專利名稱：培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法
技術領域：
本發明涉及一種長春花的培養方法，特別是公開一種培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
長春花(Catharanthusroseus)是夾竹桃科(Apocynaceae)植物，它含有 100多種吲哚生物堿，多數具有生物活性。由長春花提取或半合成的生物堿包括硫酸長春堿(vinblastine)、硫酸長春新堿(vincristine)、硫酸長春地辛(長春酰胺，Vindestine,VDS)、酒石酸長春瑞濱(Vinrelbine, VNB),是目前臨床應用最廣的天然植物抗腫瘤藥物，現還有兩個長春堿類似物(脫水長春堿anhydrovinblastine和20, 20’ - 二氟長春瑞賓，vinflunine)正在進行臨床研究。長春花的研究開發也是目前最具潛力也是最為活躍的領域之一。長春堿和長春新堿在植物體中的含量極其微小，大約為十萬分之一，化學合成也不太理想。所以長春堿和長春新堿長期供應緊張。醫藥工業用長春花目前主要來源于野生資源，在中國主要分布在海南、廣東雷州半島等地，而在長江流域，包括上海，僅有少量人工栽培，供園林觀賞，且只限于夏季栽培收獲，在鹽堿灘涂更是生長緩慢、個小，在深秋基本停止生長、在冬季完全枯萎死亡。
發明內容
本發明的目的克服現有技術中存在的問題，利用植物快速繁殖和誘導技術，提供一種培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，實現長春花在長江流域、特別是利用鹽堿灘涂，大面積的人工栽培。本發明是這樣實現的一種培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，其特征在于包括如下步驟
I、分別制備長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基取MS基本培養基，以每升加入和6 8克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入O. I O. 3克萘乙酸、2 4克6-芐氨基嘌呤、O. 2 O. 4克秋水仙素和6 8克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入1(Γ20克氯化鈉和6 8克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。2、長春花無菌苗的制備以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為O. 2%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25+l°C,光照為100 μ mo I · m 2 · s 1條件下,經4周培養后，得無菌苗。3、耐鹽耐低溫長春花株系的誘導將步驟2所得無菌苗作為種源，接種于誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為IOOymol ·πΓ2 ^1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+1 °C、光照為100 μ mo I · m_2 · s—1 ;隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物喊。 將步驟I中所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別調節PH值至5. 8后，高壓滅菌。將步驟I中所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基、用HCl或NaOH或兩者結合調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的PH值至5. 8后，分別高壓滅菌，并將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于玻璃三角瓶中。所述玻璃三角瓶的容積為O. I升，所述玻璃三角瓶中長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的體積分別占的玻璃三角瓶25%。本發明的有益效果是本發明方法實現了耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖培育，且培育的耐鹽耐低溫長春花株系與野生長春花有效成分含量相當，滿足醫藥領域臨床應用的需求。本發明培育過程全程可控，不受自然環境影響，耐鹽耐低溫長春花株系可以在鹽堿灘涂正常生長，延長了長春花在長江流域的生長期、增加了長春花的生物量。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述。實施例I :
本實施例包括如下步驟
I)長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備取MS基本培養基，以每升加入和6克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入O. I克萘乙酸、3克6-芐氨基嘌呤、O. 2克秋水仙素和6克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入10克氯化鈉和6克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。生長培養基調pH值用pH計測定固體生長培養基、液體生長培養基pH值，并用HCl和NaOH分別調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于容積為O. I升的三角瓶中，每瓶裝O. 025升生長培養基，即生長培養基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1.2Kg/cm2，時間為20分鐘，備用。2)長春花無菌苗的制備
以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為O. 1%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25°C下、光照為ΙΟΟμπιοΙ · πΓ2 · s4,經4周培養后,得長春花無菌苗。3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導及長春堿的制備
將步驟2所得無菌苗作為種源，誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐鹽耐低溫長春花植株，隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿。實施例2:
本實施例包括如下步驟。1)長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備取MS基本培養基，以每升加入和6. 5克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入O. 15克萘乙酸、2克6-芐氨基嘌呤、O. 3克秋水仙素和6. 5克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入15克氯化鈉和6. 5克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。生長培養基調pH值用pH計測定固體生長培養基、液體生長培養基pH值，并用HCl和NaOH分別調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于容積為O. I升的三角瓶中，每瓶裝O. 025升生長培養基，即生長培養基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1.2Kg/cm2，時間為20分鐘，備用。2)長春花無菌苗的制備
以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為O. 1%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25°C下、光照為100 μ mol · πΓ2 · s4,經4周培養后,得長春花無菌苗。3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導及長春堿的制備
將步驟2所得無菌苗作為種源，誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐鹽耐低溫長春花植株，隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿。實施例3
本實施例包括如下步驟。1)分別制備長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基取MS基本培養基，以每升加入和7克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0. 2克萘乙酸、3. 5克6-芐氨基嘌呤、0. 3克秋水仙素和7克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入15克氯化鈉和7克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。生長培養基調pH值用pH計測定固體生長培養基、液體生長培養基pH值，并用HCl和NaOH分別調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于容積為0. I升的三角瓶中，每瓶裝0. 025升生長培養基，即生長培養基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1.2Kg/cm2，時間為20分鐘，備用。2)長春花無菌苗的制備
以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為O. 1%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25°C下、光照為100 μ mol · πΓ2 · s4,經4周培養后,得長春花無菌苗。3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導及長春堿的制備
將步驟2所得無菌苗作為種源，誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐鹽耐低溫長春花植株，隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿。實施例4
