專利名稱：成熟油菜次生休眠種子rna的提取方法
技術領域：
本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及成熟油菜次生休眠種子高質量RNA的快速提取。
背景技術：
RNA提取技術不僅是分子生物學的基本實驗技術，也是進行分子生物學研究的必要前提。只有分離得到純度高、完整性好的高質量總RNA，才能用于RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、純化mRNA以用于蛋白質體外翻譯或構建cDNA文庫，以及mRNA差異顯示、高通量轉錄組測序等后續的分子生物學研究。油菜種子屬脂肪質種子，含有大量的脂質、蛋白質、多糖、維生素和多酚等物質，嚴重影響了 RNA的提取。因此油菜種子總RNA的提取比較困難，常規的Trizol Reagent Kit、異硫氰酸胍一步法等已報道的植物組織總RNA提取方法都不適用于油菜種子。目前已有不完全成熟或新鮮的油菜種子RNA提取成功的報道，如華中農業大學的CTAB法(丁勇等.華中農業大學學報.2006,25(5) :465-468)、湖南農業大學選用TIANGEN公司裂解液RL并加以優化的方法(嚴明理等.生物技術通報.2007，6:97-100)等。然而，我們將上述方法應用于成熟油菜次生休眠(secondary dormancy)種子RNA的提取，在嚴格控制實驗條件情況下卻未能獲得穩定可靠的提取結果。油菜種子具有顯著的次生休眠特性(所謂次生休眠，是指原來不休眠或解除休眠后的種子由于干旱等不適宜環境條件的影響而誘發的休眠)，明確油菜種子次生休眠的分子機制，可以為人工調控油菜種子休眠特性提供理論依據。而高質量地提取成熟油菜次生休眠種子的RNA則是研究種子休眠分子機制的重要前提。抑制內源RNA酶的活性、防止RNA降解是RNA提取的關鍵技術，特別是在成熟的油菜次生休眠種子RNA提取過程中。因為成熟的油菜種子老健組織部分富含RNA酶，加之種子進入休眠狀態后，生理活性大大降低，使得油菜種子RNA的分離效果和完整性都難以保障。而采用已有的新鮮油菜種子或不完全成熟油菜種子RNA提取方法，則存在著試劑消耗量大、提取時間長(1-8. 5小時)等缺點，尤其是提取時間過長直接增加了 RNA受污染而降解的可能性，并最終導致提取失敗。因此，縮短提取時間、抑制內源RNA酶活性、減少與防止RNA降解是成熟油菜次生休眠種子RNA提取的最為核心技術。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供成熟油菜次生休眠種子高質量RNA的快速提取方法。本發明提供的方案是選用RNA plant plus reagent植物總RNA提取試劑，通過β -巰基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚類物質氧化，應用醋酸鈉去除多糖類物質對RNA的影響，并減少抽提次數。按照本方法，完成次生休眠油菜種子RNA的提取僅需30分鐘左右，且RNA質量好、純度高。所述步驟包括
(I)取O. Ig成熟的油菜次生休眠種子放入加有液氮的研缽中，迅速磨成粉末；(2)將步驟(I)制得的粉末加 入含有RNAplant plus植物總RNA提取試劑的離心管，振蕩至徹底混勻。室溫平放離心管靜置，再加入預冷的苯酚-氯仿-異戊醇(25 241)混勻，4。。13000rpm 離心 4_5min ；
(3)將步驟(2)制得的上清液轉移至新離心管中，加入預冷的醋酸鈉和無水乙醇，倒轉2-3次混勻后冰上靜置，4°C 13000rpm離心4min，棄上清，乙醇洗沉淀，室溫下干燥，用RNase-free ddH20溶解沉淀即得。優選的，所述步驟(2)中每百毫克油菜種子粉末中加入RNA plant plus reagent(TIANGEN公司生產，使用前按照體積比I :4加入β -巰基乙醇與RNAplant plus reagent混合)800μ1。優選的，所述的步驟(2)中苯酚-氯仿-異戊醇用量為500 μ I。優選的，所述的步驟(2)和步驟(3)中的靜置時間為5 min。優選的，所述的步驟(3)中醋酸鈉濃度為3mol/L、pH值為5. 2，用量為70μ1。優選的，所述的步驟(3)中無水乙醇用量為1400μ1。優選的，所述的步驟(3)中的乙醇洗沉淀為75%乙醇洗滌，洗滌次數為2次。本發明與現有技術相比，其有益效果是現有技術雖然可以提取不完全成熟或新鮮油菜種子的RNA，但卻不能成功應用于成熟的油菜次生休眠種子RNA的提取，且試劑消耗量大、提取時間長，直接增加了 RNA被降解的可能性。本發明提供的成熟油菜次生休眠種子RNA提取方法，不僅具有新穎性的要求，還具有提取過程省時便捷、提取結果穩定可靠的實用性。因此，本發明為成熟油菜次生休眠種子高質量RNA的快速提取提供了有效方法，同時也為后續的分子生物學研究提供了重要的技術支持。
圖I為應用本發明提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子);
圖2為應用前人方法提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子);
