專利名稱：一種微生物殺菌劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物殺菌劑及其應用，屬于微生物農藥技術領域。
背景技術：
生物農藥是指利用生物活體或其代謝產物針對農業有害生物進行殺滅或抑制的制劑。微生物農藥是指由微生物及其代謝產物加工而成的具有殺蟲、殺菌、除草、殺鼠或調節植物生長等具有農藥活性的物質。微生物農藥防治病蟲害效果好，對人畜無毒，不污染環境，無殘留，能保持農產品的優良品質，對害蟲天敵和有益生物安全，有助于保持生態平衡， 原料主要為農副產品，來源廣泛，生產過程安全。其品質可通過現代生物技術對發酵工藝和菌種純化、改良、基因重組得到改進和提高。微生物殺菌劑包括農用抗生素和抗病微生物， 是生物農藥研究的重要內容。抗病微生物可通過抗生、競爭、溶菌等作用來抑制、甚至殺滅病原微生物。在生物防治逐漸成為植物病害防治研究熱點的今天，細菌作為自然界中分布最為廣泛的一類微生物，以其繁殖速度快、適應能力強、易于培養等優勢，受到微生物工作者越來越多的關注。由于細菌的種類多，數量大，繁殖迅速，在占領空間及生存競爭方面占絕對優勢，故此在自然界大量存在，并且在農業生態系統中作為植物根際及地上部分微生物群落的重要成員，不少細菌具有防病作用，有些類群能促進植物生長，某些菌株兼具防病和促生效果。中國是農業大國，病蟲草害的防治是農業生產中的重要環節，目前對農作物病害防治仍主要依靠化學殺菌劑，但隨著科學技術發展，研究發現化學農藥在防治病害的同時， 對環境的污染越來越嚴重，同時化學農藥往往毒性高，殺傷天敵，破壞生物多樣性，為更嚴重的病蟲害猖獗發生提供了條件，造成病蟲害防治上的惡性循環。連續用藥造成的農藥殘留對人體產生危害以及病原菌抗藥性正引起人們極大的關注。農植物病蟲害的化學防治與保護生態環境，保障人民健康形成的矛盾越來越引起關注。微生物農藥對人畜安全，易于分解，與環境相容，被譽為“無公害”農藥。此外，微生物農藥還具有研究周期短、投入低、易于工業化和商品化開發的優勢。自上個世紀90年代以來，微生物農藥每年以20%速度遞增， 已經成為農業生物技術產業中的研究開發熱點。
發明內容
本發明的目的之一是提供一株抑菌強、殺菌譜廣的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌 BaciIlus amyloliquefaciens。本發明的目的之二是提供含有上述解淀粉芽孢桿菌的微生物殺菌劑。本發明的目的之三是提供含有上述解淀粉芽孢桿菌的拮抗細菌發酵液的制備方法。本發明的目的之四是提供上述解淀粉芽孢桿菌在防治農作物真菌中的應用。本發明實現過程如下發明人從陜西秦嶺山脈篩選到一株對水稻稻瘟病和番茄灰霉病等多種病原真菌具有很好毒殺功能的解淀粉芽孢桿菌。該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類學命名為解淀粉芽孢桿菌地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期2011年4月21日；保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 4777。本發明解淀粉芽孢桿菌菌體呈桿狀，單生，周生鞭毛，產芽孢，革蘭氏染色呈陽性； 在LB培養基上解淀粉芽孢桿菌菌落呈圓形，表面有明顯光澤，不光滑；邊緣不規則，有擴散，表面褶皺；菌落呈乳白色，不透明，沉淀、渾濁；具有一定的粘附性。培養前期菌落呈無色透明液滴，有光澤；后期呈白色不透明狀，較為暗淡，菌體桿狀，O. Γ2. 9umXl. fllum，單生或雙生，周生鞭毛，芽孢卵圓。 含有解淀粉芽孢桿菌發酵液的制備方法，包括下述步驟，
(1)固體培養基的制備取黃豆餅粉3-4g，葡萄糖10g，K2HP045.3g，瓊脂17_20g，水lg， 加熱熔化，調pH至6. 5，過濾，滅菌，冷卻得固體培養基；
(2)菌落的制備將解淀粉芽孢桿菌l_5mg接種于上述固體培養基中在31°C下培養48 小時，得菌落；
(3)制作培養液取淀粉20g，蛋白胨20g，NaCl5. 0g，水lg，加熱熔化，調pH至7. 2，過濾，滅菌，冷卻得培養液；
(4)種子液的制備取單菌落接種于培養液內，32°C培養48h，制成種子液；
(5)解淀粉芽孢桿菌發酵液的制備取種子液16mg接種于培養液中，32°C培養48h即可。本發明篩選得到的解淀粉芽孢桿菌抑菌強、殺菌譜廣，該菌株對稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、蘋果腐爛病菌、辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果霉心病菌和楊樹潰瘍病菌等10多種病原真菌具有很強的拮抗作用，殺菌譜廣，其中對稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率高達93. 5%以上。此外，該解淀粉芽孢桿菌具有很強的抗逆性，對酸堿具有很強的抗性，在80°C以上高溫下依然能夠存活，菌株生長迅速， 容易培養，非常適合作為微生物殺菌劑。
具體實施例方式實施例I拮抗菌株的單孢分離
選擇殺菌譜廣且拮抗性較好的菌株進行單孢分離，具體步驟如下
(1)制作培養基平板；