本實施例包括如下步驟。I)長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備取MS基本培養基，以每升加入和7. 5克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0. 25克萘乙酸、4克6-芐氨基嘌呤、0. 35克秋水仙素和7. 5克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入18克氯化鈉和6克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。生長培養基調pH值用pH計測定固體生長培養基、液體生長培養基pH值，并用HCl和NaOH分別調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于容積為0. I升的三角瓶中，每瓶裝0. 025升生長培養基，即生長培養基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1.2Kg/cm2，時間為20分鐘，備用。2)長春花無菌苗的制備
以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為0. 1%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25°C下、光照為100 μ mol · πΓ2 · s4,經4周培養后,得長春花無菌苗。3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導及長春堿的制備
將步驟2所得無菌苗作為種源，誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐鹽耐低溫長春花植株，隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿。實施例5
本實施例包括如下步驟。I)長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備取MS基本培養基，以每升加入和8克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0. 3克萘乙酸、3. 5克6-芐氨基嘌呤、0. 4克秋水仙素和8克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入20克氯化鈉和8克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。生長培養基調pH值用pH計測定固體生長培養基、液體生長培養基pH值，并用HCl和NaOH分別調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于容積為O. I升的三角瓶中，每瓶裝O. 025升生長培養基，即生長培養基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1.2Kg/cm2，時間為20分鐘，備用。 2)長春花無菌苗的制備
以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為O. 1%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25°C下、光照為100 μ mol · πΓ2 · s4,經4周培養后,得長春花無菌苗。3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導及長春堿的制備
將步驟2所得無菌苗作為種源，誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐鹽耐低溫長春花植株，隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿。實施例6
本實施例包括如下步驟。I)長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備取MS基本培養基，以每升加入和7. 8克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0. 25克萘乙酸、3. 5克6-芐氨基嘌呤、0. 35克秋水仙素和7. 5克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入15克氯化鈉和7. 5克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。生長培養基調pH值用pH計測定固體生長培養基、液體生長培養基pH值，并用HCl和NaOH分別調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于容積為0. I升的三角瓶中，每瓶裝0. 025升生長培養基，即生長培養基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1.2Kg/cm2，時間為20分鐘，備用。2)長春花無菌苗的制備
以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為
0.1%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25°C下、光照為100 μ mol · πΓ2 · s4,經4周培養后,得長春花無菌苗。3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導及長春堿的制備
將步驟2所得無菌苗作為種源，誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐鹽耐低溫長春花植株，隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿。
權利要求
1.一種培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，其特征在于包括如下步驟 1)分別制備長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基取MS基本培養基，以每升加入和6 8克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入O. I O. 3克萘乙酸、2 4克6-芐氨基嘌呤、O. 2 O. 4克秋水仙素和6 8克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入1(Γ20克氯化鈉和6 8克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用； 2)長春花無菌苗的制備以長春花種子為外植體，將其用濃度為70%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為O. 2%的氯化汞水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25+l°C,光照為100 μ mo I · nf2 · s_1條件下,經4周培養后,得無菌苗； 3)耐鹽耐低溫長春花株系的誘導將步驟2所得無菌苗作為種源，接種于誘導生長培養基中擴增及誘導，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 μ—1，培養40天，得誘導長春花分化苗；將所誘導長春花分化苗在所述耐鹽耐低溫篩選培養基中接種，繼續培養40天，培養條件為溫度25+l°C、光照為ΙΟΟμπιοΙ · m_2 · s—1 ;隨后從所得耐鹽耐低溫植株中提取獲得生物堿； 將步驟I中所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別調節pH值至5. 8后，高壓滅菌； 將步驟I中所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基、用HCl或NaOH或兩者結合調節長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的PH值至5. 8后，分別高壓滅菌，并將長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基分別分裝于玻璃三角瓶中。
2.根據權利要求I所述的培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述玻璃三角瓶的容積為0. I升，所述玻璃三角瓶中長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的體積分別占的玻璃三角瓶25%。
3.根據權利要求I或2所述的培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備方法取MS基本培養基，以每升加入和6克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0. I克萘乙酸、3克6-芐氨基嘌呤、0. 2克秋水仙素和6克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入10克氯化鈉和6克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。
4.根據權利要求I或2所述的培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備方法取MS基本培養基，以每升加入和7克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0. 2克萘乙酸、3. 5克6-芐氨基嘌呤、0. 3克秋水仙素和7克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入15克氯化鈉和7克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用。
5.根據權利要求I或2所述的培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基的制備方法取MS基本培養基，以每升加入和8克瓊脂粉得長春花生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入O. 3克萘乙酸、3. 5克6-芐氨基嘌呤、O. 4克秋水仙素和8克瓊脂粉為單位，得誘導生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入20克氯化鈉和8克瓊脂粉為單位，得耐鹽耐低溫篩選培養基備用
全文摘要
本發明為一種培育耐鹽耐低溫長春花株系快速繁殖的方法。本發明以制備長春花生長培養基、誘導生長培養基和耐鹽耐低溫篩選培養基為基礎，并以野生長春花葉片為原始材料誘導出無菌苗，經過無菌苗快速繁殖及多代誘導馴化，建立了適合耐鹽耐低溫長春花株系培育系統，耐鹽耐低溫長春花株系的生物堿含量比野生長春花要高20%左右。本發明的優點是(一)培育過程完全可控，不受自然環境的影響；(二)耐鹽耐低溫長春花可在鹽堿灘涂正常生長；(三)延長了長春花在長江流域的生長期、增加了長春花的生物量。
文檔編號A01H4/00GK102613088SQ20121011899
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者倪新忠, 倪迪安 申請人:上海安體康生植物化學有限公司