圖 3 為 Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer 文庫質檢圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明
實施例成熟油菜次生休眠種子總RNA提取及其標準mRNA文庫構建 I ·油菜次生休眠種子總RNA提取
(1)取O.Ig成熟的油菜次生休眠種子放入加有液氮的研缽中，迅速研磨成粉末；
(2)將步驟(I)制得的粉末加入含有800μ1RNA plant plus植物總RNA提取試劑(使用前按照體積比I :4加入β -巰基乙醇與RNAplant plus reagent混合)的離心管,潤旋振蕩至徹底混勻。室溫下平放離心管靜置5 min，再加入500μ1預冷的苯酚-氯仿-異戊醇(25 :24 :1)混勻，4°C 13000rp m 離心 5min,取上清液；
(3)將步驟(2)制得的上清液轉移至一新離心管中，加70μ1的3mol/L的醋酸鈉和1400μ1的無水乙醇，倒轉2-3次混勻后冰上放置3_5min，4°C 13000rpm離心4min，棄上清，75%乙醇洗沉淀2次，室溫下干燥，用RNase-free ddH20溶解沉淀即得，質檢后放置_70°C冰箱備用。質量檢測應 用本方法，得到成熟油菜次生休眠種子RNA150微克，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，RNA完整性好，260/280為2. 05，完全滿足后續的分子生物學研究需要(附圖I)。而使用前人方法提取休眠種子RNA的質量極不穩定，降解較為嚴重(附圖2)。圖I所示為應用本發明提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子；圖2所示為應用前人方法提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1、2、3、4為成熟的油菜次生休眠種子。II .從總RNA中提取mRNA及mRNA的打斷
Cl)決定起始總RNA的量，取O. l-4ug的起始總RNA。用移液槍吸取總RNA到一個無RNA酶的200ul PCR管中，加入RNase free的無菌水補足至50ul。(2)加入 50ul RNA Purification Beads (純化珠)，混勻。(3) 65° C 反應 5min，使 RNA 變性。(4) PCR儀溫度降到4° C后，取出，室溫放置5min。(5)將EP管置于磁力架上靜置5min，吸棄上清。(6)將EP管從磁力架上取下，加入200ul BffB (磁珠洗滌緩沖液)，混勻，置于磁力架上靜置5min,棄上清。(7)從磁力架上取下，加入50ul EB (溴化乙錠)，混勻。(8)80° C反應2min，待溫度降到25° C后，取出置于室溫。(9)加入50ul BBB (磁珠結合緩沖液)，混勻，室溫靜置5min。(10)將EP管置于磁力架上靜置5min，吸棄上清。(11)將EP管從磁力架上取下，加入200ul BffB (磁珠洗滌緩沖液)，混勻，置于磁力架上靜置5 min,棄上清。(12)加入 19.5ul Elute (洗脫液)，Prime (引物)，Fragment Mix(片段混合液),混勻。(13)94° C反應8 min將RNA打斷，待溫度降到4° C后，取出。III.反轉錄反應
(1)第一鏈的合成
將上述溶液置于磁力架上5 min，吸取17 ul上清于新的200 ul PCR管中，加入IulSuperScript II (逆轉錄酶)及 7ul First Strand Master Mix (第一鏈合成混合溶液)，混勻。按照以下程序第一鏈的合成
25° C IOmin
42° C 50min 70° C 15min 4° C hold(保溫)
(2)第二鏈的合成
向第一鏈混合液中加入25 ul Second Strand Master Mix (第二鏈合成混合溶液)，混勻。16° C恒溫孵育Ih。(3)使用AMPure XP beads (磁珠純化法)純化向50ul ds cDNA中加 入90ul AMPure XP beads (磁珠純化試劑)，混勻。室溫靜置15min，置于磁力架上，室溫5min。吸除上清。加入200ul 80%乙醇，室溫30s后吸除上清。重復上一步驟。將EP管室溫靜置15min以晾干，加入52. 5ul Resuspension Buffer (重懸液)，混勻。室溫2min后，置于磁力架上靜置5min。吸出50min上清于新的200ulPCR管中。IV .末端修復
(I)配置 End Repair Control (末端修復質控)溶液向"ul ResuspensionBuffer (重懸緩沖液)中加入Iul End Repair Control (末端修復質控)溶液,并混勻。(2)向50ul ds cDNA中加入IOul上述配好的溶液。(3)向其中加入40 ul End Repair Mix (末端修復混合溶液)，并混勻
(4)恒溫30° C孵育30min后取出。(5)使用AMPure XP beads (磁珠純化法)純化。V . 3’末端腺苷酸化