(2)將菌株(不帶培養基)加入到IOml的無菌水中制成I:10的菌懸液，充分振蕩10分鐘，然后取出Iml加入9ml無菌水中制成10_2的菌懸液，依此類推，制成10'10_4、10_5、10_6 的菌懸液；
(3)用移液槍分別取稀釋后的菌懸液O.5ml加到培養基平板上，用刮刀涂均勻，每處理設3個重復。30°C培養7h;
(4)選取出現5-20個菌落的皿，給菌落編號，分別將單孢菌落挑入LB斜面上培養3d后放入4 C保減箱并保存。用生長速率法測定每個單孢菌的發酵濾液的拮抗性，選出拮抗性最好的菌株作為目標菌株。單孢菌的拮抗篩選獲得一株抑菌強、殺菌譜廣的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌。該解淀粉芽孢桿菌對稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、蘋果腐爛病菌、辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果霉心病菌和楊樹潰瘍病菌等10多種病原真菌具有很強的拮抗作用，殺菌譜廣，其中對稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率高達93. 5%以上。此外，該解淀粉芽孢桿菌具有很強的抗逆性，對酸堿具有很強的抗性， 在80°C以上高溫下依然能夠存活，菌株生長迅速，容易培養，非常適合作為微生物殺菌劑。實施例2拮抗細菌解淀粉芽孢桿菌EC5tl的測定
EC50即指半數有效濃度，是指引起50%試驗生物產生某一特定反應，或是某反應指標被抑制一半時的濃度。以稻瘟病為測定對象
O培養稻瘟靶標菌，制備菌餅；
2)解淀粉芽孢桿菌液體發酵，過濾得上清液，稀釋一系列濃度10ul/ml、20ul/ml、40ul/ ml、80ul/ml、160ul/ml，每個濃度各取I. 5ml，加入到13.5ml PDA制備帶毒培養基，此時發酵液的濃度為 lul/ml、2ul/ml、4ul/ml、8ul/ml、16ul/ml ；
3)移植菌餅于帶毒培養基，同時取I.5ml無菌水作為對照，每個處理重復3次，在28°C 下培養3天；
十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率；
-Jrhifcil對照菌洛直位 _處理菌格直徑 I ΛΛ
抑制畢=->.100
對照菌落直徑 -5imn
將抑制率換成機率值，以濃度對數為橫坐標，機率值為縱坐標，用作圖法求出EC5tl，結果如表I所示。
表i 解淀粉芽孢桿菌的EC51權利要求
1.一株具有抑菌作用的解淀粉芽孢桿菌，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌 amyloliquefaciens,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 4777。
2.根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于該菌株具有以下特性菌體呈桿狀，單生，周生鞭毛，產芽孢，革蘭氏染色呈陽性；在LB培養基上菌落呈圓形，表面有明顯光澤，不光滑，邊緣不規則，有擴散，表面褶皺；菌落呈乳白色，不透明，沉淀、渾濁，具有粘附性；培養前期菌落呈無色透明液滴，有光澤，后期呈白色不透明狀，暗淡，菌體桿狀，單生或雙生，周生鞭毛，芽孢卵圓。
3.含有權利要求I所述解淀粉芽孢桿菌的微生物殺菌劑。
4.含有權利要求I所述解淀粉芽孢桿菌的發酵液。
5.權利要求4所述含解淀粉芽孢桿菌發酵液的制備方法，包括下述步驟，(1)固體培養基的制備取黃豆餅粉3-4g，葡萄糖10g，K2HP045.3g，瓊脂17_20g，水lg， 加熱熔化，調pH至6. 5，過濾，滅菌，冷卻得固體培養基；(2)菌落的制備將解淀粉芽孢桿菌l_5mg接種于上述固體培養基中在31°C培養48小時，得菌落；(3)制作培養液:取淀粉20g，蛋白胨20g，NaCl5.0g，水lg，加熱熔化，調pH至7. 2，過濾，滅菌，冷卻得培養液；(4)種子液的制備取單菌落接種于培養液內，32°C培養48h，制成種子液；(5)解淀粉芽孢桿菌發酵液的制備取種子液16mg接種于培養液中，32°C培養48h即可。
6.權利要求I所述解淀粉芽孢桿菌在防治作物真菌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株抑菌強、殺菌譜廣的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類學命名為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens，保藏編號CGMCCNo.4777。本發明解淀粉芽孢桿菌抑菌強、殺菌譜廣，對稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率高達93.5%以上；該解淀粉芽孢桿菌還具有很強的抗逆性，對酸堿具有很強的抗性，適合作為微生物殺菌劑。
文檔編號A01P3/00GK102604864SQ20121005978
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者何梅俠, 周小軍, 王新安, 董彪 申請人:陜西加倫多作物科學有限公司