專利名稱：可防治棉花黃萎病的大麗輪枝菌弱毒菌株Vd171及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病理學，具體涉及可防治棉花黃萎病大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71 及其應用。
背景技術：
棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的一種土傳維管束病害，廣泛分布于世界各產棉區。20世紀90年代以來，該病在我國各主產棉區爆發成災，年發生面積300萬公頃左右，年經濟損失約12億人民幣，成為發展棉花生產的重要限制因子之一。由于輪作倒茬難，缺乏抗病品種，缺乏具有較好防治效果的農藥，致使目前生產上對黃萎病的防治幾乎是空白。
由于與寄主互作的協同進化、生態環境、病菌的異核現象等原因，棉花黃萎病菌易于變異，常常出現生理分化，產生新的生理型，包括致病力的分化，出現致病力迥異的生理型。1977年全國棉花枯、黃萎病綜合防治研究協作組組織開展“棉花黃萎病菌生理型鑒定聯合試驗”，將我國棉花黃萎病菌劃分為強、弱、中三個生理型，90年代以后，關于致病力分化和落葉型菌株在各地出現的報道又相繼出現。病原菌變異頻繁，導致致病機理復雜、抗病育種滯后、品種抗性喪失快，成為該病防治難度大，爆發成災的主要原因。然而，我們可以嘗試利用大麗輪枝菌的弱毒菌株來研制“植物疫苗”，誘導棉花對黃萎病產生免疫反應，以達到防治黃萎病的目的。
“植物疫苗”是指能誘導植物產生抗性，從而抵抗病原菌入侵，抑制病原微生物生長，使植物免遭病害或減輕病害的ー類生物或非生物的物質，主要有弱毒、無毒株系疫苗， 活菌疫苗，蛋白類疫苗，寡糖疫苗，小分子及其他代謝產物疫苗，轉基因植物疫苗。植物疫苗容易被土壤微生物迅速降解、無殘留，誘導植物產生的抗性成分是植物代謝的正常物質，對人畜安全，而且植物疫苗誘導的植物抗病譜廣、抗病持續時間長、長期多次誘導不會使病原菌產生抗藥性，兼有促進植物生長和提高品質功能，是對環境友好、無污染、發展前景廣闊的新ー類生物農藥，已逐漸成為農作物病害防治的研究熱點。
“植物疫苗”可模仿病毒、細菌、真菌入侵植物細胞，誘導植物產生抗體物質從而產生廣譜抗性，抑制病原物生長。目前已用于糧、果、蔬、飼等80多種作物的600多種病害的防治。生產上應用較多的是小分子代謝物氨基寡糖素，是由3-5個單糖組成的的低聚糖素。 其主要原料來源是蟹殼、蝦殼，經過發酵分解、蘋取、提純等エ藝而制得。國內在棉花上登記的用于防治棉花黃萎病此類制劑是北海國發海洋生物農藥有限公司生產的0. 5%氨基寡糖素水劑，2001年和2002年，在中國農業科學院棉花研究所承擔國家農藥登記試驗中(任務來源于農業部農藥鑒定所)，對棉花黃萎病的防治效果為29. 96% 40. 64%，在2003年的大面積試驗中防治效果為19.23%。另ー種應用較為廣泛的是“植物激活蛋白”，是利用生物技術從微生物中分離提取的ー種新型結構蛋白，可通過與植物表面受體蛋白的互作，誘導植物的信號傳導，引起植物體內一系列代謝反應，誘導和激活植物自身防衛系統和生長系統，從而產生對病蟲害的抗性，促進植物生長，提高作物產量。國內由同聽綠源(北京)生物科技股份有限公司生產的3%的植物激活蛋白可濕性粉劑，在煙草、葡萄、柑橘、水稻、 大白菜、油菜、茄科作物等獲得登記認證。2008 2009年，我們經田間試驗，對棉花黃萎病的防治效果為34. 9% 38. 5%。目前國內外還沒有利用大麗輪枝菌弱毒菌株來研制植物疫苗，防治棉花黃萎病的報道。
本發明經多年的研究，從大量大麗輪枝菌菌株中篩選獲得一株弱毒菌株，經溫室苗期試驗對棉花黃萎病的防治效果達85.0%，對棉花黃萎病的防治具有巨大的潛能。發明內容
因此，本發明的發明人為解決現有的用于防治棉花黃萎病的植物疫苗，存在的劑型単一，防治效果較差的問題提出并完成本發明。
本發明的目的是提供一種可防治棉花黃萎病大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71。
本發明的再一目的是提供ー種棉花黃萎病疫苗。
本發明的再一目的是提供一種防治棉花黃萎病的方法。
本發明的發明人于2007年 2010年，從我國新疆、河南、河北、山東等12個省84個縣(市)采集387個棉花黃萎病病株樣品，分離獲得308個棉花黃萎病野生菌株，通過篩選、鑒定、溫室的生物測定，獲得ー株在棉花上致病力極弱的大麗輪枝菌菌株 Vdl71 (Verticillium dahliae)，其保藏編號為=CGMCC No. 5903。該菌株可作為疫苗，誘導棉花對棉花黃萎病產生免疫作用，對棉花黃萎病的防治效果達85.0%，且能促進棉花的生長發育，對人畜無毒害作用，對環境無污染。
棉花黃萎病菌大麗輪枝菌在普通的PDA培養基上，存在菌絲型、菌核型、中間型等不同類型，其培養性狀也容易受培養條件的影響，傳統的以形態學為基礎的分類鑒定有時候會受到限制。分子生物學的發展給微生物的分類鑒定提供了新的有效措施，該發明以傳統的形態學鑒定為基礎，結合分子生物學的手段，對篩選到的菌株進行鑒定，最后獲得目的菌株。
