專利名稱：棉花黃萎病和枯萎病的抗性表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中生物體轉化技術。即將GAFP基因的表達載體通過花粉管通道法或者農桿菌介導法導入白棉或彩色棉花，通過目的基因GAFP的表達，賦予轉基因棉花抗枯萎病和黃萎病的特性。
背景技術：
枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)和黃萎病菌(Vecticilliumdahliae kleb)引起的棉花枯萎病和黃萎病是棉花生產中最主要的兩種真菌病害，廣泛分布在世界各主要產棉國，并有逐年加重的趨勢。尤其是黃萎病，侵染后造成蕾鈴大量脫落，導致減產達20％-60％，且纖維的品質下降。據不完全統計，我國棉花黃萎病的發病率在300萬公頃以上，并且呈逐年加重的勢頭。目前，選育和種植抗病新品種仍是防治棉花枯萎病和黃萎病的主要措施，但由于棉花中本來就缺乏抗黃萎病的突變材料，通過常規育種的方法很難選育出高抗黃萎病的品種，迄今尚無有效的防治措施，因此，高抗品種的培育是迫在眉睫的任務。
隨著分子生物學、植物病理學和基因工程技術的迅猛發展，運用基因工程手段提高植物的抗病性，為抗病育種開辟了一條全新的途徑。天麻抗真菌蛋白GAFP是我國獨立分離和鑒定的抗真菌蛋白，是由胡忠最早在1988年從傳統中藥天麻中提取到的一種具有廣譜抗真菌活性的蛋白，也是天麻中的重要功能蛋白質。它對許多植物致病菌包括棉花枯萎病菌和黃萎病菌離體具有很強的抑制作用，在植物抗真菌基因工程上具有巨大的應用潛力。我們已經將它的基因轉入新疆彩色棉品種中，獲得了高抗黃萎病轉基因彩色棉花植株，經過選育和擴繁，轉基因彩色棉具有穩定的、較強的抗真菌病能力，證明了基因工程的方法是獲得抗病品系的一條有效的途徑。
GAFP棉花組成型高效表達載體與GAFP棉花真菌誘導型高效表達載體的載體結構圖。
發明內容
本發明的目的是將構建的GAFP基因的表達載體轉入不同的棉花優良品種，通過對轉化后代的篩選，獲得的轉基因棉花具有了抗棉花枯萎病和黃萎病的特性，經過進一步的選育，可以育成抗真菌病的轉基因棉花品系。
本發明主要包括以下七方面的技術一、GAFP棉花組成型高效表達載體的構建技術；二、GAFP棉花真菌誘導型高效表達載體的構建技術；三、GAFP表達載體花粉管通道法轉化棉花的技術；四、GAFP表達載體農桿菌介導法轉化棉花的技術；
五、轉化棉花后代的篩選技術(一)幼苗期卡那霉素或除草劑篩選；六、轉化棉花后代的篩選技術(二)病圃篩選；七、轉化棉花后代的篩選技術(三)分子檢測；具體實施方式
實施例1GAFP棉花組成型高效表達載體的構建技術棉花表達載體pBI35Sgafp-bar的構建過程為用XbaI和SacI分別酶切pBI221和pUC-gafp，將切下的.gafp片段連接到切去1.9Kb GUS片段的pBI221載體上，得到中間載體pBI35Sgafp，然后從HindIII酶切位點處連上用同樣酶切從pBI221-bar上切下的bar盒而成。含有35S啟動子、nos終止子、gafp基因、氨芐青霉素抗性基因Ampr和除草劑抗性基因bar.
另外一個載體pBin35Sgafp來自pBI35Sgafp。用HindIII和SacI酶切pBI35Sgafp切下35S-gafp片段，用同樣酶切pBI121，切去GUS片段連入35S-gafp片段而得到載體pBin35Sgafp，此載體與pBI35Sgafp-bar的差異在于兩個抗性基因為卡那霉素抗性基因Kanr和NPTII篩選標記基因，而不是Ampr和bar。表達載體詳細結構見說明書附1.。
實施例2GAFP棉花真菌誘導型高效表達載體的構建技術GAFP基因的真菌誘導型啟動子Fi由本實驗室克隆。
棉花表達載體pBIFigafp-bar的構建過程為用XbaI和SacI分別酶切pBIFi-GUS和pUC-gafp，將切下的gafp片段連接到切去1.9Kb GUS片段的pBIFi載體上，得到中間載體pBIFigafp，然后從HindIII酶切位點處連上用同樣酶切從pBI221-bar上切下的bar盒而成。含有Fi啟動子、nos終止子、gafp基因、氨芐青霉素抗性基因Ampr和除草劑抗性基因bar.
