員研究關注的熱點。對于堆肥中的微生物組成及堆肥過程中的微生物變化的研究已有諸多報道，但對于將堆肥中微生物分離、應用于其他基質的研究卻少有報道。蘇云金芽孢桿菌是目前國際上生產量最大并成功地用于防治農、林、貯糧害蟲和一些衛生害蟲的微生物殺蟲劑，蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的同時，可以形成一種由殺蟲晶體蛋白組成的伴孢晶體，它的主要殺蟲活性成分是伴孢晶體蛋白。研究發現，這種蛋白對多種農林害蟲具有特異性殺傷作用。昆蟲取食芽孢晶體混合物后，晶體在昆蟲體內的中腸堿性環境和蛋白酶的作用下被降解形成殺蟲活性蛋白，研究結果表明這些毒蛋白單獨作用或不同蛋白間協同作用對昆蟲具有不同程度的毒殺作用，進一步加強蘇云金芽孢桿菌在防治和控制害蟲危害方面的研究，對于保護人類生存環境實現可持續發展具有重大意義。蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是目前產量最大、使用最廣的生物殺蟲劑。 關于采用蘇云金芽孢桿菌發酵濾液用來調節草坪基質線蟲的方法尚為見文獻報道。線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物，其寄生范圍廣，環境適應性強，幾乎每種作物都受到線蟲的侵害。隨著人們環保意識的增強，利用殺線蟲微生物開發生物殺線蟲劑，具有十分巨大的經濟效益與環境效益。目前國內外已有研究報道說明不同的微生物對線蟲的活動有抑制作用。黃福常等研究發現不同濃度，不同PH值的黑曲霉發酵濾液均具有殺線作用，其中以發酵原液PH為3. O時殺線效果最佳，其殺線作用為100%。Neidig等研究發現熒光假單胞菌的次生代謝產物對食細菌類線蟲有強烈的抑制作用，從而減少土壤中細菌的天敵數量。徐華潮等(2010)在室內條件下測定了 17株蘇云金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白對松材線蟲的殺線活性，發現菌株020、RBT-200701的伴胞晶體蛋白對松材線蟲有明顯的毒殺作用，其校正死亡率分別大于80%和70%。本實驗通過向草坪土壤基質中加入蘇云金芽孢桿菌的發酵過濾液，研究了不同堆肥微生物過濾液對土壤線蟲的影響，為土壤線蟲的生物防治提供依據。
發明內容
本發明采用的蘇云金芽孢桿菌(拉丁名feci77w5·菌種保藏號CFCC10206，保藏單位中國林業微生物菌種保藏管理中心，對外可以提供。生理生化特性細胞呈革蘭氏陽性，桿狀，大小為I. 0-1. 2X3-5 μ m。形成半孢晶體，對阿拉伯糖甘露醇不產酸產淀粉酶，硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。蘇云金芽孢桿菌毒性對人、畜低毒，大鼠口服急性LD5tl 852. 7-856. 7毫克/公斤， 對家禽、鳥類、魚、畜等低毒。本發明將配制成不同濃度的蘇云金芽孢桿菌發酵濾液接種到草坪建植體系中。通過研究不同濃度的蘇云金芽孢桿菌發酵濾液對土壤線蟲的防治方法，為草坪植物的建植提供依據。為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案
一種堆肥發酵濾液對土壤線蟲多樣性防控方法，其特征在于按如下的步驟進行
(I)蘇云金芽孢桿菌的分離蘇云金芽孢桿菌本身有市售；也可以分離自天津小淀垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥；本發明從生活垃圾堆肥所得到的蘇云金芽孢桿菌生理生化性質與市售的蘇云金芽孢桿菌相同，分離的方法如下
1)將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養基上，每一稀釋度重復三次，無菌水為空白對照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養基的平板倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天；
2)蘇云金芽孢桿菌發酵液的制備
A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養；選用600nm波長進行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制微生物的生長曲線；根據生長曲線獲得微生物生長至穩定期的時間，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每mL菌液中的活菌數；
B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號液體培養基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培養8 12 h至穩定期，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每 mL菌液中的活菌數，將穩定期的菌液進行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發酵后的過濾液；其中蘇云金芽孢桿菌的菌落數(個)
權利要求
1.一種堆肥發酵濾液對土壤線蟲多樣性的防控方法，其特征在于按如下的步驟進行(I)蘇云金芽孢桿菌的分離1)將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養基上，每一稀釋度重復三次，無菌水為空白對照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養基的平板倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天；2)蘇云金芽孢桿菌發酵液的制備A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養，選用600nm波長進行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制微生物的生長曲線，根據生長曲線獲得蘇云金芽孢桿菌生長至穩定期的時間；B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號液體培養基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培養8 12 h至穩定期，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每 mL菌液中的活菌數，將穩定期的菌液進行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發酵后的過濾液；3)稀釋蘇云金芽孢桿菌發酵液取一部分過濾液分別稀釋至4倍濾液和8倍濾液，備用；4)堆肥發酵濾液對土壤線蟲防控以高14cm直徑20cm塑料花盆為容器構建草坪建植體系，每個花盆中分別加入2kg草坪土壤,播種飽滿的高羊茅草種3g，待草坪植物生長5cm時，分別向花盆中加入IOml蘇云金芽孢桿菌發酵液，草坪培植75d后，分離鑒定各處理線蟲的種類及數量，分析線蟲多樣性特征；其中的純化培養2代培養指的是用接菌環直接挑起待純化的菌落，接種到事先準備好的高氏一號平板固體培養基中，在平板上自左向右輕輕劃線，將培養皿倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天，此過程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復此過程為純化二代。
全文摘要
本發明公開了一種堆肥發酵濾液對土壤線蟲防控的方法，它是在直徑為6.5cm的培養皿中加入30g草坪土壤，分別向土中加入150μl不同濃度的含有蘇云金芽孢桿菌的堆肥微生物發酵濾液，對照組加入無菌液體培養基，每個培養皿中均勻的撒入50粒飽滿的高羊茅種子，室溫種植，待種子萌發后測定各項指標。實驗結果表明向草坪土壤基質中加入蘇云金芽孢桿菌發酵液不僅可以抑制土壤線蟲的總量，抑制植物寄生類線蟲的生長，改變土壤線蟲的群落組成，同時可以增強草坪植物的抗逆性，促進草坪植物的生長。
文檔編號A01N63/02GK102599195SQ20121005198
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者多立安, 程田, 趙樹蘭 申請人:天津師范大學