專利名稱：成熟油菜種子次生休眠特性的化學檢測方法
技術領域：
本發明屬于植物生理生態技術領域，具體涉及ー種成熟油菜種子次生休眠特性的快速化學檢測方法。
背景技術：
次生休眠(secondary dormancy)特性是造成油菜種子基因擴散的重要原因。所謂次生休眠，是指原來不休眠或解除休眠后的種子由于干旱等不適宜環境條件的影響而誘發的休眠。次生休眠特性使得油菜產區地下種子庫可以持續存在，地下種子一旦條件適宜便發芽長大，成為雜草和污染源。因此，次生休眠特性是油菜生產和轉基因油菜環境安全評估的重要性狀。油菜是世界四大油料作物之一。油菜品種的次生休眠程度到底如何、遺傳多樣性怎么樣？發掘休眠性弱的品種，有利于防止基因擴散；選擇休眠性強的品種，有利于防止收獲前發芽；探明油菜次生休眠發生的原因與規律，有利于找到改變油菜休眠特性的方法。對油菜種子次生休眠特性的檢測與篩選是開展上述研究工作的必要前提。我國對油菜種子次生休眠特性的研究比較薄弱，相關的檢測方法更是缺乏報道。在國外，測定種子次生休眠特性的方法通常采用PEG化學誘導法(Gulden. A ThesisSubmitted to the College of Graduate Studies and Research in Partial Fulfilmentof the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in the Department ofPlant Sciences University of Saskatchewan Saskatoon. 2003)。其不足之處在于實驗周期很長，完成一次完整的次生休眠檢測需要45-50天。在我國，油菜從田間收獲脫粒至秋播僅間隔60天左右，如果采用上述檢測方法，科研人員在油菜種子收獲后幾乎沒有剩余時間開展其他研究工作。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供成熟油菜種子次生休眠特性的快速化學檢測方法。本發明提供的方案是采用兩步法快速檢測油菜種子的次生休眠特性。第一步是用滲透勢為-17. 5 bar的PEG6000溶液在溫度25° C、黑暗條件下浸泡種子7天誘導次生休眠；第二步是檢測種子發芽率和生活力，具有生活力但不能發芽的種子判斷為休眠種子。所述的方法包括以下步驟(I)誘導休眠用滲透勢為-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導次生休眠，即取100粒成熟油菜種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養皿中，注入9ml -17. 5bar的PEG6000溶液浸泡，同時做4 8組平行樣。將培養皿裝入ー個箱子，25。C黑暗保存，誘導次生休眠；(2)檢測休眠率步驟(I)完成后在500 - 600 nm緑色安全光照下將種子清洗后轉移到裝有9ml去離子水的培養皿中，繼續在25° C黑暗條件下保存，非休眠種子將發芽；在500 - 600 nm緑色安全光照下剔除發芽的種子。所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時間12 h /12 h)處理，如果能夠發芽，則屬于次生休眠種子實驗對照以不經次生休眠處理(用9ml水代替PEG6000)的發芽結果為對照。所述步驟(I)中PEG6000溶液在25 ° C條件下配置，滲透勢為-I. 75Mpa(-17. 5bar)。所述步驟(I)中25° C黑暗保存7天。所述步驟(2)中25° C黑暗條件下保存7天；交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度 3/30。C，時間 12 h /12 h)處理 3 天。所用的油菜種子為成熟油菜的干種子。本發明與現有技術相比，其有益效果是實驗周期大大縮短，完成全部檢測工作僅需17天；實驗結果準確、重復性好。通過本發明，已篩選出次生休眠性具有顯著差異的油菜品種，為進一歩掲示油菜次生休眠發生機制提供了重要的技術支持，同時也可為其他植物種子次生休眠特性的檢測提供技術參考。
圖I為次生休眠性特強品種，經PEG誘導后加水，只有少量的種子發芽(為非休眠種子)，剰余的大部分種子未發芽(為休眠種子)，次生休眠率達80%左右；
圖2為次生休眠性特弱品種，經PEG誘導后加水，只有極少數種子未發芽(為休眠種子)，次生休眠率低于3% ；
圖3為次生休眠性特強品種(作父本)與次生休眠性特弱品種(作母本)的雜交后代，經PEG誘導后加水大部分種子未發芽(為休眠種子)，次生休眠率達70%左右；
圖4為次生休眠性特強品種(作母本)與次生休眠性特弱品種(作父本)的雜交后代，經PEG誘導后加水大量種子發芽(為非休眠種子)，次生休眠率僅5%左右。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的作進ー步說明。實施例I :中國油菜品種次生休眠特性的遺傳多祥性
以江蘇、湖北、安徽、陜西等我國主要的冬油菜產區的85個甘藍型普通油菜品種(其中36個為常規品種，其余為雜交品種，且均為當地主栽品種)的成熟種子為材料，考察我國油菜品種次生休眠特性的遺傳多祥性。(I)誘導休眠用滲透勢為-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導次生休眠每個品種取100粒種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養皿中，注入9ml-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液浸泡；每個品種同時做4 8組平行樣；將培養皿裝入ー個箱子，25° C避光保存7天，誘導次生休眠。(2)檢測休眠率完成后在500 - 600 nm緑色安全光照下將種子轉移裝有9ml去離子水的培養皿中，繼續在25° C黑暗條件下保持7天，非休眠種子將發芽；在500 - 600 nm緑色安全光照下剔除發芽的種子；所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時間12 h /12 h)處理3天，如果能夠發芽，則屬于次生休眠種子。