另外一個載體pBinFigafp來自pBIFigafp。用HindIII和SacI酶切pBIFigafp切下Fi-gafp片段，用同樣酶切pBI121，切去GUS片段連入Fi-gafp片段而得到載體pBinFigafp，此載體與pBIFigafp-bar的差異在于兩個抗性基因為卡那霉素抗性基因Kanr和NPTII篩選標記基因，而不是Ampr和bar。表達載體詳細結構見說明書附2.。
實施例3GAFP表達載體花粉管通道法轉化棉花的技術在開花的次日，按照每朵花0.1～0.2μg(10μl)質粒的量，采用微注射法(用微量加樣器直接將質粒注射入棉花的子房)和柱頭滴加法(將質粒滴加到柱頭上，讓其自然吸收)。收獲時，將轉化植株的棉鈴單獨采收，單獨軋花，得到種子以備后續的檢測。
實施例4GAFP表達載體農桿菌介導法轉化棉花的技術農桿菌感受態的制備●接種農桿菌LBA 4404單菌落于50ml YEB培養基(含有30μg/ml鏈霉素)中，28℃振蕩培養，轉速為200～250rpm，至OD600為0.3～0.5左右，冰浴30分鐘，5000rpm離心10分鐘，收集菌體并用10ml 0.15M NaCl懸浮。
●4℃離心(同上)，菌體懸浮于1ml 20mM CaCl2溶液中。
●取50μl菌液分裝到1.5ml離心管中，液氮迅速冷凍，并保存于-70℃冰柜中。農桿菌的凍融轉化法●取0.5～1μg DNA加入到50μl的感受態菌液中，輕輕混合，冰浴30分鐘，并在液氮中迅速冷凍1分鐘。
●在37℃水浴融化后，加入1ml YEB培養液，28℃輕輕搖動2～4小時。
●5000rpm離心，倒去大部分上清液，剩200μl培養液懸浮。
●涂布在含有30μg/ml鏈霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB固體培養基上，28℃培養。長出的菌落用堿法提取質粒，進行酶切鑒定。
農桿菌介導的轉化法●挑取GAFP表達載體的農桿菌單菌落，接種于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L鏈霉素的YEP培養基中，28℃、280rpm過夜培養至OD600為0.7～0.8。5000rpm離心，用MS液體培養基重新懸浮，與棉花愈傷組織共侵染10分鐘。
●將愈傷組織用無菌吸水紙吸干，放置于MS培養基上，暗培養2～3天后，用無菌水將外植體洗凈，轉到含有100μg/ml頭孢霉素，75μg/ml卡那霉素的分化培養基中，在12小時光照，12小時黑暗的條件下，繼續培養至分化出小芽。
●待芽長到1～2cm后，用無菌剪刀和鑷子將分化的芽剪下，插到生根培養基中，繼續培養4周左右，移栽到土壤中。
實施例5轉化棉花后代的篩選技術(一)幼苗期卡那霉素或除草劑篩選在轉化單株幼苗長出3～4片真葉時，對其進行了卡那霉素或除草劑Bastar葉片涂抹初篩實驗。除草劑Bastar和卡那霉素的濃度分別為0.1％(W/V)和1.0％(W/V)。涂抹5天后進行觀察，淘汰顯癥(葉片涂抹點變黃)單株后進行第二輪篩選，如此連續涂抹三次，選出三次不顯癥單株，進入下一步篩選。
實施例6轉化棉花后代的篩選技術(二)病圃篩選分別于蕾期(6月中下旬)、花期(7月中旬)和鈴期(8月中下旬)逐株進行三次病情調查，觀察轉化后代的抗病情況。采用成株期鑒定法，單株劃分黃萎病的病情級別，發病程度采用5級(0、1、2、3、4)分級法調查，用發病程度值的大小作為衡量抗病程度的一個指標，篩選出抗病的單株。
0級健株；1級病株葉片有25％以下表現病狀，葉片主脈間產生淡黃色或黃色不規則病斑；2級病株葉片有25％～50％表現病狀，病斑顏色大部分變成黃色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯；3級病株葉片有50％～75％表現病狀，病斑顏色大部分成黃褐色，葉片邊緣卷枯，有少數葉片凋落；4級全株葉片發病，多為褐色掌狀枯斑，以致植株死亡。
感病對照按照下列公式計算病情指數病情指數＝(∑各級病級×相應病級發病株數)/調查總株數×4×100經過病圃篩選，轉基因棉花對黃萎病與枯萎病的抗性顯著提高，有16個株系高抗黃萎病，5個兼抗枯萎病。
實施例7轉化棉花后代的篩選技術(三)分子檢測轉化棉花后代的分子檢測技術有PCR、Southern、和RT-PCR等。
采取入選棉花單株的新鮮幼嫩葉片，用CTAB法提取總DNA。