(1)制備A-Tailing Control (末端腺苷酸質控)稀釋液1 μ I A -Tailing Control+ 99 μ I Resuspension Buffer (重懸緩沖液)；
(2)加2. 5 μ I 稀釋的 A - Tailing Control，充分混勻；
(3)加12.5 μ I A - Tailing Mix (末端腺苷酸混合液)；
(4)37° C 反應 30 min ；
(5)立即進行Adapters(接頭)連接反應。VI .連接 Adapters (接頭)
(1)制備LigaseControl (連接酶質控)稀釋液I μ I Ligase Control (連接酶質控)+ " μ I Resuspension Buffer (重懸緩沖液)；
(2)依次加入2.5 μ I Ligase Control (連接酶質控)稀釋液,2. 5 μ I Ligase Mix (連接反應混合液)，2. 5 μ I Adapter Index,充分混勻；
(3)30 ° C 反應 10 min ；
(4)加5μ Stop Ligase Mix (終止連接反應混合液)，充分混勻；
(5)AMPure XP Beads純化兩次，吸上清，-20° C保存。VD.DNA片段的富集
(1)分別加入5μ Primer Cocktail (引物混合物)和25 μ I Master Mix(預混合液)，充分混勻；
(2)設置如下PCR程序
a.98。 C for 30 秒
b.15 cycles of (循環次數 15 次)
98。 C for 10 秒
60。 C for 30 秒 72。 C for 30 秒
c.72° C for 5 分鐘
d.4° C保溫
(3)AMPure XP beads 純化，吸上清，-20° C 保存。質量檢測經Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer(安捷倫科技公司 2100自動生物分析系統)檢測，文 庫質檢合格，如圖3，說明本發明提取的RNA能滿足高通量轉錄組測序的樣品要求。
權利要求
1.成熟油菜次生休眠種子RNA的提取方法,選用RNAplant plus reagent植物總RNA提取試劑，通過β -巰基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚類物質氧化，應用醋酸鈉去除多糖類物質對RNA的影響，并減少抽提次數，縮短提取時間，其步驟包括 (1)取O.Ig成熟的油菜次生休眠種子放入加有液氮的研缽中，迅速磨成粉末； (2)將步驟(I)制得的粉末加入含有RNAplant plus植物總RNA提取試劑的離心管，渦旋振蕩至徹底混勻；室溫靜置，再加入預冷的苯酚-氯仿-異戊醇(25 24 1)混勻，4°C 13000rpm離心5min,取上清液； (3)將步驟(2)制得的上清液轉移至一新離心管中，加入醋酸鈉和無水乙醇，倒轉2-3次混勻后冰上靜置，4°C 13000rpm離心4min，棄上清，乙醇洗沉淀，室溫下干燥，用RNase-free ddH20溶解沉淀即得。
2.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(2)中每百毫克油菜種子粉末中加入RNAplant plus reagent提取試劑(TIANGEN公司生產,使用前按照體積比I :4加入β-巰基乙醇與 RNAplant plus reagent 混合)700_1000μ1。
3.根據權利要求I所述的方法，所述的步驟(2)中苯酚-氯仿-異戊醇(2524 :1)用量為 400-600μ1。
4.根據權利要求I所述的方法，所述的步驟(2)和步驟(3)中的靜置時間為3-5min0
5.根據權利要求I所述的方法，所述的步驟(3)中醋酸鈉濃度為3mol/L、pH值為5.2，用量為60-80μ1。
6.根據權利要求I所述的方法,所述的步驟(3)中無水乙醇用量為1300-1500μ1。
7.根據權利要求I所述的方法，所述的步驟(3)中的乙醇洗沉淀為75%乙醇洗滌，洗滌次數為1-2次。
全文摘要
本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及成熟油菜次生休眠種子高質量RNA的快速提取方法。所述的方法選用RNAplantplusreagent植物總RNA提取試劑，通過β-巰基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚類物質氧化，應用醋酸鈉去除多糖類物質對RNA的影響，并減少抽提次數。使用本發明方法完成油菜次生休眠種子RNA的提取僅需30分鐘，且RNA質量好、純度高，并具有試劑用量少、經濟節約等優點，已成功應用于后續的mRNA分離、純化、建庫以及高通量轉錄組測序。本發明為探明油菜種子次生休眠的分子機制提供了重要的技術保障，同時也可為其他多糖、多酚類植物的成熟休眠種子RNA提取提供技術參考。
文檔編號C12N15/10GK102634511SQ201210135479
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年4月13日
發明者劉福霞, 盧長明, 唐瑭, 王興龍, 趙祥強, 趙祥祥 申請人:淮陰師范學院