實驗對照以不經次生休眠處理(用9ml水代替PEG6000)的發芽結果為對照。結論我國油菜品種間次生休眠性特差異極為顯著，次生休眠性特強品種的次生休眠率達80%左右，次生休眠性特弱品種的次生休眠率則低于3%。如附圖I所示次生休眠性特強品種，經PEG誘導后加水，只有少量的種子發芽(為非休眠種子)，剰余的大部分種子未發芽(為休眠種子)，次生休眠率達80%左右；圖2所示為次生休眠性特弱品種，經PEG誘導后加水，只有極少數種子未發芽(為休眠種子)，次生休眠率低于3%。實施例2 :次生休眠性特強、特弱品種雜交后代的次生休眠特性
選取次生休眠性特強品種和次生休眠性特弱品種作親本，分別配置正反交組合，檢測 次生休眠差異品種雜交后代成熟種子的休眠特性表現。(I)誘導休眠用滲透勢為-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導次生休眠每個雜交后代取100粒成熟種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養皿中，注入9ml -I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液浸泡，每個雜交后代同時做4 8組平行樣；將培養皿裝入ー個箱子，25° C避光保存I天，誘導次生休眠。(2)檢測休眠率完成后在500 - 600 nm綠色安全光照下將種子轉移裝有9ml去離子水的培養皿中，繼續在25° C黑暗條件下保持7天，非休眠種子將發芽。在500 - 600nm緑色安全光照下剔除發芽的種子。所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時間12 h /12 h)處理3天，如果能夠發芽，則屬于次生休眠種子。實驗對照以不經次生休眠處理(用9ml水代替PEG6000)的發芽結果為對照。結論次生休眠性特強品種(作父本)與次生休眠性特弱品種(作母本)的雜交后代，次生休眠率達70%左右；次生休眠性特強品種(作母本)與次生休眠性特弱品種(作父本)的雜交后代，次生休眠率僅5%左右。如附圖3所示為次生休眠性特強品種(作父本)與次生休眠性特弱品種(作母本)的雜交后代，經PEG誘導后加水大部分種子未發芽(為休眠種子)，次生休眠率達70%左右；圖4為次生休眠性特強品種(作母本)與次生休眠性特弱品種(作父本)的雜交后代，經PEG誘導后加水大量種子發芽(為非休眠種子)，次生休眠率僅5%左右。
權利要求
1.成熟油菜種子次生休眠特性的化學檢測方法，所述的方法包括以下步驟 (1)誘導休眠用滲透勢為-I.75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導次生休眠，即取100粒成熟油菜種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養皿中，注入9ml -17. 5bar的PEG6000溶液浸泡7天，同時做4 8組平行樣；將培養皿裝入ー個箱子，25° C黑暗保存，誘導次生休眠； (2)檢測休眠率完成后在500 600nm綠色安全光照下將種子轉移到裝有9ml去離子水的培養皿中，繼續在25° C黑暗條件下保存7天，非休眠種子將發芽；500 - 600 nm綠色安全光照下剔除發芽的種子；所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時間12 h /12 h)處理3天，如果能夠發芽，則屬于次生休眠種子。
2.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(I)中PEG6000溶液在25°C條件下配置，滲透勢為-I. 75Mpa (-17. 5bar)0
3.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(I)中25°C黑暗保存7天。
4.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(2)中25°C黑暗條件下保存7天；交替的光照和溫度(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時間12 h /12 h)條件下處理3天。
全文摘要
本發明公開一種成熟油菜種子次生休眠特性的化學檢測方法，所述的方法包括以下步驟第一步是用滲透勢為-17.5bar的PEG6000溶液在溫度25°C、黑暗條件下浸泡種子7天誘導次生休眠；第二步是檢測種子發芽率和生活力，具有生活力但不能發芽的種子判斷為休眠種子。本發明完成一次完整的次生休眠檢測僅17天，且獲得的實驗結果準確、重復性好，從而解決了油菜次生休眠化學檢測周期較長的難題，為進一步揭示油菜次生休眠的發生機制提供了重要的技術支持，同時也可為其他植物種子次生休眠檢測提供技術參考。
文檔編號A01C1/02GK102612893SQ20121010803
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者劉福霞, 盧長明, 唐瑭, 王興龍, 趙祥強, 趙祥祥 申請人:淮陰師范學院