PCR檢測 對轉化棉花后代總DNA做模板，陽性對照為質粒pBI35Sgafp，陰性對照為非轉基因的棉花總DNA，以gafp基因的上下游引物5’＞ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT＜3’；和5’＞GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC CGC TGT＜來擴增，反應的總體積為20μl，程序為94℃ 3min，94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 40s，30個循環后，72℃延伸10min。反應結束后，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。如果能擴增出了特異的387bp gafp基因的條帶，則該樣品為候選的轉基因植株。
Southern雜交 取不同樣品的總DNA約10μg，用HindIII+SacI 37℃雙酶切過夜，陰性對照為非轉基因的棉花總DNA，陽性對照為未酶切和經同樣酶切的質粒pBI35Sgafp。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將核酸電轉移到尼龍膜上(BioRad公司Mini-3cells)，操作方法按照BioRad公司使用說明。同樣用α-32P-dCTP標記gafp基因為探針進行點雜交，標記方法、雜交系統和洗膜及壓片的方法參考文獻(Sambrook，1989)。雜交陽性的樣品則為正確的轉基因植株，表明gafp基因整合進了棉花基因組中。
RT-PCR檢測 為了檢測Southern陽性植株中gafp基因是否得到了表達，進一步進行RT-PCR檢測。用CTAB法提取待測樣品的總RNA，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用AccessRT-PCR試劑盒(Promega公司)進行一步法RT-PCR，操作的詳細步驟參見試劑盒說明書。使用的gafp上、下游引物的序列為上游引物5’＞ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT＜3’；下游引物5’＞GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC C6C TGT＜3’。轉基因植株擴增出了特異的387bp gafp基因的條帶，則該轉基因樣品中，gafp基因得到了正確的表達。
GAFP基因序列表(核苷酸序列和推導的成熟肽氨基酸序列)
權利要求
1.一種棉花抗黃萎病與枯萎病的表達載體，該表達載體含有天麻凝集素，即天麻抗真菌蛋白(GAFP)的基因、啟動子、終止子和篩選標記基因表達框，能在棉花中產生天麻抗真菌蛋白，導入該基因的轉基因棉花具有抗黃萎病與枯萎病的特性。
2.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于以GAFP為目的基因，該基因的表達賦予轉基因棉花抗棉花黃萎病和枯萎病的特性。
3.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于用組成型、組織特異表達或真菌誘導型啟動子啟動GAFP的表達。
4.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于用NPTII和Bar基因作為篩選標記基因，轉化株及其后代可分別用卡那霉素和除草劑Bastar來篩選。
5.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于通過花粉管通道法或者農桿菌介導法轉入彩色棉或者白棉品種，并獲得天麻抗真菌蛋白基因表達的轉基因棉花。
全文摘要
一種棉花抗黃萎病與枯萎病的表達載體，該表達載體含有天麻凝集素，即天麻抗真菌蛋白(GAFP)的基因、啟動子、終止子和篩選標記基因表達框，能在棉花中產生天麻抗真菌蛋白，導入該基因的轉基因棉花具有抗黃萎病與枯萎病的特性。
文檔編號C12N15/82GK1690210SQ200410037688
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月29日 優先權日2004年4月29日
發明者王義琴, 孫勇如, 王鵬, 張利明, 李文彬, 趙世民, 白琴華, 張小宇, 李霞 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所