用于植物病害防治的植物疫苗，應該易于被植株吸收、對環境友好、無污染等特點。棉花黃萎病是ー種維管束真菌病害，病原菌從棉株的根尖侵染，通過維管束向上運輸、 擴展蔓延，危害棉花。本發明獲得的疫苗菌株和引起棉花黃萎病的致病菌同屬于大麗輪枝菌，具有相同的生態習性、侵染棉花的方式及在棉花中的擴展途徑。因此，利用該菌株作為疫苗控制棉花黃萎病，能順利侵染棉花并在棉花植株內定殖。
本發明獲得的疫苗菌株Vdl71，通過蘸根接種分生孢子懸浮液，易于在植株根表定埴，成功侵染棉花，并在植株體內擴展，誘導植株產生免疫反應，抵抗黃萎病危害。
利用大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71作為疫苗來控制棉花黃萎病在以下三方面產生有益效果。
I. Vdl71能夠在人工培養基上培養，容易獲得和培養，用于病害防治的疫苗菌株必須能夠在人工培養基上培養，以利于エ廠化生產和推廣應用。VD171是ー株來自棉花的大麗輪枝菌弱毒菌株，在PDA、查氏及棉籽培養基上生長良好，有利于大量繁殖和推廣應用。
2. Vdl71對棉花黃萎病控制效果好，先接種Vdl71，4天后接種大麗輪枝菌，對棉花黃萎病的防治效果達到97.2%，對黃萎病有顯著的控制作用，與生產上應用較多的枯草芽抱桿囷相比，防治效果提聞50左右。
3. Vdl71為環境友好型疫苗菌株，VD171分離自棉花，土壌中自然存在，對棉花致病カ極弱，對人畜、昆蟲和作物安全，對環境無污染。
圖I為Vdl71在PDA上生長情況，A :菌落形態，B :分生孢子；
圖2為Vdl71經大麗輪枝菌特異引物的擴增結果，A P1/P2引物擴增結果，B VDS1/VDS2引物擴增結果；泳道I為Vd991，泳道2為Vdl71，泳道3為Gnlll (Gibellulopsis nigrescensノ。
圖3Vdl71對棉花黃萎病的控制作用，1-1，冀棉11播種后18天接種Vdl71，4天后接種大麗輪枝菌強毒カ菌株Vd991 ;1-2，魯棉研21播種后18天接種Vdl71，4天后接種大麗輪枝菌強毒カ菌株Vd991 ;2-1，冀棉11播種后22天接種大麗輪枝菌強毒カ菌株Vd991 ； 2-2，魯棉研21播種后22天接種大麗輪枝菌強毒カ菌株Vd991 ；
大麗輪枝菌Vdl71 (Virticillium dahliae),于2012年3月15日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是CGMCC No. 5903。
具體實施方式
實施例I菌株的分離
(一)樣品采集
2007年 2009年，于我國新疆、河南、河北、山東等12個省84個縣(市)采集387 個棉花黃萎病病株樣品，分離獲得308個棉花黃萎病野生菌株。
( ニ)菌株的分離
先將采集到的樣品(棉花莖桿)用清水洗浄，去皮，置于直徑為9cm的滅菌的培養皿中，用75%的酒精消毒lmin。再用5. 0%的次氯酸鈉進行消毒60s，用滅菌水洗3次，每次時間不少于3min。然后用滅菌的吸水紙沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0. 4cm長的小段，置于9cm的培養皿中，25°C培養。對疑似大麗輪枝菌的菌落，及時轉移至直徑為6cm 的培養皿中培養，然后觀察其菌落大小、顏色、表面特征、質地。
(三)Vdl7I的特征
I.形態特征
在PDA平板上，Vdl71的菌落為白色，邊緣整齊，表面致密，有同心輪文，不產生黑色微菌核。顯微鏡下觀察，菌絲寬約為I. 94±0. 39 iim，產生輪枝狀分生孢子，每輪2-3個分枝，分生孢子為卵圓形，大小為4. 33±0. 55X2. 20±0.48(長X寬)(圖I)。
2.生理特征
Vdl71在5_35°C條件下均能生長，最適生長溫度是30°C。在5、10、15、20、25、30、 35°C條件下的菌落直徑分別為0. 0,3. 0,6. 8,32. 8,47. 2，52. 5和27. 5mm。30°C下，菌落直徑最大。
3.分子特征
采用大麗輪枝菌核糖體ITS區段特異引物(Pl，5 ' -CATCAGTCTCTCT GTTTATACCAACG-3 ’ /P2，5 ’ -CGATGCGAGCTGTAAC TACTACGCAA-3 ’ )和(VDS15' -CACATTCAGTTCAGGAGACGGA-3' /VDS25' -CCTTCTACTGGAGTATTTCGG-3')進行 PCR 擴增，結果表明，均獲得特異的目的條帶。
依據Vdl71形態特征、生理特征和分子鑒定結果，將Vdl71歸屬為Verticillium dahliae。
(四)培養基及培養條件
I. PDA 培養基
馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15-20克，水I升，自然pH。稱取削皮的200g馬鈴薯，切成小塊置于鍋中加水煮爛(煮沸20-30分鐘)，用紗布過濾后，濾液中加入葡萄糖和瓊脂繼續加熱攪勻，稍冷卻后再補水至1L，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20分鐘。
2.查彼(Czapek)液體培養基
KNO3, 2. OOg ；K2HPO4,1. OOg ；KCI,0. 50g ；MgS04. 7H20，0. 50g ；FeS04. 7H20，0. Olg ；蔗糖，30. OOg ;加水至1L，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20分鐘。
3.棉籽培養基
將帶短絨的棉籽煮5分鐘，浸泡6小時使棉籽吸足水分，撈出淋干水分，放入克氏瓶中，120°C滅菌30分鐘。
280C，黑暗培養15d。液體培養需要置搖床150rpm，震蕩培養。
實施例2VD171對棉花黃萎病的控制作用
I.試驗方法
以耐病品種魯棉研21和感病品種異棉11為供試品種，米用輕石沙土定量廳囷液法。將滅菌后的蛭石和沙子按6 : 4混合,做直徑6cm的無底紙缽,放置45cmX 35cm的塑料盤內，每缽播種棉花種子8粒，出苗后留苗5株，每品種15個缽，每5個缽為ー個重復，3 次重復。棉花播種后，將塑料盤置溫室中，待棉苗長一片真葉，根據試驗設置接種孢子懸浮液IOml，孢子濃度為I X IO7個孢子/ml。接種方法為，將IOml孢子懸浮液倒入直徑IOcm的培養皿中，將紙缽從塑料盤中取出放置在培養皿中40s，待孢子懸浮液被吸干后，將紙缽放回塑料盤中。棉苗置18°C_28°C的溫室中，按5級分級標準進行病害的分級調查。計算病株率、病情指數和防治效果。
2.試驗結果
2009和2010年在溫室的試驗結果表明，先接種Vdl71，4天后再接種強致病力的大麗輪枝菌菌株Vd991，在冀棉11和魯棉研21上的平均病指分別為8. 9和8. 4，極顯著低于直接接種大麗輪枝菌強致病カ菌株Vd991 (70. 9和48. 0);在冀棉11上兩年的防治效果分別為90. 3%和84. 5%，在魯棉研21上兩年的防治效果分別為78. 9%和86. 3%，平均防治效果達85. 0%。只接種Vdl71處理的棉苗，在冀棉11上的平均病株率和平均病指為9. 6 和2. 8，在魯棉研21上沒有表現病害癥狀，表明該菌株對棉花的致病カ極弱。接種疫苗菌株Vdl71的棉苗，株高也較直接接種Vd991及清水對照顯著高。表明Vdl71不僅對棉花黃萎病有很好的防治效果，且有促進棉花生長發育的作用(圖4，表1-1、表1-2)。
表1-1 Vdl71對棉花黃萎病的控制作用
權利要求
1.大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71，其保藏編號為CGMCCNo. 5903。
2.權利要求I所述大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71的應用。
3.權利要求I所述大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71在防治棉花黃萎病中的應用。
4.權利要求I所述大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71的培養方法，其特征在于，在PDA培養基、查彼液體培養基或棉籽培養基28°C黑暗培養15天。
5.一種棉花黃萎病疫苗，其特征在于，包括權利要求I所述大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71。
6.一種防治棉花黃萎病的方法，其特征在于，包括為棉花接種權利要求I所述大麗輪枝菌弱毒菌株Vdl71的步驟。
全文摘要
本發明涉及植物病理學，具體地涉及大麗輪枝菌弱毒菌株Vd171及其在棉花黃萎病防治中的應用。本發明從棉花黃萎病菌弱毒菌株入手，通過分離、篩選、鑒定、溫室的生物測定，獲得對棉花黃萎病具有顯著控制作用的菌株Vd171(Verticillium dahliae)，其保藏編號為CGMCC No.5903。Vd171能夠在人工培養基上培養，容易獲得和培養，以利于工廠化生產和推廣應用。對黃萎病控制效果好，先接種Vd171，4天后接種大麗輪枝菌強毒菌株Vd991，對棉花黃萎病的防治效果達到85.0％，對黃萎病有顯著的控制作用，與生產上應用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高50％左右，對人畜、昆蟲和作物安全，環境友好。
文檔編號A01P3/00GK102634461SQ201210099459
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月6日 優先權日2012年4月6日
發明者馮自力, 師勇強, 朱荷琴, 李志芳, 趙麗紅 申請人:中國農業科學院棉花研究所